Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches
Summary
Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser verre avec des taches de protéines nanométriques entourées par une bicouche lipidique fluide. Ces substrats sont compatibles avec la microscopie optique de pointe et devraient servir de plate-forme pour les études d'adhésion cellulaire et la migration.
Abstract
À l'heure actuelle, il y a un intérêt considérable dans la création de réseaux ordonnés d'îlots de protéines adhésives dans une mer de surface passivée pour les études biologiques cellulaires. Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus clair que les cellules vivantes répondent, non seulement à la nature biochimique des molécules qui leur sont présentées, mais aussi à la façon dont ces molécules sont présentées. Création de micro-motifs de protéines est donc maintenant la norme dans de nombreux laboratoires de biologie; nano-modèles sont également plus accessibles. Cependant, dans le contexte des interactions cellule-cellule, il est nécessaire de modèle non seulement des protéines, mais aussi des bicouches lipidiques. Un tel double patterning proteo-est jusqu'à présent lipidique pas été facilement accessible. Nous vous proposons une technique facile pour créer des protéines nano-points pris en charge sur le verre et de proposer une méthode pour remblayer l'espace inter-points avec une bicouche lipidique pris en charge (SLB). De photo-blanchiment de lipides fluorescents traceur inclus dans le SLB, nous démontrons que la double couche présente beaucoup en plane fluidité. Fonctionnaliser les points de protéines avec des groupes fluorescents permet d'imager eux et de montrer qu'ils sont ordonnés dans un réseau hexagonal régulier. La taille de point typique est d'environ 800 nm et l'espacement montré ici est de 2 microns. Ces substrats sont censés servir de plates-formes utiles pour l'adhésion cellulaire, la migration et les études mécano-détection.
Introduction
L'adhésion cellulaire a lieu par l'intermédiaire des molécules d'adhésion de cellules spécialisées (CAMs), des protéines présentes sur la membrane cellulaire qui sont capables de se lier à leur homologue sur la matrice extra-cellulaire ou sur une autre cellule. Sur les cellules adhérées, la plupart des molécules d'adhésion , y compris l'intégrine ubiquitaire et cadhérine, se trouvent sous la forme de groupes 1. L'interaction des lymphocytes T (cellules T) avec des cellules présentant l'antigène (APC) fournit une illustration particulièrement frappante de l'importance des amas de récepteurs formés à l'interface entre les deux cellules – souvent appelé une synapse immunologique. Lors de la formation du premier contact avec les APC, les récepteurs des cellules T (TCR) sur la surface de la forme de cellules T microns grappes d'échelle qui servent de plates – formes de signalisation 2, 3, 4, et sont finalement centralisé pour former un cluster supramoléculaire centrale plus grande (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Récemment, il a été montré que, du côté APC, les ligands de TCR sont également regroupés 8.
Dans le contexte de l' interaction des cellules T-APC, le déploiement de systèmes hybrides, où l'APC est imitée par une surface artificielle fonctionnalisés avec des protéines pertinentes, a considérablement fait progresser notre compréhension de l'interface synaptique 2, 3, 4, 5, 6, 7 . Dans ce contexte, il est très utile pour concevoir des surfaces APC mimétiques qui capturent un ou plusieurs aspects de la cellule cible. Par exemple, si les ligands sont greffés sur bicouches lipidiques pris en charge, ils peuvent diffuser dans le plan de la double couche, imiter la situation sur la surface APC et en même temps permettre la formation ducSMAC 6, 7. De même, les clusters sur l'APC ont été mimé par la création d' îlots de ligands dans une mer de polymères 9, 10, 11, 12, 13, 14. Cependant, ces deux caractéristiques ont jusqu'à présent pas été combinées.
Nous décrivons ici une nouvelle technique pour créer des nano-points de l'anti-CD3 (un anticorps qui cible le complexe TCR) entouré par une bicouche lipidique avec des lipides diffusants. La bicouche est déposé à l' aide de Langmuir-Blodgett / technique de Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 et , si on le souhaite, peut être fonctionnalisé avec une protéine spécifique – par exemple, le ligand de l'intégrine de la cellule T (appelé ICAM – 1). De plus, les points de protéine anti-CD3 COUld être remplacé par un autre anticorps ou CAM. Alors que nous avons choisi les protéines pour une utilisation future en tant que plate-forme pour les études d'adhésion des cellules T, la stratégie ici détaillée peut être adaptée pour toute protéine et même l'ADN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques dans le protocole décrit ci-dessus sont liées à la formation des points de nano-protéines ou de l'arrière-remplissage de l'espace autour des points par une bicouche lipidique supportée. La première étape critique par rapport à des points de nano-protéine est la préparation du bourrelet masque. Le nettoyage du couvercle de glissière est critique. Les lames doivent être soit nettoyée avec une solution de détergent qui est recommandé pour le nettoyage des cuvettes en quartz, ou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Laurent Limozin, Pierre Dillard et Astrid Wahl pour poursuivre des discussions fructueuses sur les applications cellulaires. Nous remercions également Frederic Bedu de l'installation PLANETE de salle blanche pour son aide avec les observations SEM. Ce travail a été financé en partie par le Conseil européen de la recherche par subvention n ° 307104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
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