Summary
我们已经建立了使用LC-MS / MS系统共同调节相互作用蛋白的纯化的方法。
Introduction
蛋白质 - 蛋白质相互作用发挥多种生物学功能中起重要作用。正因为如此，这些相互作用已牵涉信号转导;跨细胞膜蛋白质运输;细胞的新陈代谢;和几个核过程，包括DNA复制，DNA损伤修复，重组和转录1，2，3，4。查明参与这些相互作用蛋白质因此，推进我们的这些细胞过程的理解是至关重要的。
免疫沉淀（IP）是用于分析蛋白质 - 蛋白质相互作用经过验证的技术。为了便于共同免疫沉淀的蛋白的鉴定，质谱常常利用5，6，7，8，9。通过用抗体靶向的蛋白复合物的公知的部件，它是可以分离的蛋白复合物，并随后经由质谱分析确定其未知组分。 ARIP4（雄激素受体相互作用蛋白4），一个转录coregulator，核受体蛋白以激活或在一个依赖于上下文的方式9,10抑制其靶启动子相互作用。为了更好地了解控制这些核因子的转录调控机制，我们描述了一个全面的方法来净化和使用LC-MS / MS系统识别ARIP4相互作用的蛋白质。
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Protocol
1.转
- 种子在100毫米培养皿（2×10 6个细胞/皿）HEK293细胞。培养在补充有10％胎牛血清，100μg/ ml的链霉素和100单位/ ml青霉素的细胞在Dulbecco改进的Eagle氏培养基。孵育在加湿培养箱将细胞在5％CO 2和37℃。
- 第二天，转染细胞10微克FLAG标记ARIP4质粒按照制造商的指示11，用40微升转染试剂用。
2.蛋白提取
- 约36小时转染后，立即用冰冷的PBS将细胞并使用刮刀收获细胞。转移细胞到1.5 mltube并在4℃下以8000 xg离心离心它为2分钟。吸出上清，重悬细胞沉淀在5×0.4米氯化钾缓冲的沉淀量（高盐缓冲液：20毫摩尔的Tris-HCl（pH为8.0），0.4M氯化钾，5mM的MgCl 2的，10％甘油，0.1％NP-40，10毫B-巯基乙醇，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。旋转该混合物在4℃下20分钟。
- 离心管中，在17700 XG在4℃下10分钟。
- 上清液（全细胞提取物）转移到新的2毫升管中，并添加3×0米氯化钾缓冲的初始体积（稀释缓冲液：20毫摩尔的Tris-HCl（pH值8.0），5mM的MgCl 2的，10％甘油， 0.1％的NP-40，10毫β巯基乙醇，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。
- 执行另一个离心（17700×g离心4℃10分钟），上清液（全细胞提取物）转移到新的2ml管中。
3.免疫沉淀
- 在离心（2.4），洗50微升用PBS抗FLAG珠，0.1M甘氨酸 - 盐酸盐，然后的1M Tris盐酸，然后洗涤两次，用0.1M氯化钾缓冲液（低盐缓冲液：20毫摩尔三 - 盐酸（pH值8.0），0.1M氯化钾，5mM的氯化镁，10％甘油，0.1％NP-40，10μMM B巯基乙醇，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。此洗涤过程中离心分离是在2000 xg离心在4℃下进行1分钟。
- 混合50微升FLAG珠与全细胞提取物，并在2-4℃（从步骤2.4全细胞提取物的1％也应保持在-80℃以供将来使用轻轻旋转混合物4小时为输入）。
- 样品转移到微离心柱（重力下降）。保持流通在1.5ml管中，利用液氮冷冻，然后将其存储在-80℃下（检查输入和用Western印迹分析的流通的蛋白水平）。
- 加入1 ml 0.1米氯化钾缓冲液（低盐缓冲液）的洗FLAG珠（重力下降）。
- 重复步骤3.4至少四次（对总共五个洗涤）。
4.洗脱
- 放置柱到1.5毫升管，并在2000 xg离心离心它为1分钟;珠会干。
- 盖的底列。
- 添加50微升（等于FLAG珠的体积）0.1M甘氨酸 - 盐酸（pH值2.5）的。
- 轻轻晃动，在室温下10分钟的混合物。
- 放置柱到一个新的1.5毫升管，并在2000 xg离心离心它为1分钟。
- 洗脱溶液与10微升的1M的Tris-HCl（pH 8.0）中的中和;通过移液或者通过使用涡旋机拌匀。
5.烷基化和胰蛋白酶消化
- 添加100mM的NH 4 HCO 3，10微升CH 3 CN的，和2μl的二硫苏糖醇的混合物（112微升总体积）的50微升。
- 在56℃孵育样品30分钟。
- 放置在室温下的样品10分钟。
- 添加10微升333毫摩尔的碘乙酰胺的样品，并在37°C孵育它在黑暗中30分钟。
- 添加胰蛋白酶的10微升（33纳克/微升）到混合物中，并在37℃过夜孵育它。
- 以下过夜胰蛋白酶，运到最终产品的LC-MS / MS设施或用于分析12第三方质谱实验室。
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Representative Results
我们确定了一个强烈的信号ARIP4，约160千道尔顿，以及那些一个模拟采样控制等几个未知的蛋白质（ 图1）。 LC-MS / MS分析，鉴定两ARIP4复杂肽和FLAG珠（ 表1）的级分中的潜在的肽辅因子。 P62（Sequestosome1），公知的辅因子ARIP4 11中的分析（ 表1），这证实了本系统11的功效被确定。我们还确定了与ARIP4互动其它许多以往报道的蛋白质。以这种方式，SUMO2 10和DryK 13经由LC-MS / MS分析进行检测。 ARIP4肽使用LC-MS / MS分析，这表明该IP是高品质也确定。总体而言，LC-MS / MS技术是可以用于识别未知核事件链接的强大工具编到蛋白质 - 蛋白质相互作用。全面质量分析结果将根据要求提供。
图1：ARIP4配合物的净化。 FLAG表位标记的ARIP4的银染（ARIP4-F），在HEK293细胞和免疫沉淀表达与特定FLAG抗体。纯化的蛋白用凝胶电泳分离并用银染色显示。作为对照，对HEK293细胞不表达外源蛋白质，进行一个模拟纯化。分子量标准显示在左侧。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：辨识新型ARIP4结合蛋白氮。结合到纯化的蛋白质复合物FLAG珠通过基于胰蛋白酶消化解离。用LC-MS / MS分析这些蛋白质随后鉴定。使用SWISS-PROT数据库和MASCOT软件在LC-MS / MS数据进行分析。肽的数量和这些蛋白质的身份被示出。只选择与显著MASCOT评分（P <0.05）的蛋白质。
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Discussion
有效转染是必不可少的获得与该协议的成功的结果。因此，我们建议您使用Western blot分析，以确定免疫沉淀的FLAG标签的蛋白质水平。这个步骤允许用户以验证他们感兴趣的蛋白被正确过度表达，此外，该IP被成功执行。 FLAG标签的蛋白质水平也应之前的质谱分析进行检查。
有模拟样本应该被用作阴性对照，以避免得到假阳性结果，并以鉴别从真相互作用的背景。此外，研究人类蛋白质时，实验应在相对干净的环境（ 例如，洁净室）中进行，以避免污染。虽然具有高盐浓度（0.3-0.4 M）的蛋白质提取缓冲液可被偶尔用于提取核蛋白，具有0.1-0.15 1M盐的浓度的IP缓冲液是大多数十大推荐。这使得IP步骤而不破坏蛋白质 - 蛋白质相互作用进行。为了进一步减少背景信号，磁珠可以用于纯化过程。同样重要的是，优化了细胞裂解条件，以降低假阳性结果。
在这项研究中相对于其它技术所描述的方法的显着性（基于消化例如，在凝胶单一蛋白识别）5，10，11是它允许用户为高通量鉴定进行LC-MS / MS分析核辅助因子及其结合合作伙伴之间的蛋白相互作用。转录的基因调控是高度依赖于序列特异性DNA结合蛋白的合作。因此，转录因子通常具有大量的辅因子相互作用，以改变靶基因的表达。钍 erefore，以更好地理解这些管理机制转录，确定促进靶蛋白的活性是最重要的转录合作伙伴的细胞活动。我们的方法允许用户通过他们感兴趣的转录因子快速识别假定核辅助因子，并进一步加强了我们的转录调控机制的认识。
FLAG肽也可被用来代替0.1M甘氨酸 - 盐酸溶液（pH 2.5）中洗脱过程。然而，如果采用此变形例中，用于稀释FLAG肽的缓冲液的pH应被监控。 3X FLAG肽也应该用于从FLAG珠洗脱蛋白。因此，具有相对高的pH值的溶液，应使用以稀释这些修饰的条件下，FLAG肽。它也至关重要，以避免以保持适当的蛋白质 - 蛋白质相互作用的样品的反复冻融。
t“的>有时，胰蛋白酶消化过程的优化，可能还需要用于提高蛋白质相互作用筛选结果的准确性。虽然在LC-MS / MS法是可以用来识别核之间的相互作用的工具蛋白质，它的局限性之一是，它不提供关于该蛋白质复合物的装配准确的信息。为了提高复合体稳定性，化学交联处理可以使用14。作为另一种方法，毛细管电泳-质谱/质谱也是有用的15 。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
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