サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列
Summary
私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。
Abstract
現在、細胞生物学的研究のための不動態化表面の海で接着性タンパク質の島々の注文したアレイを作成するにはかなりの関心が寄せられています。過去数年間で、それは彼らに提示する分子の生化学的性質のためにも、これらの分子が提示されている方法にするだけでなく、生きている細胞が応答することがますます明らかになっています。タンパク質のマイクロパターンを作成することになりましたので、多くの生物学の研究室では標準的なものです。ナノパターンは、よりアクセス可能です。しかし、細胞間相互作用の文脈では、パターンにする必要はありませタンパク質だけでなく、脂質二重層があります。このような二重プロテオ脂質パターニングは、これまで簡単にアクセスされていません。私たちは、ガラス上でサポートタンパク質ナノドットを作成して、支持された脂質二重層（SLB）とドット間のスペースを埋め戻す方法を提案すること容易な手法を提供します。 SLBに含まトレーサー蛍光脂質の光退色から、私たちは二重層がで-PLかなり呈することを示していますANE流動性。蛍光基とタンパク質のドットを官能基化すると、イメージ、彼らと彼らは通常の六角格子に順序付けられていることを示すために私たちをことができます。代表的なドットサイズは約800nmであり、ここで実証間隔は2ミクロンです。これらの基板は、細胞接着、移動およびメカノセンシング研究用として有用なプラットフォームを提供するために期待されています。
Introduction
細胞接着は、細胞外マトリックス上で、または別の細胞上のそれらの対応物に結合することができる細胞膜上に存在する特殊な細胞接着分子（CAM）、タンパク質を介して行われます。接着した細胞に、ユビキタスインテグリンおよびカドヘリンを含むほとんどの接着分子は、クラスター1の形態で見出されます。多くの場合、免疫学的シナプスと呼ばれる – 抗原提示細胞（APC）とTリンパ球（T細胞）の相互作用は、二つのセルの間の界面に形成された受容体クラスターの重要性の特に顕著な図を提供します。プラットフォーム2をシグナルとして働くT細胞形態ミクロンスケールクラスターの表面上のAPC、T細胞受容体（TCR）との最初のコンタクトを形成する際に、3、4、および最終的には大きな中央超分子クラスターを形成するために集中している（CSMAC ）LASS = "外部参照"> 5、6、7。最近、APC側に、TCRのリガンドはまた、8クラスタ化されることが示されました。
T細胞-APC相互作用の文脈では、APCは、関連するタンパク質で官能人工表面によって模倣されたハイブリッドシステムの展開は、非常にシナプスインタフェース2、3、4、5、6、7の我々の理解が進んでいます。この文脈では、標的細胞の1つのまたは複数の態様を捕捉APC模倣表面を設計することが非常に適切です。リガンドが支持された脂質二重層上にグラフトされた場合、彼らは、二重層の面内に拡散するAPC表面上の状況を模倣すると同時に、の形成を可能にすることができますCSMAC 6、7。同様に、APC上のクラスターはポリマー9、10、11、12、13、14の海でのリガンドのアイランドを作成することによって模倣されてきました。しかし、これら2つの機能は、これまで併用されていません。
ここでは、拡散する脂質と脂質二重層に囲まれた抗CD3（TCR複合体を標的とする抗体）のナノドットを作成するための新規な技術を説明します。二重層は、ラングミュア-ブロジェット/ラングミュア-シェーファー法7、15、16を用いて堆積され、必要に応じて、特定のタンパク質で官能化することができる-例えば、T細胞インテグリンのリガンド（ICAM1と呼ばれます）。また、抗CD3タンパク質ドットCOULDは、別の抗体またはCAMに置き換えること。我々はT細胞接着研究のためのプラットフォームとして、将来の使用のためのタンパク質を選択しているが、ここでは詳細な戦略は、任意のタンパク質、さらにはDNAに適合させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述のプロトコル内の重要なステップは、サポートされている脂質二重層によってタンパク質ナノドットまたはドットの周囲の空間の背面充填の形成に関連しています。タンパク質ナノドットに対する第1の重要なステップは、ビーズ、マスクの製造です。カバースライドの洗浄が重要です。スライドはいずれか、または酸素プラズマで石英キュベットを洗浄するために推奨される洗剤液で洗…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、携帯アプリケーションについて実りある議論を継続するためローランLimozin、ピエール・ディラードとアストリッド・ワル感謝します。また、SEM観察と彼の助けをPLANETEのクリーンルーム施設からフレデリック・ベドゥ感謝します。この作品は、部分的に助成金番号307104 FP / 2007から2013 / ERC経由の欧州研究評議会によって資金を供給されました。
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
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