Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati
Summary
Presentiamo un protocollo per funzionalizzare vetro con macchie proteiche nanometriche circondato da un doppio strato lipidico fluido. Questi substrati sono compatibili con la microscopia ottica avanzata e si prevede di utilizzare come piattaforma per gli studi di adesione cellulare e migrazione.
Abstract
Attualmente v'è un notevole interesse per la creazione di array ordinati di isole di proteine adesive in un mare di superficie passivata per gli studi di biologia cellulare. Negli ultimi anni, è diventato sempre più chiaro che le cellule viventi rispondono, non solo per la natura biochimica delle molecole presentati a loro, ma anche per il modo in cui queste molecole sono presentati. Creazione di proteine micro-modelli è quindi ora di serie in molti laboratori di biologia; nano-modelli sono anche più accessibile. Tuttavia, nel contesto delle interazioni cellula-cellula, non v'è la necessità di modello non solo proteine, ma anche doppi strati lipidici. Tale doppia patterning proteo-lipidica, non è stato finora facilmente accessibile. Offriamo una tecnica facile per creare proteine nano-dots supportati su vetro e proporre un metodo per riempire lo spazio tra punti con un doppio strato lipidico supportato (SLB). Da fotometabolismo di tracciante lipidi fluorescenti incluse nel SLB, dimostriamo che il doppio strato presenta una considerevole in-plfluidità ane. Funzionalizzazione i puntini della proteina con gruppi fluorescenti ci permette di immagini di loro e per dimostrare che sono ordinate in modo regolare reticolo esagonale. La dimensione tipica punto è circa 800 nm e la spaziatura dimostrato qui è 2 micron. Questi substrati sono attesi per servire piattaforme utili per l'adesione cellulare, la migrazione e studi meccano-sensing.
Introduction
L'adesione cellulare avviene attraverso le molecole di adesione cellulare specializzati (CAM), proteine presenti sulla membrana cellulare che sono in grado di legarsi a loro controparte sulla matrice extracellulare o su un'altra cella. Su cellule aderite, la maggior parte delle molecole di adesione tra cui l'integrina onnipresente e caderina, si trovano in forma di cluster 1. L'interazione dei linfociti T (cellule T) con cellule presentanti l'antigene (APC) fornisce un'illustrazione particolarmente sorprendente l'importanza dei cluster recettori formata all'interfaccia tra le due cellule – spesso chiamata sinapsi immunologica. Su formare il primo contatto con i recettori delle cellule APC, T (TCR) sulla superficie dei cluster scala forma cella micron T che servono come segnalazione piattaforme 2, 3, 4, e sono eventualmente centralizzati per formare un cluster centrale supramolecolare grande (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Recentemente, è stato dimostrato che sul lato APC, i ligandi del TCR sono raggruppati 8.
Nel contesto di interazione cellule T-APC, l'impiego di sistemi ibridi, in cui l'APC viene imitato da una superficie artificiale funzionalizzata con proteine di interesse, ha notevolmente avanzato la nostra comprensione dell'interfaccia sinaptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In questo contesto, è di grande rilevanza per la progettazione di superfici mimetiche APC che catturano uno o più aspetti della cellula bersaglio. Ad esempio, se ligandi sono innestate su bistrati lipidici supportati, possono diffondere nel piano del doppio strato, mimare la situazione sulla superficie APC e allo stesso tempo consentire la formazione dellacSMAC 6, 7. Analogamente, i cluster sulla APC sono stati imitato creando isole di ligandi in un mare di polimeri 9, 10, 11, 12, 13, 14. Tuttavia, queste due caratteristiche finora non sono stati combinati.
Qui si descrive una tecnica innovativa per creare nano-dots di anti-CD3 (un anticorpo che bersaglia il complesso TCR) circondato da un doppio strato lipidico con i lipidi diffondenti. Il doppio strato viene depositato mediante Langmuir-Blodgett / tecnica Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 e, se desiderato, potrebbe essere funzionalizzato con una proteina specifica – per esempio, il legante di integrina cellule T (chiamato ICAM1). Inoltre, gli anti-CD3 punti proteina could essere sostituito con un altro anticorpo o CAM. Mentre abbiamo scelto le proteine per uso futuro come piattaforma per gli studi di adesione cellulare T, la strategia dettagliato qui può essere adattato per qualsiasi proteina e persino il DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fasi critiche nel protocollo sopra descritto sono legati alla formazione della proteina nano-punti o back-riempimento dello spazio intorno ai punti da un bistrato lipidico supportato. Il primo passo critico rispetto alle proteine nano-dots è la preparazione del cordone maschera. La pulizia del coperchio-scivolo è critica. I vetrini devono essere sia pulito con una soluzione detergente che è raccomandato per pulizia cuvette di quarzo, o con plasma di ossigeno. Altre tecniche di pulizia come immersione in etan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Laurent Limozin, Pierre Dillard e Astrid Wahl per continuare discussioni fruttuose su applicazioni cellulari. Ringraziamo anche Frederic Bedu dalla struttura camera bianca PLANETE per il suo aiuto con le osservazioni SEM. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Consiglio europeo della ricerca tramite concessione n ° 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
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