Användning av Soft-agar Overlay Technique att screena för bakteriellt producerat Hämmande Föreningar

Abstract

Mjuk-agar teknik utvecklades ursprungligen över 70 år sedan och har använts i stor utsträckning i flera områden av mikrobiologisk forskning, inklusive arbete med bakteriofager och bakteriociner, protein antibakteriella medel. Detta tillvägagångssätt är relativt billigt, med minimala krav på resurser. Denna teknik består av spotting supernatant från en donator stam (potentiellt härbärge en toxisk förening (ar)) på ett stelnat mjukagar overlay som ympas med en bakterieteststam (potentiellt känsligt för den toxiska förening (ar)). Vi utnyttjade denna teknik för att screena ett bibliotek av Pseudomonas syringae stammar för intraspecific dödande. Genom att kombinera denna metod med ett utfällningssteg och riktade gen deletioner kan flera giftiga ämnen som produceras av samma stam differentieras. De två antagonistiska medel som vanligen återvinns med denna teknik är bakteriofager och bakteriociner. Dessa två medel kan differentieras med hjälp avtvå enkla ytterligare tester. Utföra en serieutspädning på en supernatant innehållande bakteriofager kommer att resultera i enskilda plack blir mindre i antal med större utspädning, medan serieutspädning av en supernatant innehållande bakteriocin resulterar en clearing zon som blir enhetligt grumligare med större utspädning. Dessutom kommer en bakteriofag producera en clearing zonen när i fläckar på ett färskt mjukagar overlay ympats med samma stam, medan en bakteriocin inte kommer att producera en clearingzonen när de överförs till ett färskt mjukagar gräsmatta, på grund av utspädning av bakteriocin.

Introduction

På senare tid har det skett en betydande intresse av att fördjupa vår förståelse av mikrobiell ekologi (särskilt microbiomes olika miljöer), liksom nya antibakteriella föreningar för användning i kampen mot antibiotikaresistenta patogener ^1,2. En sammanbindande tema mellan dessa intressen är att förstå antagonistiska interaktioner mellan bakteriestammar i deras naturliga miljö. Det finns många sätt på vilka bakterier antagoniserar konkurrenter ^3. Bakteriociner, en mångskiftande grupp av protein, antibakteriella föreningar, har länge studerats för sin roll vid mediering interbacterial antagonism, med två av de mest studerade arterna vara Pseudomonas aeruginosa ^4,5 och Escherichia coli ^sex viktiga humana patogener. Förutom bakteriociner, kan inducerade profager också fungera som anticompetitor medel, vilket gör att en stam att invadera in i en nisch som redan är koloniserat ^7. Pseudo syringae är en växtpatogen kända för att producera en matris med antimikrobiella medel, inklusive enkla protein bakteriociner ^8, bakteriofag tail härledda bakteriociner ⁹ (benämnda tailocins), såväl som icke-proteinartade sekundära metaboliter ^10. Nyligen har det funnits intresse för att förstå hur dessa antimikrobiella medel påverkar ekologi denna organism, samt hur de kan utnyttjas för att styra växtsjukdomar ^11.

En allmänt används metod för att studera både bakteriociner och bakteriofager är den mjuka agar teknik. Denna metod beskrevs först av Gratia 1936 till stöd räkna bakteriofager ^12,13.

Här beskriver vi tillämpningen av den mjuka-agar overlay-metoden, i kombination med riktad genetisk manipulation och polyetylenglykol (PEG) utfällning, att skilja mellan tre olika antimikrobiella medel (en bakteriofag, en högmolekylär bacteriocin, och en låg molekylvikt bakteriocin) producerat av en enda bakteriestam. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det är relativt enkelt och billigt, och det är därför, trots att det är avgjort "low-tech", det är fortfarande används i stor utsträckning.

Protocol

1. Beredning av supernatant som skall testas för aktivitet

1. Bered en 0,5 mg / ml stamlösning av mitomycin C genom upplösning av den lämpliga mängden i sterilt 0,1 M MgSO _4-buffert (t.ex. 1 mg mitomycin C / 2 ml buffert). Store lager vid 4 ° C i en ljus skyddad behållare (mitomycin C är ljuskänsligt).
2. Inokulera en enda koloni av P. syringae i 3 ml Kings medium B (KB) buljong ^14. Inkubera över natt med skakning (200 rpm) vid rumstemperatur (21-25 ° C).
3. Följande morgon, späd buljongen kultur 1/100 i 3 ml färsk KB buljong. Inkubera under 3-4 h med skakning vid rumstemperatur. Lägg mitomycin C (0,5 | ig / ml, slutkoncentration). Inkubera kulturen över natten med skakning vid rumstemperatur.
   OBS: Mitomycin C förorsakar dubbelsträngade DNA-brott, och därmed främja cellens SOS svar, vilket leder till produktion av både bakteriofag och bakteriociner.
4. Pelleten 1-2 ml mitomycin C inducerade kulturerna genom centrifugering vid 20.000 x g under 5 min i en bänkmikrocentrifug.
5. Ta bort och sterilisera odlingssupernatanter antingen genom att passera supernatanten genom ett 0,22 ^ m porstorlek filter eller genom behandling av supernatanten med kloroform (100 | il kloroform per 1 ml supernatant).
   1. Om användning av kloroform, virvel av blandningen under 15 sek och låt inkubera vid rumstemperatur under 1 timme. Efter inkubation centrifugeras blandningen vid 20000 x g under 5 min.
      OBS: Kloroform dödar effektivt celler genom solubilisering av deras membran. Fördelen med att använda kloroform under filtersterilisering är att det är billigare och enklare att skala upp, om bearbetning av många (> 20) prover i taget. Det kan finnas en möjlighet att en viss dödande aktivitet går förlorad efter kloroform behandling på grund av uppdelning i den organiska fasen.
   2. Ta den övre vattenfasen med hjälp av en 1 ml pipett till en ny, steril 1,5 eller 2,0 mlmikrofugrör. Var noga med att inte överföra något av lägre kloroformskiktet (det är bättre att ta bort mindre av vattenfasen för att undvika överföring).
   3. Inkubera den överförda supernatanten icke-begränsade i ett dragskåp för att tillåta den återstående kloroform avdunsta (flera timmar). Förvara supernatanter vid 4 ° C.

2. Separation och Koncentration av högmolekylär Baktericida Föreningar med polyetylenglykol (PEG) Utfällning

1. Till den sterila supernatanten, tillsätt NaCl och PEG 8000 till 1 M och 10% slutkoncentrationer, respektive. Upprepade gånger invertera provet tills både NaCl och PEG är fullständigt upplöst. Inkubera proverna i ett isbad under 1 h eller över natten vid 4 ° C.
2. Centrifugera proverna vid 16.000 xg under 30 min vid 4 ° C. En pellet bör bildas vid botten av centrifugröret. Dekantera supernatanten och suspendera pelleten i önskad volym (t.ex. 1/10 eller 1/100 av den ursprungliga supernatanten volume) buffert (10 mM Tris, 10 mM MgSO _4, pH 7,0) genom upprepad pipettering.
3. Avlägsna kvarvarande PEG med hjälp av två sekventiella extraktioner med en lika stor volym kloroform.
   1. Kombinera kloroform med den återsuspenderade pelleten och vortex under 10 till 15 sek, sedan centrifugera blandningen vid 20000 x g under 5 min. Överför den övre, vattenbaserade fasen till ett färskt mikrofugrör. Upprepa extraktionen tills ingen vit gränssnitt mellan den vattenhaltiga och organiska fasen är synlig (normalt 2 extraktioner totalt). Låt resterande kloroform avdunsta från extraherade supernatanterna i ett dragskåp.

3. Beredning av Overlay och provning Supernatanter för aktivitets

1. Inokulera en enda koloni av en P. syringae-stam som skall testas med avseende på känslighet i 3 ml av KB, inkubera över natten med skakning vid rumstemperatur.
2. Följande morgon, tillbaka späda kulturen 1/100 i färskt KB. Inkubera 3-4 h med skakning vid rumstemperatre.
3. Förbereda steriliserat vatten agar genom autoklavering av en suspension 0,35-0,7% (vikt / volym) agar i ultrarent vatten.
   OBS: Ett lager av mjukt vatten agar kan smältas i en mikrovågsugn och återanvändas flera gånger, inte färsk overlay behöver inte vara beredd på varje experiment. Om vatten agar återanvänds, är det viktigt att se till att den är helt smält efter microwaving. Om inte, kommer overlay har en kornig konsistens vid steln som gör tolkningen svår. Om detta inträffar, smälta ägarn under flera minuter längre i mikrovågsugn än gjort tidigare.
4. Bibehålla den smälta mjuk agar i ett 60 ° C vattenbad före användning. Med hjälp av en steril serologisk pipett, överföring 3 ml mjuk agar till en steril kultur rör. Returnera odlingsrör till vattenbad för att bibehålla i ett smält tillstånd.
5. Att hälla overlay, först låta den smälta agar svalna (det ska kännas varm men inte het att röra), men tillåter inte att stelna.
6. I en steril huva, ympa 100 pltestaren stammen kultur i mjuk agar och skaka för att blanda. Vrid kultur för hand 10-15 sek, häll sedan på en botten agar (KB agar). Luta plattan i alla riktningar för att säkerställa en mjuk agar täcker jämnt botten agar.
   OBS: Botten agar kan vara vilken stelnade (1,5% agar) medium på vilket teststammen växer kraftigt. För en standard 100 mm diameter petriskål, använda ~ 20 ml smält medium. Botten agar kan framställas flera veckor i förväg (om den bibehålls vid 4 ° C utan torkning) eller kan framställas på samma dag. Om beredd samma dag som utför overlay, är det bäst att göra så före steg 3,4.
7. Täck plattan och låt den 20-30 min för att stelna. Var noga med att inte störa plattan medan stelnar.
8. När stelnat, spot 2-5 pl av supernatanten (genereras i avsnitt 1 och 2, ovan) på överlägget. Tillåta plattorna att inkubera över natten vid rumstemperatur. Observera och rekordresultat följande morgon.
   OBS: Detkan vara användbara för att utföra och dekor från en serieutspädning av den överstående lösningen. Detta gör det möjligt för forskare att skilja mellan bakteriofager och bakteriocin clearingverksamhet. I detta fall är det rekommenderat att utföra en: 5 eller 1:10 utspädningar.

Representative Results

Kombinationen av den mjuka agar och PEG-utfällning kan användas för att identifiera och karakterisera olika antimikrobiella medel som produceras av samma stam. Figur 1 visar två stammar av P. syringae (A och B) som hämmas av en tredje stam av samma art. De två stammarna är emellertid inhiberas av olika bakteriociner. Clearing zon på stam A uppvisar en skarp kant, medan clearingzonen på stam B är större, och uppvisar en icke-skarp gräns. Genetiska manipulationer inom producerande stammen som specifikt inaktiverar antingen tailocin (tailocin bristfällig) eller lågmolekylärt bakteriedödande (bakteriocin bristfällig) bekräftar att stammarna A och B är känsliga för olika bakteriociner. Figur 2 visar att bakteriofag-förmedlat dödande kan skiljas från andra icke-replikativa antimikrobiella medel genom att jämföra en spädningsserie. Eftersom båda bakteriociner ochprofag kan induceras av mitomycin C-behandling, kan verksamheten i dessa två agenter liknar varandra (särskilt om den aktiverade fag är riklig). I fallet med bakteriofag-medierad clearing, kommer spädning av supernatanten lösa upp i enskilda plack (radera zoner) medan bakteriocin-medierad clearing inte kommer att lösa in i sådana plack.

Figur 1: Fenotypisk åtskillnad av flera antimikrobiella medel som produceras av samma stam. Stam A är känsligt för en högmolekylär bakteriocin (tailocin) men inte något alternativ med låg molekylvikt bakteriocin, vilket framgår av bristen på clearing i tailocin fattiga stammen, men inte bakteriocinet fattiga stammen. Omvänt är stam B okänslig för tailocin, men är känslig för den lågmolekylära bakteriocin. Den tailocin är efficiently återvinnas efter PEG-utfällning, medan lägre molekylvikt bakteriociner inte. WT = vild typ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Skilja mellan icke-replikativa antimikrobiella och bakteriofager. (A) Utspädning av en hög titer av bakteriofager resultat i enskilda plack som blir mindre talrika (hög titer topp, låg titer botten). (B) Utspädning av bakteriociner resulterar i likformigt mindre clearing som inte löser in enskilda plack. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Mjuk-agar teknik som beskrivs här har i stor utsträckning under många årtionden av forskare som är intresserade av bakteriofager eller bakteriociner. De främsta fördelarna med denna metod är att det är enkelt, billigt och relativt lätt att tolka. Genom att kombinera den mjuka agar med PEG-fällning och serieutspädning kan antimikrobiella medel delas upp i höga kontra lågmolekylära medel, och replikativa kontra icke-replika medel (dvs. bakteriofag vs tailocin, respektive). Slutligen, inkorporering av riktad genetisk manipulation (radering och komplettering) av förmodade bakteriocin eller profag loci kan förankra identiteten hos en given antagonistisk förening. Vi har nyligen använt denna metod för att beskriva en ny bakteriofag härrörande bakteriocin vanligare bland Pseudomonas syringae stammar ^9.

Tillväxt media och villkor som anges i detta protokoll fungerar bra för Pseudomonas syringae och sannolikt skulle räcka för andra gramnegativa bakterier som växer kraftigt under dessa betingelser. Dock kommer forskare som använder den här metoden vill optimera tidpunkten, odlingsmedium, induktion metod, och inkubationstemperaturen för deras system. De kritiska parametrar inkluderar förmå producerande kulturen samtidigt i den logaritmiska tillväxtfasen, liksom sådd mjuk-agar med tillräcklig logaritmisk fas kultur för att säkerställa en enhetlig bakteriell fördelning, men inte överdriven kultur, som kommer att skymma eventuella clearingzonerna. Det finns många bakteriociner som inte induceras som en del av SOS svar, utan snarare induceras genom peptidbaserade quorum sensing system (i synnerhet grampositiva bakteriociner ^15), på så sätt, kan en forskare vill att screena flera olika induktions metoder (såsom modifiera näringsinnehållet i inducerande medium, eller gör det möjligt för utökad inkubation av producerande stam).

vid användning avdenna teknik, måste den mjuka agar overlay noggrant smält och hölls vid 55-60 ° C före tillsatsen av sådd-stammen. Vi har haft flera experiment där den mjuka agar inte grundligt smälta (även visuellt det verkade vara) och resulterade i ett överlägg med en kornig utseende. Resultat från en kornig overlay kan fortfarande vara allmänt tolkningsbar, dock är detta beroende av styrkan av hämningen (svagare hämning kommer att bli svårare att observera). En slutlig, confounding variabel att beakta när man med den här tekniken är att temperaturen hos den smälta ägarn får tillräcklig tid för att svalna före inokulering med sådd-stammen, för att undvika att döda den seeding stam. För att undvika detta problem, vi säkerställa mjuk agar är varm, men inte het, att röra. Längs dessa linjer, har vi också observerat att om vi ger otillräcklig tid för en sådd kultur anpassa sig till den smälta agar, före upphällningen overlay, återhämta vi i allmänhet dålig bakterie gTILLVÄXT, vilket gör tolkningen av specifik inhibering svåra eller omöjliga att tolka. Detta är anledningen till att vi möjliggöra ytterligare 10-15 sekunder inkubation mellan vortexa och hälla overlay. Avvägningen mellan att upprätthålla agar i en helt smält tillstånd (varmare är bättre) men inte dödlig för sådd stam (varmare är inte bättre) är en som sannolikt kommer att behöva bestämmas av en forskare genom trial and error.

Om en PEG-utfällningssteg används, skulle det vara fördelaktigt att inkludera en negativ kontroll där en steril buljongmedium bearbetas identiskt med kultursupernatanten. Detta kommer att säkerställa att döda aktiviteten är inte resultatet av kvarvarande PEG eller kloroform i provvätskan.

Eftersom både bakteriofager och bakteriociner tenderar att vara mycket specifika, är det inte ovanligt att stöta på någon uppenbar dödande aktivitet med en given kombination av stammar. Detta kan bero på en mängd olika stamspecifika reresistansen mekanismer, en är att teststammen antingen saknar eller har en okänd version av receptorn som krävs för inriktning av en viss bakteriocin eller bakteriofag.

En alternativ metod, har bakteriocin screeningsmetod beskrivits av Kawai et al. , Men lider av nackdelar och har inte fått stor spridning ^16. Specifikt kräver denna teknik att observera buljongprover vid tidsintervall som kan vara betungande, och inte tillåter diskriminering mellan bakteriofag-härledda och bakteriocin härrörande dödande aktiviteter.

De huvudsakliga begränsningar av denna teknik är att den inte är väl lämpad för organismer som inte växer kraftigt (och därmed kommer att sakna lätt urskiljbara clearingzoner) eller att hamnprofager eller bakteriociner som inte är kraftigt produceras under laboratorieförhållanden. Anpassning av denna teknik för att upptäcka bakteriociner som produceras i miljöprover skulle både expandera verktygetav denna teknik och underlätta större insikt i rollen av bakteriociner inom naturliga inställningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin C	Santa Cruz Biotechnology	sc-3514	Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.
Chloroform	Sigma-Aldrich	34854	Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.
Polyethylene Glycol (PEG)	Amresco	0159
Bacteriological grade agar	Genesee Scientific	20-274