Abstract
ソフト寒天オーバーレイ技術は、もともと70年以上前に開発された、広くバクテリオファージおよびバクテリオ、タンパク質性の抗菌剤との仕事を含む微生物学的研究のいくつかの分野で使用されています。このアプローチは、最小のリソース要件と、比較的安価です。この手法は、（毒性化合物（複数可）に対して潜在的に敏感な）細菌試験菌株を接種されて固化し、ソフト寒天重層上に（潜在的に毒性の化合物（複数可）を保有する）ドナー株から上清をスポッティングで構成されています。私たちは、種内殺害のためのシュードモナスシリン株のライブラリーをスクリーニングするために、この技術を利用しました。沈殿工程と標的遺伝子の欠失と、このアプローチを組み合わせることにより、同一の株によって産生される多数の毒性化合物を区別することができます。一般的にこの技術を用いて回収2拮抗薬は、バクテリオファージおよびバクテリオシンです。これら二つの薬剤を使用して区別することができます2つの簡単な追加試験。バクテリオシンを含む上清の連続希釈を均一により濁っ大きく希釈となるとクリアゾーンをもたらす一方、バクテリオファージを含む上清の連続希釈を実行すると、より高い希釈と数が少なくなってきて、個々のプラークになります。バクテリオシンの希釈のために、新鮮な柔らかい寒天芝生に転送するときバクテリオシンは、クリアゾーンを生成しません一方で、同じ株を接種した新鮮な柔らかい寒天重層上にスポットするとさらに、バクテリオファージは、クリアゾーンを生成します。
Introduction
最近では、抗生物質耐性病原体1,2との戦いで使用するために私たちの微生物生態学の理解（様々な環境の特にmicrobiomes）だけでなく、新しい抗菌性化合物を深化に大きな関心がありました。これらの利益の間の相互接続のテーマは、それらの天然の環境中の細菌の菌株間の拮抗相互作用を理解することです。細菌は競合他社3に拮抗する多くの方法があります。バクテリオシン、タンパク質性、抗菌性化合物の多様なグループは、長い緑膿菌 4,5 大腸菌 6が最も研究された種の2、重要なヒト病原体で、interbacterial拮抗作用を媒介における役割について研究されてきました。バクテリオシンに加えて、誘導されたプロファージはまた、株が既に7を植民地化されているニッチに侵入することができ、anticompetitor剤として作用することができます。 シュードモナス秒yringaeは、単一のタンパク質バクテリオ8、バクテリオファージ尾由来のバクテリオシン9（と呼ばれるtailocins）、ならびに非タンパク質性二次代謝産物10を含む抗菌剤の配列を、生産することが知られている植物病原体です。最近、これらの抗菌剤は、彼らが植物病害11を制御するために利用することができますどのようにこの生物の生態に影響を与えるだけでなく、どのように理解することに関心が集まっています。
バクテリオシンおよびバクテリオファージの両方を研究するための広く利用されている方法は、ソフト寒天オーバーレイ技術です。この方法は、最初に、バクテリオファージ12,13を列挙するのを助けるために1936年にグレーシアによって記載されました。
ここでは、（三つの異なる抗菌剤の中で、バクテリオファージの区別に、標的遺伝子操作およびポリエチレングリコール（PEG）沈殿と組み合わせて、ソフト寒天オーバーレイ法の適用を説明し、高分子量BACT単一の細菌株によって産生さeriocin、及び低分子量のバクテリオシン）。このアプローチの利点は、それは、それは明らかに「ローテク」であるにもかかわらず、それはまだ広く利用されている理由である、比較的単純で安価であるということです。
Protocol
活性について試験するための上清の調製
- 無菌の0.1 M 硫酸マグネシウムバッファー（ 例えば 1mgのマイトマイシンC / 2ミリリットルバッファ）に適切な量を溶解することにより、マイトマイシンCの0.5 mg / mlでストック溶液を準備します。光保護された容器内に4℃での店舗在庫（マイトマイシンCは光感受性です）。
- 王の培地B（KB）培養液14の3ミリリットルにP. syringaeのの単一コロニーを接種します。室温（21-25℃）で振盪（200rpm）しながら一晩インキュベートします。
- 次の朝は、新鮮KBブロスの3ミリリットル中に肉汁培養1/100を希釈します。室温で振とうしながら3-4時間インキュベートします。マイトマイシンC（0.5 / mlの最終濃度）を追加します。室温で振盪しながら一晩培養をインキュベートします。
注：マイトマイシンCは、バクテリオファージおよびバクテリオシンの両方の産生をもたらす、したがって細胞のSOS応答を刺激する、二本鎖DNA破壊を引き起こします。 - ペレット1〜2ミリリットルマイトマイシンCは、ベンチトップ微量で5分間20,000×gで遠心分離することによって培養液を誘導しました。
- 削除し、0.22μmの孔サイズのフィルターを通して上清を通過させることにより、またはクロロホルム上清（1 mlの上清当たり100μlのクロロホルム）を処理することにより、いずれかの培養上清を滅菌します。
- クロロホルムを使用した場合、15秒間混合物をボルテックスし、室温で1時間インキュベートしましょう。インキュベーション後、5分間20,000×gで混合物を遠心します。
注：クロロホルムが効率的にそれらの膜を可溶化することによって細胞を死滅させます。濾過滅菌を介してクロロホルムを使用する利点は、一度に多くの（> 20）のサンプルを処理した場合にアップスケーリングするために安価で容易であることです。所与の殺活性を有機相への分配の結果としてクロロホルム処理後に失われる可能性があってもよいです。 - 新鮮な、滅菌1.5または2.0ミリリットルに1ミリリットルピペットを用いて上部の水相を除去マイクロチューブ。 （キャリーオーバーを避けるために、水相の少ないを削除することをお勧めし）、下部クロロホルム層のいずれかを転送しないように注意してください。
- 残留クロロホルムを（数時間）を蒸発させるためにヒュームフードにキャップされていない転送上清をインキュベートします。 4°Cで保存上清。
- クロロホルムを使用した場合、15秒間混合物をボルテックスし、室温で1時間インキュベートしましょう。インキュベーション後、5分間20,000×gで混合物を遠心します。
ポリエチレングリコール（PEG）沈殿による高分子量殺菌化合物の2分離濃縮
- 無菌上清に、それぞれ、1 Mおよび10％の最終濃度になるようにNaClおよびPEG 8000を追加します。 NaClおよびPEGの両方が完全に溶解するまで、繰り返しサンプルを反転。 4°Cで1時間または一晩氷浴中でサンプルをインキュベートします。
- 4℃で30分間、16,000×gで遠心分離サンプル。ペレットを遠心管の底に形成すべきです。上清を除去し、（そのようなオリジナルの上澄みの容量の1/10または1/100のような所望の体積でペレットを再懸濁UME）反復ピペッティングによって緩衝液（10mMのTris、10mMのMgSO 4を、pHが7.0）。
- 等量のクロロホルムで2連続抽出により残留PEGを除去します。
- その後、5分間20,000×gで混合物を遠心分離し、10〜15秒間再懸濁したペレットとボルテックスでクロロホルムを兼ね備えています。新鮮な微量遠心管に上部の水相を転送します。水と有機相との間には白のインタフェース（通常は2回の抽出合計）見えなくなるまで、この抽出を繰り返します。残留クロロホルムをドラフト内で抽出された上清から蒸発することを可能にします。
活動のためのオーバーレイとテスト上清の調製
- KBの3ミリリットルへの感受性を試験するためのP. syringaeの株の単一コロニーを接種、室温で振盪しながら一晩インキュベートします。
- 翌朝は、バック新鮮KBに文化1/100に希釈します。部屋のtemperatuで振盪しながら3-4時間インキュベート再。
- 超純水に懸濁0.35から0.7パーセント（w / v）の寒天をオートクレーブで滅菌水寒天を準備します。
注：軟水寒天の在庫は電子レンジで溶融し、繰り返し再利用することができ、新鮮なオーバーレイは、各実験のために準備する必要はありません。水寒天が再利用される場合は、完全にマイクロ波加熱以下の溶融されていることを確認することが重要です。そうでない場合、オーバーレイは解釈が困難になります固化時の粒子の粗いテクスチャを持っています。この問題が発生した場合、長い以前に行わよりも電子レンジで数分間寒天を溶かします。 - 使用前に60℃の水浴中で溶融した軟寒天に維持します。無菌培養チューブへの転送ソフト寒天の3ミリリットルを、無菌の血清学的ピペットを使用。溶融状態に維持するために水浴に培養チューブを返します。
- 最初の（それは暖かいが、熱くない感じるべき）溶融寒天を冷却することを可能にする、オーバーレイを注ぐことではなく、固化することはできません。
- 無菌フードでは、100μlの接種ソフトアガーと渦に試験株の文化が混在します。ボトム寒天（KB寒天）上に注ぎ、その後、10〜15秒間手で文化を回転させます。軟寒天が均等に底寒天をカバーするように、すべての方向にプレートを傾けます。
注：下の寒天は、試験株が活発に成長する上で任意の固化（1.5％寒天）培地であることができます。標準的な100ミリメートルの直径のペトリ皿のために、20ミリリットルの培地を融解〜使用。ボトム寒天（乾燥せずに4℃で維持した場合）、数週間事前に調製することができ、または同じ日に調製することができます。オーバーレイを行うと同じ日に調製した場合、それは3.4ステップするように前に行うことをお勧めします。 - プレートをカバーし、それが20〜30分で固化することができます。固化しながらプレートを乱さないように注意してください。
- 一度オーバーレイ上に（上記のセクション1と2で生成）上澄みの2-5μlのを見つけ、固化しました。プレートを室温で一晩インキュベートすることを可能にします。観察と記録の結果、次の朝。
注記：行い、上清の連続希釈から発見することが有用であり得ます。これは、研究者は、バクテリオファージおよびバクテリオ清算活動を区別することができます。 5または1:10希釈液：この場合には、1を実行することをお勧めします。
Representative Results
軟寒天オーバーレイ及びPEG沈殿の組み合わせは、同じ株によって産生される別の抗菌剤を同定し、特徴付けるために使用することができます。 図1は、同じ種の第三菌株によって阻害されるP. syringaeの （A及びB）の2系統を示しています。二つの株は、しかし、別のバクテリオシンによって阻害されます。株Bにクリアゾーンが大きく、非鋭い境界を示すのに対し、株Aの透明帯は、鋭いエッジを示します。具体的には、AとBが別個のバクテリオシンに感受性のある株（バクテリオ欠損）確認バクテリオ（欠損tailocin）tailocinまたは低分子量のいずれかを不活性化する生産株内の遺伝子操作。 図2は、バクテリオファージ媒介死滅の希釈系列を比較することにより、他の非複製抗菌剤と区別することができることを示しています。バクテリオシンとの両方のため、プロファージは、マイトマイシンC処理によって誘導することができ、これら二つの薬剤の活性は、密接に（活性化されたファージが豊富である場合は特に）が互いに似ていることができます。バクテリオ媒介クリアは、このようなプラークに解決されませんしながら、バクテリオファージ媒介清算の場合には、上清の希釈は、個々のプラーク（クリアゾーン）に解決します。
図1： 同じ株によって産生さ複数の抗菌剤の表現型の違い。株Aはtailocin欠損株でクリアするの欠如ではなく、バクテリオシン欠損株によって証明されるように、バクテリオ代替低分子量（tailocin）バクテリオ高分子量に敏感ではないです。逆に、B株はtailocinに鈍感であるが、低分子量のバクテリオシンに敏感です。 tailocinはefficです低分子量のバクテリオシンはそうではありませんiently、PEG沈殿後に回収。 WTは野生型を=。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：非複製抗菌剤およびバクテリオファージの区別。 （A）以下の多数（高力価のトップ、低力価の下部）になる個々のプラーク中のバクテリオファージの結果の高力価の希釈。 （B）は、個々のプラークに解決されない均一少ないクリアでバクテリオ結果の希釈。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
ここで説明するソフト寒天オーバーレイ技術が広くバクテリオファージまたはバクテリオに興味を持って研究者が何十年もの間適用されています。このアプローチの主な利点は、それが、簡単安価かつ解釈するのが比較的容易であることです。 PEG沈殿および連続希釈して、ソフトアガーオーバーレイを組み合わせることによって、抗菌剤は、低分子量剤対高に分離することができる、非複製剤（ すなわち、バクテリオファージ対tailocin、それぞれ）対複製。最後に、推定されるバクテリオシンまたはプロファージの遺伝子座の標的遺伝子操作（削除、補完）の組み込みは、しっかりと与えられた拮抗化合物のアイデンティティを確立することができます。我々は最近、 シュードモナスシリン 9菌株間で流行バクテリオ新しい由来のバクテリオファージを記述するために、このメソッドを使用しています。
増殖培地および条件は、 シュードモナスSYのためにも、このプロトコルの仕事に示されていますringaeとは、おそらく、これらの条件の下で活発に成長する他のグラム陰性菌のために十分であろう。しかし、この方法を用いて、研究者は、それらのシステムのためのタイミング、培地、誘導方式、及びインキュベーション温度を最適化するだろう。重要なパラメータは、対数増殖期の一方で生産文化を誘導するだけでなく、均一な細菌の分布を確実にするために十分な対数期の文化とソフト寒天オーバーレイを播種するが、潜在的なクリアゾーンを不明瞭になりますない過度の文化、含まれます。そこSOS応答の一部として誘導されていない多くのバクテリオシンは、むしろのようなペプチドに基づくクオラムセンシングシステム、従って、研究者は、いくつかの異なる誘導方法をスクリーニングすることができる（15、特にグラム陽性バクテリオシン）（を通じて誘導されます）誘導培地の栄養成分を変更する、または産生株の延長インキュベーションを可能にします。
使用している場合この技術は、ソフト寒天オーバーレイは徹底的に播種前株のほかに55〜60℃で溶融し、維持しなければなりません。私たちは（視覚的にあるように思われますが）と粒状感を持つオーバーレイをもたらし、ソフト寒天が完全に溶けていなかったいくつかの実験がありました。粒子の粗いオーバレイの結果はまだ一般的に解釈することができますが、これは（弱い阻害が観察することがより困難になります）阻害の強さに依存しています。この技術を使用する際に考慮すべき変数を交絡、最終的には、シード株を殺す回避するように、溶融寒天の温度は、十分な時間が播種株を接種前に冷却することです。この問題を回避するには、我々が触れないように、ソフト寒天は暖かいが、ホットではないことを確認してください。この線に沿って、我々はまた、我々は、溶融寒天に順応するために播種培養のための不十分な時間を与える場合は、オーバーレイを注ぐ前に、我々は一般的に悪い細菌グラムを回復することを観察しました解釈するの特異的阻害の解釈が困難または不可能rowth、。我々はボルテックスとオーバーレイを注ぐ間に、インキュベーションの10〜15追加秒を許可するのはこのためです。完全に溶融状態に寒天を維持するとの間のトレードオフ（熱いが優れている）が、播種株に対して致死的ではないが（熱いが良いとは限りません）おそらく試行錯誤を通じて研究者によって決定される必要がありますものです。
PEG沈殿工程が使用される場合、滅菌ブロス培地を培養上清に同様に処理されるネガティブコントロールを含むことが有益であろう。これは、アクティビティを殺すことは、サンプルの上清中の残留PEGまたはクロロホルムの結果ではないことを保証します。
バクテリオファージおよびバクテリオシンの両方が非常に特異的である傾向があるとして、株の所定の組み合わせで明らかな殺傷活性に遭遇しないことは珍しいことではありません。これは、株特異的再様々なから生じうるsistance機構、試験菌株が与えられたバクテリオシンまたはバクテリオファージによって標的化するために必要な受容体の認識されていないバージョンを欠いているか、いずれかを有することである1。
別の方法、バクテリオスクリーニング方法は、河合らによって記載されています。しかし、欠点があり、広く16を採用されていません。具体的には、この技術が負担することができた時間間隔でブロス試料を観察する必要があり、バクテリオファージ由来およびバクテリオシン由来の殺活動の間の識別はできません。
この技術の主な制限は、それが堅牢に成長しない（したがって、容易に識別可能なクリアゾーンを欠いている）、または頑健実験室条件の下で生産されていない港のプロファージまたはバクテリオその生物に適していないということです。環境試料で生産バクテリオシンを検出するためのこの技術の適応は、有用性を拡大することになるの両方この技術のと自然環境の中バクテリオシンの役割へのより深い洞察を促進します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
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