एक समर्थित लिपिड bilayer में ligand नैनो-क्लस्टर सारणी
Summary
हम एक तरल पदार्थ लिपिड दोहरी परत से घिरा हुआ nanometric प्रोटीन पैच के साथ कांच functionalize के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन substrates उन्नत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ संगत कर रहे हैं और कोशिका आसंजन और प्रवास के अध्ययन के लिए मंच के रूप में सेवा करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं।
Abstract
इस समय वहाँ सेल जैविक अध्ययन के लिए passivated सतह के एक समुद्र में चिपकने वाला प्रोटीन द्वीपों का आदेश दिया सरणियों बनाने में काफी रुचि है। पिछले कुछ वर्षों में, यह तेजी से स्पष्ट है कि जीवित कोशिकाओं, जवाब उन्हें प्रस्तुत अणुओं की जैव रासायनिक प्रकृति के, लेकिन यह भी जिस तरह से इन अणुओं प्रस्तुत कर रहे हैं करने के लिए न केवल बन गया है। इसलिए अब कई जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में मानक प्रोटीन सूक्ष्म पैटर्न पैदा कर रही है; नैनो पैटर्न भी अधिक सुलभ हैं। हालांकि, सेल सेल बातचीत के संदर्भ में, वहाँ पैटर्न के लिए एक की जरूरत न केवल प्रोटीन, लेकिन यह भी लिपिड bilayers है। इस तरह की दोहरी proteo-lipídic आकृति अब तक आसानी से सुलभ नहीं किया गया है। हम एक सतही तकनीक कांच पर समर्थित प्रोटीन नैनो डॉट्स बना सकते हैं और एक समर्थित लिपिड दोहरी परत (SLB) के साथ अंतर-डॉट अंतरिक्ष बैकफ़िल के लिए एक विधि का प्रस्ताव करने की पेशकश करते हैं। ट्रेसर की तस्वीर-विरंजन से फ्लोरोसेंट लिपिड SLB में शामिल है, हम चाहते हैं कि दोहरी परत में-pl काफी दर्शाती प्रदर्शितane तरलता। फ्लोरोसेंट प्रोटीन समूहों के साथ डॉट्स functionalizing हमें उन्हें और पता चलता है कि वे एक नियमित रूप से हेक्सागोनल जाली में आदेश दिया जाता है छवि के लिए अनुमति देता है। ठेठ डॉट आकार लगभग 800 एनएम है और रिक्ति यहां प्रदर्शन किया 2 माइक्रोन है। इन substrates कोशिका आसंजन, प्रवास और mechano संवेदन के अध्ययन के लिए के रूप में उपयोगी प्लेटफार्मों की सेवा के लिए उम्मीद कर रहे हैं।
Introduction
कोशिका आसंजन विशेष कोशिका आसंजन अणु (cams), प्रोटीन कोशिका झिल्ली कि अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स पर या किसी अन्य कक्ष पर अपने समकक्ष के लिए बाध्य करने में सक्षम हैं पर उपस्थित माध्यम से होता है। पालन कोशिकाओं पर, हर जगह का इंटीग्रिन और cadherin सहित अधिकांश आसंजन अणु, समूहों 1 के रूप में पाए जाते हैं। प्रतिजन पेश कोशिकाओं के साथ टी लिम्फोसाइट्स (टी कोशिकाओं) की बातचीत (APCs) दो कोशिकाओं के बीच इंटरफेस पर गठित रिसेप्टर समूहों के महत्व का एक विशेष रूप से हड़ताली चित्र उपलब्ध कराती है – अक्सर एक प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन कहा जाता है। टी सेल प्रपत्र माइक्रोन पैमाने समूहों कि प्लेटफार्मों 2, 3, 4 संकेत के रूप में सेवा, और अंततः केंद्रीकृत कर रहे हैं की सतह पर एपीसी, टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) से पहले संपर्क बनाने एक बड़ा केंद्रीय supramolecular क्लस्टर के लिए फार्म पर (cSMAC )लड़की = "xref"> 5, 6, 7। हाल ही में, यह दिखाया गया था कि एपीसी तरफ, TCR के लाइगैंडों भी 8 गुच्छा बनाती हैं।
टी सेल-एपीसी बातचीत, संकर प्रणालियों की तैनाती है, जहां एपीसी एक कृत्रिम सतह प्रासंगिक प्रोटीन के साथ क्रियाशील द्वारा मजाक उड़ाया जाता है के संदर्भ में, synaptic इंटरफेस 2, 3, 4, 5, 6, 7 की हमारी समझ उन्नत बहुत है । इस संदर्भ में, यह अत्यधिक डिजाइन करने के लिए एपीसी अनुकरण करनेवाला सतहों कि लक्ष्य सेल के एक या अधिक पहलुओं पर कब्जा प्रासंगिक है। उदाहरण के लिए, यदि लाइगैंडों समर्थित लिपिड bilayers पर grafted रहे हैं, वे दोहरी परत के विमान में विसरित कर सकते, एपीसी सतह पर स्थिति की नकल और एक ही समय में के गठन की अनुमतिcSMAC 6, 7। इसी तरह, एपीसी पर समूहों पॉलिमर 9, 10, 11, 12, 13, 14 के एक समुद्र में लाइगैंडों के द्वीपों बनाने के द्वारा मजाक उड़ाया गया है। हालांकि, इन दो सुविधाओं अब तक संयुक्त नहीं किया गया है।
यहाँ हम विरोधी CD3 (एंटीबॉडी कि TCR जटिल लक्षित करता है) की नैनो डॉट्स diffusing लिपिड के एक लिपिड दोहरी परत से घिरा बनाने के लिए एक उपन्यास तकनीक का वर्णन। दोहरी परत Langmuir-Blodgett / Langmuir-शेफ़र तकनीक 7, 15, 16 का उपयोग कर जमा किया जाता है तथा आवश्यकता पड़ने पर, एक विशिष्ट प्रोटीन के साथ क्रियाशील किया जा सकता है – उदाहरण के लिए, टी सेल इंटीग्रिन की ligand (ICAM1 कहा जाता है)। इसके अलावा, विरोधी CD3 प्रोटीन डॉट्स could एक और एंटीबॉडी या सीएएम के साथ प्रतिस्थापित किया। हम टी कोशिका आसंजन के अध्ययन के लिए मंच के रूप में भविष्य में उपयोग के लिए प्रोटीन को चुना है, वहीं यहां विस्तृत रणनीति किसी भी प्रोटीन और यहां तक कि डीएनए के लिए अनुकूलित किया जा सकता।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित के भीतर महत्वपूर्ण कदम एक समर्थित लिपिड दोहरी परत द्वारा प्रोटीन नैनो डॉट्स या डॉट्स के आसपास अंतरिक्ष के पीछे भरने के गठन से संबंधित हैं। प्रोटीन नैनो डॉट्स के संबंध में पहले मह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सेलुलर अनुप्रयोगों के बारे में उपयोगी विचार विमर्श जारी रखने के लिए लॉरेंट Limozin, पियरे डिलार्ड और एस्ट्रिड वाहल धन्यवाद। हम यह भी SEM टिप्पणियों के साथ अपनी मदद के लिए PLANETE cleanroom सुविधा से फ़्रेडरिक बेडू धन्यवाद। इस काम के लिए आंशिक रूप से अनुदान सं 307,104 एफपी / 2007-2013 / ईआरसी के माध्यम से यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया।
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
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