Abstract
मुलायम-अगर ओवरले तकनीक मूल रूप से 70 साल से अधिक पहले विकसित किया गया था और व्यापक रूप से bacteriophages और बैक्टीरियोसिन्स, प्रोटीन जीवाणुरोधी एजेंटों के साथ काम सहित सूक्ष्मजीवविज्ञानी अनुसंधान के कई क्षेत्रों में इस्तेमाल किया गया है। यह दृष्टिकोण न्यूनतम संसाधन आवश्यकताओं के साथ अपेक्षाकृत सस्ती है। इस तकनीक में एक दाता तनाव से सतह पर तैरनेवाला खोलना एक जम नरम अगर ओवरले कि एक जीवाणु परीक्षण तनाव (संभावित विषाक्त यौगिक (एस) के संवेदी) के साथ वरीयता प्राप्त है पर (संभवतः एक विषाक्त यौगिक (ओं) को शरण देने) के होते हैं। हम स्यूडोमोनास syringae के एक पुस्तकालय intraspecific हत्या के लिए तनाव स्क्रीन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया। एक वर्षा कदम और लक्षित जीन विलोपन के साथ इस दृष्टिकोण के संयोजन से, कई जहरीले ही तनाव द्वारा उत्पादित यौगिकों भेदभाव किया जा सकता है। दो विरोधी एजेंटों आमतौर पर इस तकनीक का उपयोग बरामद bacteriophages और बैक्टीरियोसिन्स हैं। इन दो एजेंटों का उपयोग भेदभाव किया जा सकतादो सरल अतिरिक्त परीक्षण। एक सतह पर तैरनेवाला जीवाणुभोजी युक्त पर एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन, व्यक्तिगत सजीले टुकड़े अधिक से अधिक कमजोर पड़ने के साथ संख्या में कम होता जा रहा में परिणाम होगा, जबकि एक सतह पर तैरनेवाला bacteriocin युक्त एक समाशोधन क्षेत्र है कि समान रूप से अधिक से अधिक कमजोर पड़ने के साथ परेशान हो जाता है परिणाम होगा के धारावाहिक कमजोर पड़ने। इसके अतिरिक्त, एक जीवाणुभोजी जब एक ही तनाव के साथ वरीयता प्राप्त एक ताजा नरम अगर ओवरले पर देखा है, जबकि एक bacteriocin जब एक ताजा नरम अगर लॉन को हस्तांतरित, bacteriocin के कमजोर पड़ने के कारण एक समाशोधन क्षेत्र का उत्पादन नहीं होगा एक समाशोधन क्षेत्र का उत्पादन होगा।
Introduction
हाल ही में, वहाँ माइक्रोबियल पारिस्थितिकी के बारे में हमारी समझ को (विशेष रूप से विभिन्न वातावरण के microbiomes), साथ ही नए जीवाणुरोधी यौगिकों को मजबूत बनाने एंटीबायोटिक प्रतिरोधी रोगजनकों 1,2 का मुकाबला करने में उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हित में किया गया है। इन हितों के बीच एक परस्पर विषय उनके प्राकृतिक वातावरण में जीवाणु उपभेदों के बीच बातचीत को समझने के विरोधी है। वहाँ कई तरीके हैं जिसमें बैक्टीरिया प्रतियोगियों 3 विरोध कर रहे हैं। बैक्टीरियोसिन्स, प्रोटीन, जीवाणुरोधी यौगिकों की एक विविध समूह, लंबे interbacterial विरोध में मध्यस्थता, सबसे अधिक अध्ययन Pseudomonas aeruginosa 4,5 और 6 कोलाई, महत्वपूर्ण मानव रोगजनकों की जा रही प्रजातियों में से दो के साथ में उनकी भूमिका के लिए अध्ययन किया गया है। बैक्टीरियोसिन्स के अलावा, प्रेरित prophages भी anticompetitor एजेंट के रूप में कार्य कर सकते हैं, एक तनाव एक जगह है कि पहले से ही उपनिवेश है 7 में आक्रमण करने की अनुमति देता है। स्यूडोमोनास रोंyringae एक संयंत्र रोगाणुरोधी एजेंटों की एक सरणी, एक प्रोटीन बैक्टीरियोसिन्स 8, जीवाणुभोजी पूंछ व्युत्पन्न बैक्टीरियोसिन्स 9 (करार दिया tailocins), और साथ ही गैर-प्रोटीन माध्यमिक चयापचयों 10 सहित उत्पादन के लिए जाना जाता रोगज़नक़ है। हाल ही में वहाँ समझ में रुचि रही है कि कैसे इन antimicrobials इस जीव की पारिस्थितिकी को प्रभावित करती है, कैसे वे संयंत्र रोग 11 को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और साथ ही।
दोनों बैक्टीरियोसिन्स और जीवाणुभोजी अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग विधि नरम-अगर ओवरले तकनीक है। इस विधि को पहले जीवाणुभोजी 12,13 गणना में सहायता करने के लिए 1936 में अनुग्रह द्वारा वर्णित किया गया था।
यहाँ हम, मुलायम-अगर ओवरले विधि के आवेदन का वर्णन लक्षित आनुवंशिक हेरफेर और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) वर्षा के साथ संयोजन में, तीन अलग अलग रोगाणुरोधी एजेंटों के बीच भेद (एक जीवाणुभोजी में, एक उच्च आणविक भार bacteriocin, और एक कम आणविक भार bacteriocin) एक एकल बैक्टीरियल तनाव द्वारा उत्पादित। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह अपेक्षाकृत सरल और सस्ता है, यही वजह है, बावजूद यह निश्चित किया जा रहा है 'कम तकनीक', यह अभी भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
Protocol
1. तैरनेवाला की तैयारी गतिविधि के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए
- बाँझ 0.1 एम MgSO 4 बफर (जैसे 1 मिलीग्राम mitomycin सी / 2 मिलीलीटर बफर) में उचित मात्रा में भंग द्वारा mitomycin सी के एक 0.5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार है। एक प्रकाश संरक्षित कंटेनर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर शेयर (mitomycin सी प्रकाश के प्रति संवेदनशील है)।
- राजा के मध्यम बी (KB) शोरबा 14 के 3 मिलीलीटर में पी syringae का एक भी कॉलोनी टीका लगाना। कमरे के तापमान पर (200 आरपीएम) झटकों के साथ रात खत्म सेते (21-25 डिग्री सेल्सियस)।
- अगली सुबह, ताजा KB शोरबा के 3 मिलीलीटर में शोरबा संस्कृति 1/100 पतला। कमरे के तापमान पर झटकों के साथ 3-4 घंटे के लिए सेते हैं। mitomycin सी (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल, अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। कमरे के तापमान पर झटकों के साथ रात खत्म संस्कृति सेते हैं।
नोट: Mitomycin सी, डबल असहाय डीएनए टूट का कारण बनता है और इस प्रकार सेल के एसओएस प्रतिक्रिया उत्तेजक, दोनों जीवाणुभोजी और बैक्टीरियोसिन्स के उत्पादन के लिए अग्रणी। - गोली 1-2 मिलीलीटर mitomycin सी एक बेंच शीर्ष microcentrifuge में 5 मिनट के लिए 20,000 XG पर centrifugation द्वारा प्रेरित संस्कृतियों।
- निकालें और संस्कृति supernatants बाँझ या तो एक 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला से गुजर रहा या क्लोरोफॉर्म के साथ सतह पर तैरनेवाला (1 मिलीलीटर सतह पर तैरनेवाला प्रति 100 μl क्लोरोफॉर्म) के इलाज से।
- क्लोरोफॉर्म का उपयोग करते हैं, 15 सेकंड के लिए मिश्रण भंवर और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, 5 मिनट के लिए 20,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र।
नोट: क्लोरोफॉर्म कुशलता से उनके झिल्ली solubilizing द्वारा कोशिकाओं को मारता है। फिल्टर नसबंदी के ऊपर क्लोरोफॉर्म का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह सस्ता है और बड़े पैमाने अप करने के लिए आसान है अगर एक बार में कई (> 20) नमूने प्रसंस्करण। वहाँ एक संभावना है कि किसी दिए गए हत्या गतिविधि जैविक चरण में विभाजन का एक परिणाम के रूप में क्लोरोफॉर्म इलाज के बाद खो गया है हो सकता है। - एक ताजा, बाँझ 1.5 या 2.0 मिलीलीटर के लिए एक 1 मिलीलीटर pipet का उपयोग ऊपरी, जलीय चरण हटायेmicrofuge ट्यूब। कम क्लोरोफॉर्म परत के किसी भी हस्तांतरण करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा (यह जलीय चरण के कम दूर करने के लिए ले जाने से बचने के लिए बेहतर है)।
- एक धूआं हुड में uncapped स्थानांतरित कर सतह पर तैरनेवाला सेते अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म (कई घंटे) लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर supernatants।
- क्लोरोफॉर्म का उपयोग करते हैं, 15 सेकंड के लिए मिश्रण भंवर और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, 5 मिनट के लिए 20,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र।
2. द्वारा पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) वर्षा पृथक्करण और उच्च आणविक भार जीवाणुनाशक यौगिकों की एकाग्रता
- बाँझ सतह पर तैरनेवाला करने के लिए, क्रमशः, 1 एम और 10% अंतिम सांद्रता के लिए सोडियम क्लोराइड और खूंटी 8000 में जोड़ें। बार बार नमूना पलटना जब तक दोनों सोडियम क्लोराइड और खूंटी पूरी तरह से भंग कर रहे हैं। 1 घंटा या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर के लिए एक बर्फ स्नान में नमूने सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने हैं। एक गोली अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे फार्म चाहिए। सतह पर तैरनेवाला छानना और वांछित मात्रा (जैसे 1/10 या मूल सतह पर तैरनेवाला वॉल्यूम 1/100 के रूप में गोली resuspendUme) दोहराया pipetting द्वारा बफर (10 मिमी Tris, 10 मिमी MgSO 4, 7.0 पीएच) के।
- क्लोरोफॉर्म के एक बराबर मात्रा के साथ दो अनुक्रमिक एक्सट्रेक्शन द्वारा अवशिष्ट खूंटी निकालें।
- resuspended गोली और 10 से 15 सेकंड के लिए भंवर के साथ क्लोरोफॉर्म का मिश्रण है, तो 5 मिनट के लिए 20,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र। एक ताजा microfuge ट्यूब ऊपरी, जलीय चरण स्थानांतरण। इस निष्कर्षण दोहराएँ जब तक जलीय और जैविक चरण के बीच कोई सफेद इंटरफ़ेस दिखाई देता है (आमतौर पर 2 एक्सट्रेक्शन कुल)। अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म एक धूआं हुड में निकाले supernatants से लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें।
3. गतिविधि के लिए ओवरले और परीक्षण Supernatants की तैयारी
- टीका लगाना एक पी syringae तनाव का एक भी कॉलोनी KB के 3 मिलीलीटर में संवेदनशीलता के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए कमरे के तापमान पर झटकों के साथ रात खत्म सेते हैं।
- अगली सुबह, वापस ताजा KB में संस्कृति 1/100 पतला। कमरे temperatu पर झटकों के साथ 3-4 मानव संसाधन सेतेफिर से।
- एक निलंबन 0.35-0.7% autoclaving (डब्ल्यू / वी) ultrapure पानी में अगर द्वारा निष्फल पानी अगर तैयार करें।
नोट: शीतल जल अग्रवाल के एक शेयर एक माइक्रोवेव में पिघल जा सकता है और बार-बार पुन: उपयोग, ताजा ओवरले एक प्रयोग के लिए तैयार रहने की जरूरत नहीं है। पानी अगर पुन: उपयोग किया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए यह पूरी तरह से microwaving निम्नलिखित पिघल रहा है महत्वपूर्ण है। यदि नहीं, ओवरले solidifying पर एक दानेदार बनावट है कि व्याख्या मुश्किल कर देगा होगा। यदि ऐसा होता है, जैसा कि पहले किया तुलना माइक्रोवेव में अब कई मिनट के लिए अगर पिघला। - एक 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान का उपयोग करने से पहले में पिघला हुआ नरम अगर बनाए रखें। एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक pipet का प्रयोग, एक बाँझ संस्कृति ट्यूब को हस्तांतरण नरम अगर के 3 मिलीलीटर। पानी से स्नान करने के लिए संस्कृति ट्यूब लौटें एक पिघला हुआ राज्य में बनाए रखने के लिए।
- ओवरले डालना, पहले (यह गर्म लेकिन गर्म छूने के लिए नहीं महसूस करना चाहिए) पिघला हुआ अगर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन जमना करने की अनुमति नहीं है।
- एक बाँझ हुड में, के 100 μl टीका लगानानरम अगर और भंवर में परीक्षक तनाव संस्कृति मिश्रण करने के लिए। 10-15 सेकंड के लिए हाथ से संस्कृति को बारी बारी से एक नीचे अग्रवाल (केबी अग्रवाल) पर डालना तो। सभी दिशाओं में थाली झुकाएँ सुनिश्चित करने के लिए नरम अगर समान तल अगर शामिल किया गया है।
नोट: नीचे अगर किसी भी जम (1.5% अगर) मध्यम जिस पर परीक्षण तनाव तेजी से बढ़ता है हो सकता है। एक मानक 100 मिमी व्यास पेट्री डिश के लिए, का उपयोग करें ~ 20 मिलीलीटर मध्यम पिघल गए। नीचे अगर कई हफ्तों के समय से आगे तैयार किया जा सकता है (अगर सुखाने के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है) या एक ही दिन में तैयार किया जा सकता है। ओवरले प्रदर्शन के रूप में एक ही दिन में तैयार किया है, यह तो कदम को 3.4 से पहले क्या करने के लिए सबसे अच्छा है। - प्लेट कवर और इसे 20-30 मिनट जमना करने की अनुमति। सावधान करते हुए solidifying प्लेट परेशान करने के लिए नहीं हो।
- एक बार जम, तैरनेवाला के 2-5 μl हाजिर ओवरले पर (वर्गों 1 और 2, ऊपर में उत्पन्न)। प्लेटों कमरे के तापमान पर रात खत्म सेते दें। ध्यान से देखें और रिकॉर्ड परिणामों के बाद सुबह।
यह ध्यान देंप्रदर्शन और सतह पर तैरनेवाला के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने से हाजिर करने के लिए उपयोगी हो सकता है। यह शोधकर्ताओं जीवाणुभोजी और bacteriocin समाशोधन गतिविधि के बीच भेद करने के लिए अनुमति देगा। 5 या 1:10 dilutions: इस मामले में, यह 1 प्रदर्शन करने की सिफारिश की है।
Representative Results
नरम अगर ओवरले और खूंटी वर्षा के संयोजन की पहचान करने और विभिन्न रोगाणुरोधी ही तनाव द्वारा उत्पादित एजेंटों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 1 पी syringae (ए और बी) है कि एक ही प्रजाति के एक तिहाई तनाव से हिचकते हैं, जिनमें दो उपभेदों से पता चलता है। दो उपभेदों, हालांकि, विभिन्न बैक्टीरियोसिन्स से हिचकते हैं। तनाव एक पर समाशोधन जोन एक तेज धार दर्शाती है, जबकि तनाव बी पर समाशोधन क्षेत्र बड़ा है, और एक गैर तेज सीमा को दर्शाती है। उत्पादन तनाव के भीतर आनुवंशिक जोड़तोड़ कि विशेष bacteriocin (bacteriocin की कमी) की पुष्टि उपभेदों कि ए और बी अलग बैक्टीरियोसिन्स के प्रति संवेदनशील हैं या तो tailocin (कमी tailocin) या कम आणविक भार निष्क्रिय। चित्रा 2 से पता चलता है कि जीवाणुभोजी की मध्यस्थता हत्या एक कमजोर पड़ने श्रृंखला की तुलना द्वारा अन्य गैर replicative antimicrobials से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। दोनों बैक्टीरियोसिन्स क्योंकि औरprophage mitomycin सी उपचार द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, इन दो एजेंटों की गतिविधियों को बारीकी से एक दूसरे के समान कर सकते हैं (विशेष रूप से अगर सक्रिय फेज प्रचुर मात्रा में है)। जीवाणुभोजी की मध्यस्थता समाशोधन के मामले में, सतह पर तैरनेवाला के कमजोर पड़ने व्यक्ति सजीले टुकड़े (समाशोधन क्षेत्र) में हल जबकि bacteriocin की मध्यस्थता समाशोधन ऐसे सजीले टुकड़े में हल नहीं होगा।
चित्रा 1: कई रोगाणुरोधी ही तनाव द्वारा उत्पादित एजेंटों की प्ररूपी भेद। तनाव एक के रूप में tailocin कमी तनाव में समाशोधन की कमी है, लेकिन नहीं bacteriocin कमी तनाव इसका सबूत है, एक विकल्प कम आणविक भार bacteriocin एक उच्च आणविक भार bacteriocin (tailocin), लेकिन नहीं करने के लिए संवेदनशील है। इसके विपरीत, तनाव बी tailocin के प्रति असंवेदनशील है, लेकिन कम आणविक भार bacteriocin के प्रति संवेदनशील है। tailocin effic हैiently, खूंटी वर्षा के बाद बरामद किया है, जबकि कम आणविक वजन बैक्टीरियोसिन्स नहीं हैं। गुम्मट जंगली type =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: गैर replicative antimicrobials और bacteriophages के बीच भेद। (ए) व्यक्तिगत सजीले टुकड़े हैं कि कम कई बनने में bacteriophages परिणाम (उच्च अनुमापांक शीर्ष, कम अनुमापांक नीचे) के एक उच्च अनुमापांक के कमजोर पड़ने। (बी) के समान रूप से कम समाशोधन में बैक्टीरियोसिन्स परिणामों के कमजोर पड़ने कि व्यक्ति सजीले टुकड़े में हल नहीं होती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
मुलायम-अगर ओवरले तकनीक यहाँ वर्णित व्यापक रूप से अक्तेरिओफगेस या बैक्टीरियोसिन्स में रुचि शोधकर्ताओं द्वारा कई दशकों के लिए लागू किया गया है। इस दृष्टिकोण का मुख्य लाभ कर रहे हैं कि यह सरल, सस्ता और अपेक्षाकृत आसान व्याख्या करने के लिए है। खूंटी वर्षा और धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ नरम-अगर ओवरले के संयोजन से, रोगाणुरोधी एजेंटों (यानी जीवाणुभोजी बनाम tailocin, क्रमशः) बनाम कम आणविक भार एजेंटों उच्च है, और replicative बनाम गैर replicative एजेंटों में विभाजित किया जा सकता है। अंत में, ख्यात bacteriocin या prophage लोकी के लक्षित आनुवंशिक हेरफेर (विलोपन और पूरक) के समावेश मजबूती से एक दिया विरोधी यौगिक की पहचान स्थापित कर सकते हैं। हमने हाल ही में एक नया जीवाणुभोजी व्युत्पन्न स्यूडोमोनास syringae के बीच प्रचलित bacteriocin तनाव 9 वर्णन करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है।
विकास मीडिया और शर्तों को अच्छी तरह से स्यूडोमोनास एसवाई के लिए इस प्रोटोकॉल के काम में संकेतringae और संभावना अन्य ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया है कि इन परिस्थितियों में तेजी से बढ़ने के लिए पर्याप्त होगा। हालांकि, इस पद्धति का उपयोग करते हुए शोधकर्ताओं समय, संस्कृति के माध्यम से, अधिष्ठापन विधि, और ऊष्मायन तापमान उनकी व्यवस्था के लिए अनुकूलन करने के लिए चाहते हो जाएगा। महत्वपूर्ण पैरामीटर के उत्पादन संस्कृति उत्प्रेरण जबकि लघुगणक विकास के चरण में है, साथ ही पर्याप्त लघुगणक चरण संस्कृति के साथ नरम-अगर ओवरले बोने एक समान बैक्टीरियल वितरण सुनिश्चित करने के लिए, लेकिन नहीं अत्यधिक संस्कृति है, जो संभावित समाशोधन क्षेत्रों अस्पष्ट होगा शामिल हैं। वहाँ कई बैक्टीरियोसिन्स कि एसओएस प्रतिक्रिया के हिस्से के रूप में प्रेरित नहीं कर रहे हैं, बल्कि पेप्टाइड आधारित कोरम संवेदन प्रणाली (विशेष रूप से ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरियोसिन्स 15), इस प्रकार, एक शोधकर्ता के कई अलग अलग तरीकों प्रेरण स्क्रीन करने के लिए चाहते हो सकता है (जैसे के माध्यम से प्रेरित कर रहे हैं मध्यम उत्प्रेरण, या उत्पादन तनाव की विस्तारित ऊष्मायन) के लिए अनुमति देने का पोषक तत्व सामग्री को संशोधित।
उपयोग करते समयइस तकनीक, मुलायम-अगर ओवरले अच्छी तरह से पिघल जाना चाहिए और बनाए रखा 55-60 डिग्री सेल्सियस पर बोने तनाव के अलावा पहले। हम कई प्रयोगों जहां मुलायम-अगर अच्छी तरह से पिघल नहीं किया गया था (हालांकि यह नेत्रहीन हो दर्शन) और एक दानेदार उपस्थिति के साथ एक ओवरले में हुई पड़ा है। एक दानेदार ओवरले से परिणाम अभी भी आम तौर पर व्याख्या हो सकती है, हालांकि यह (निरीक्षण करने के लिए और अधिक कठिन हो जाएगा कमजोर निषेध) निषेध की ताकत पर निर्भर है। एक अंतिम, confounding चर पर विचार करने के लिए जब इस तकनीक का उपयोग कि पिघला हुआ अगर का तापमान, बोने तनाव के साथ टीका करने से पहले शांत करने के लिए इतनी के रूप में बोने तनाव की हत्या से बचने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दी जाती है। इस समस्या से बचने के लिए, हम यह सुनिश्चित करना नरम-अगर गर्म है, लेकिन नहीं गर्म, स्पर्श करने के लिए है। इन पंक्तियों के साथ, हम यह भी कहा है कि अगर हम एक बोने संस्कृति के लिए अपर्याप्त समय पिघला हुआ अगर acclimate करने के लिए दे, ओवरले डालने का कार्य करने से पहले, हम आम तौर पर गरीब बैक्टीरियल जी की वसूलीrowth, जो व्याख्या करने के लिए विशिष्ट निषेध मुश्किल या असंभव की व्याख्या करता है। यही कारण है कि हम vortexing और ओवरले डालने का कार्य बीच ऊष्मायन के 10-15 अतिरिक्त सेकंड अनुमति देते हैं। एक पूरी तरह पिघला हुआ राज्य में अगर बनाए रखने के बीच व्यापार बंद (hotter बेहतर नहीं है) एक संभावना परीक्षण और त्रुटि के माध्यम से एक शोधकर्ता द्वारा निर्धारित करने की आवश्यकता होगी कि है, लेकिन बोने तनाव नहीं घातक (hotter बेहतर है)।
एक खूंटी वर्षा कदम का इस्तेमाल किया जाता है, यह जहां एक बाँझ शोरबा मध्यम संस्कृति सतह पर तैरनेवाला को हूबहू संसाधित किया जाता है एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए फायदेमंद होगा। इससे यह सुनिश्चित होगा कि गतिविधि की हत्या अवशिष्ट खूंटी या क्लोरोफॉर्म नमूना सतह पर तैरनेवाला के भीतर का परिणाम नहीं है।
दोनों bacteriophages और बैक्टीरियोसिन्स अति विशिष्ट हो जाते हैं, यह उपभेदों का एक दिया संयोजन के साथ कोई स्पष्ट हत्या गतिविधि मुठभेड़ करने के लिए असामान्य नहीं है। इस तनाव-विशिष्ट पुन की एक किस्म से परिणाम कर सकते हैंविरोध तंत्र, एक जा रहा है कि परीक्षक तनाव या तो अभाव है या रिसेप्टर एक दिया bacteriocin या जीवाणुभोजी द्वारा लक्षित करने के लिए आवश्यक का एक अपरिचित संस्करण है।
एक वैकल्पिक तरीका, bacteriocin स्क्रीनिंग विधि Kawai एट अल द्वारा वर्णित किया गया है। , लेकिन खामियों से ग्रस्त है और न व्यापक रूप से 16 अपनाया गया है। विशेष रूप से, इस तकनीक का समय अंतराल है कि भारी हो सकता है पर शोरबा नमूने के अवलोकन की आवश्यकता है, और जीवाणुभोजी व्युत्पन्न और bacteriocin व्युत्पन्न हत्या गतिविधियों के बीच भेदभाव के लिए अनुमति नहीं है।
इस तकनीक का मुख्य सीमाओं कि यह अच्छी तरह से जीवों कि मजबूती के साथ जाना नहीं है (और इस तरह आसानी से discernable समाशोधन जोनों की कमी होगी) या कि बंदरगाह prophages या बैक्टीरियोसिन्स कि मजबूती के साथ प्रयोगशाला परिस्थितियों में उत्पादन नहीं कर रहे के लिए अनुकूल नहीं है। इस तकनीक के adaption पर्यावरण के नमूनों दोनों उपयोगिता का विस्तार होगा में उत्पादित बैक्टीरियोसिन्स पता लगाने के लिएइस तकनीक का और प्राकृतिक सेटिंग्स के भीतर बैक्टीरियोसिन्स की भूमिका में अधिक से अधिक जानकारी की सुविधा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Panec, M., Katz, D. S. Plaque Assay Protocols. , Available from: Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols (2013).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
