Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

doi: 10.3791/55108 Published: October 21, 2017
* These authors contributed equally

Summary

İskemik inme astrocytes etkilenen beyin bölgesi için belirli katkısını oksijen glikoz yetmezliği (OGD) maruz bir karmaşık olay çalışmaya zor olduğu. Bu makalede izole astrocytes elde etmek ve onların reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı OGD koşullar altında çalışma için bir metodoloji tanıtılmaktadır.

Abstract

İskemik inme trombüsü veya kan akımı beyin bölümlerine tıkayan embolinin kaynaklanan bir karmaşık beyin hasarı var. Bu oksijen ve enerji yetmezliği ve nöronal ölüm nedenleri glikoz yoksunluğu için yol açar. İskemik inme hakaret sonra astrocytes reaktif olmak ve bu geliştikçe yaralanma sitenin etrafına çoğalırlar. Bu senaryoda, astrocytes iskemi için maruz beyin bölgesi için belirli katkısını çalışma zordur. Bu nedenle, bu makalede birincil astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı oksijen glikoz yetmezliği (OGD) adı verilen bir iskemi gibi ortamının bir vitro modeli altında çalışmaya bir metodoloji tanıtılmaktadır. Astrocytes 1-4 gün izole-eski yenidoğan fareler ve non-spesifik astrositik hücre sayısı değerlendirildi astrocyte seçici marker gliyal Fibrillary asidik Protein (GFAP'nin) ve nükleer boyama kullanarak. Onlar maruz kalan oksijen yüzdesi yanı sıra astrocytes OGD koşuluna tabi olan dönem özelleştirilebilir. Hücre içinde vitrofarklı grupları iskemik benzeri durumda süresince ayırdetmek bilim adamları bu esneklik sağlar. Bu makalede astrocyte reaktivite, Hipertrofik morfoloji ve Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA) kullanarak ayirt tarafından ölçülen yaygın neden zaman dilimleri OGD, anlatılmaktadır. Hızla çoğalmak, yanı sıra astrocytes enerji ve oksidatif stres geçmesi ve çözünür faktörler cep orta serbest bırakarak OGD için yanıt. Bu orta toplanan ve moleküller hücre hücre etkileşimi olmadan birincil nöronal kültürde astrocytes tarafından yayımlanan etkilerini çözümlemek için kullanılır. Özet olarak, bu birincil hücre kültür model verimli bir şekilde yaralanması üzerine izole astrocytes rolünü anlamak için kullanılabilir.

Introduction

Kontur "bir akut nörolojik disfonksiyon vasküler kökenli ani veya hızlı geliştirme belirti ve bulguları, karşılık gelen beyin Fokal alanlarda katılımı ile"1,2olarak tanımlanır. Kontur iki tür vardır: Hemorajik ve iskemik. Vasküler disfonksiyon ya beyin kanaması veya posterior bir arter rüptürü ile zayıflaması tarafından eşlik arteriyovenöz bir arıza neden olduğu bu, çoğu durumda, ölüme götürecek hemorajik inme3 olarak adlandırılır. Bir trombüsü veya bir pıhtısı kan akışını engelleyen, oksijen ve glikoz bir beyin bölgesine geçici bir yoksunluk neden iskemik inme4denir. Hücrelerin etkilenen bölge veya iskemik çekirdek liderlerine homeostatik ve metabolik dengesizlik, enerjik disfonksiyon, nöronal ölüm ve inflamasyon5yaşam boyu Engelli hastalar6tetikleyebilir, etrafında beslemek için hata oluştu.

İskemik inme hücrelerin bu tepki ve uygulamak etkileri farklı zaman noktalarda çeşitli türleri içeren multifaktöriyel bir yaralanma olduğunu. Çok etkileşimleri tek tek hücreler davranışını çalışmaya zor bir ortam oluşturun. Yani, bir belirli hücre türü'nün altında karmaşık bir ortam katkısını nasıl çalışıyoruz? Bir kabul edilen vitro modeli iskemi hücrelere oksijen ve glikoz yoksunluk (OGD), açığa belirli bir süre için bir normoxic ortamına hücreleri restorasyon tarafından takip oluşur. Bu sistem tarafından kan reperfüzyon takip bir iskemik inme taklit eder. Bu yöntemde, hücre ve dokulara oksijen kullanarak özel bir hipoksik odası, tasfiye bir ortamda glikoz-Ücretsiz medya maruz kalır. OGD kuluçka süresi birkaç dakika 24'e kadar s hipotezini test edilecek istiyor bağlı olarak değişebilir. Çalışmalar bu OGD kez bağlı olarak göstermiştir ve normoxic çevre, inme (Yani, akut veya Subkronik) belirli fenotipleri elde edilebilir. Normoxic koşulları, posterior restorasyon ile OGD için maruz birincil izole astrocytes kontur tüp bebek7taklit etmek için iyi çalışılmış bir hücresel model var. OGD izole hücreler bir inme benzeri ortamı altında bağımsız moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak mümkündür.

Astrocyte Biyoloji ile ilgili bilgilerimizi arttıkça, onlar sinapslarda Bakımı ve sinirsel tamir, geliştirme ve plastisite8sürdürülmesi için çok önemli olduğunu belirgin olmuştur. Normal şartlarda astrocytes yayın ve sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri ve gliotransmitters metabolik denge ve homeostasis sinapslarda5,9içinde tutmak, yanıtlar. İskemik inme gibi akut neuroinflammation içinde bu hücreler reaktif olmak, uzun vadeli overexpression, gliyal Fibrillary asidik Protein (GFAP'nin) gösterebilir ve onların morfolojisi5,10', hipertrofisi göster 11 , 12. iskemik enfarktüsü geliştikçe, astrocytes tarafından sağlanan homeostazı etkilenen olur, normal Glutamat alımı, enerji metabolizması, etkin moleküller ve antioksidan aktivite13değişimi ile ilgili.

Doğru lesioned alan14lökosit göç ederken yeniden etkinleştirilen astrocytes etrafında enfarktüsü doku çoğalırlar. Astrositik yayılması Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA), Ki67 ve bromodeoxyuridine (BrdU)15gibi işaretçileri kullanarak ölçülebilir. Bu proliferatif yanıt Saat-bağımlı bir şekilde oluşturulur ve gliyal yara, bir yaralanma9sonra bozuk sitesini parankimi boyunca geri dönüşümsüz reaktif astrocytes dizisi oluşturan yardımcı olur. Bu yara izi ilk işlevleri bu bölgeden bağışıklık hücre ekstravazasyonu kısıtlamaktır. Ancak, çalışmalar yara izi genişletmek, aksonlar büyüme inhibe moleküller serbest olarak ve yaralı alan16uzanan aksonlar engelleyen fiziksel bir bariyer oluşturmak aksonlar için fiziksel bir engeli olur göstermiştir. Yine de, bir omurilik yaralanması sonra tamamen gliyal yara oluşumu engelleyen aksonlar17rejenerasyon zarar olabilir olduğunu gösteren bilimsel kanıt. Böylece, belirli astrositik tepki ölçülür, okudu yaralanma framework düşünülmelidir bağlamında.

Sunulan metodoloji astrocytes bireyselleştirilmiş fonksiyonu oksijen glikoz yoksunluğu sonra eğitim için uygulanabilir ve araştırmacı cevap istiyor soruları bağlı olarak değiştirilebilir. Örneğin, morfolojik değişiklik ve farklı OGD zamanlarda ifade işaretleri yanı sıra, OGD için maruz astrocytes üzerinden supernatants daha fazla çözünür faktörler veya bu hücreler tarafından serbest şartına bir medya olarak değerlendirmek için kullanılan belirlemek için analiz edilebilir, diğer beyin hücreleri yürürlükte. Bu yaklaşım yöneten ve onların yanıt bir iskemik inme senaryo olarak modüle faktörler aydınlatma yol açabilecek astrocyte reaktivite çalışmaları sağlar.

Protocol

doğum sonrası fareler (Sprague Dawley) 1-4 gün eski cortices izole etmek için kullanılır. Ötenazi işten çıkarma, NIH kurallar tarafından onaylanmış yöntemidir.

1. cerrahi için malzeme ve aletler hazırlık

  1. bir otoklav içinde Sterilize cihazları (sıcaklık: 121 ºC, basınç: 15 psi, Saat: 30 dakika) metal bir kutu ya da bir anlık sterilizasyon çanta mühürleme kullanarak. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.

2. DMEM hazırlık tamamlamak

  1. Dulbecco autoclaved 700 mL su içeren bir 1 litre kabı içinde eklemek ' s modifiye kartal ' s orta toz oda sıcaklığında.
  2. Çözüm bir manyetik karıştırıcı ile karıştırılır 3.7 g/L sodyum bikarbonat, eklemek.
  3. Ayar pH 7.4, autoclaved su ile Cilt 1 L getirin, sonra filtre. İstediğiniz birimin %10 FBS ve % 1 ile medya kültür amaçlı ek penisilin/streptomisin ve 37 ˚C, sıcak. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.
    Not: PH pH metre elektrot medya içine ekleme üzerinden 7,4 için ayarlandı. Medya gerekir karıştırma, sonra yavaş yavaş ekleyin bir damlalık kullanarak 1 M NaOH.

3. Birincil Astrocyte kültür

Not: tohum sonra hücre medya üç günde değiştirilmelidir ve hücreleri confluency (11-13 gün) en fazla yetiştirilen olabilir. Üçüncü gün, birkaç kez için Asansör mikroglial hücreleri ve oligodendrocyte progenitör hücre kültürü kapalı şişe dokunun, Tümünü Kaldır ' eski ' medya, iki kez 10 mL PBS kullanarak yıkayın, PBS Aspire edin, sonra taze yeni medya nesnesi. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.

  1. Yeni doğan sıçan beyin diseksiyon
    1. gerçekleştir diseksiyon bir doku kültürü Hood. 1-4 gün (2 sıçan beyin 75 cm 2 şişe kullanılır) eski yeni doğmuş fare pups edinin.
    2. Üç 60 mm petri yemekler hazırlamak ve 5 mL her tam DMEM de pipet.
      Not: Aşağıdaki gibi ayrılabilir: #1 her fare için beyin, beyin tüm cortices ve #3 (olmadan meninkslerde) soyulmuş cortices için için #2.
    3. Yavru ve sprey % 70 etanol ile kavramak. O başını kesmek ve vücuttaki küçük biohazard atık konteyner atın.
    4. Mikro-anatomi cımbız kullanarak, kafa tutun ve cilt kafatasını ortaya çıkarmak için baş üstüne kesmek.
    5. İle başka bir çifti makas yapmak bir " T " kesi burun doğru kafatasının arkasından başlayarak. Forseps çifti kafatası yavaşça kaldırmak için kullanın.
    6. Maruz kalan beyin cımbız bir çift ile kaldırın ve beyin bir petri yemekleri daha önce orta ile dolu yerleştirin.
    7. Steril aletlerin başka bir set için sonraki adımları kullanın.
    8. Mikro-anatomi forseps 60 mm petri kabına ters kapağını yavaşça bir beyin eklemenizi sağlar. Petri kabına steril gazlı bez yerleştirildiğinde, beyin açıkça görüntülemek mümkündür ve incelemek daha kolaydır.
    9. Beyin mikro-anatomi Forseps ile sakin ve yavaşça orta çizgi çatlak keskin sonuna mikro-anatomi Forseps ile alay tarafından serebral hemisfer ayrı.
    10. Deflect ve beyaz madde bırakarak cortices kabuğu ve daha önce #2 etiketli bir petri kabına için aktarabilirsiniz. #2 etiketli petri kabına bütün disseke cortices birleştirerek tüm beyin için yordamı yineleyin.
    11. Hipokampus her korteks altında çıkar ve bunu atma
    12. Mikro-anatomi cımbız ve 60 mm petri hafifçe kabuğu zarları bireysel kortikal loblar üzerinden kullanmak ve #3 etiketli petri kabına koyun.
  2. Doku ayrılma: homogenizer blender yöntemi
    1. doku/orta süspansiyon (soyulmuş cortices beyin) steril blender torba içine dökün ve Toplam hacim çantada 5 mL getirmek için yeterli orta ekleyin.
    2. Çanta çanta yaklaşık 2 cm yukarıda kapalı kapı görünür bırakarak homogenizer blender içine koyun. Hücre ayrışma sırasında yüksek hızda 2.5 min yapılır.
      Not: Alternatif olarak, bu çantayı kapatma ve yavaşça başlıklı bir ölçek ile vurma tarafından yapılabilir. Bir bez çanta ve kabı arasında sürtünme önlemek için kullandığınızdan emin olun.
    3. Hücre süspansiyon bir sayı 60 mesh elek dökün ve yerçekimi tarafından filtre uygulamak izin 100 numaralı elek üzerine aracılığıyla akış filtre uygulanmış dökün.
    4. Kullanarak 15 mL tüpler, santrifüj kapasitesi 200 x g 5 dakika süreyle klinik santrifüj (tercihen salıncak kova rotor) içinde de hücre süspansiyon
    5. Kapalı bir ölçek süpernatant dökün, sonra serolojik pipet kullanarak yeniden askıya alma ve en fazla 5 mL medya de hücrelerde Pelet ayırmak.
  3. Hücre sayımı
    1. bir micropipette ile hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 100 µL toplayabilir ve trypan mavi 100 µL ekleyebilir.
    2. Hemasitometre içinde toplanan süspansiyon 10 µL takın ve meydanın dört köşesine uygun tüm hücreleri saymak.
    3. Şişeler hazırlamadan önce hücreleri yoğunluğunu hesaplamak için formüller şunlardır:
      Equation 1
      Equation 2
    4. 25 cm 2 şişe başına en az 500.000 hücreleri ekleyin. DMEM 5 mL her şişeyi içine kadar pipet. Karışım şişeye boyun ulaşmak gerekir. 3 gün boyunca %5 CO 2, 37 ° C kuluçka koyup, sonra medya değiştirin.
  4. Astrocyte arıtma teknikleri: medya değiştirmek, mekanik ve kimyasal stratejileri
    Not: diğer hücre türlerine göre astrocytes metabolizma hızı yüksektir, bu nedenle, beslenme koşullar, bu hücreler bir kaç gün sonra düşük sağkalım oranları göstermek yoksun. Astrocytes, aksine microglia tarafından besin yoksunluğu etkilenmez ve bu tür ortamlar 18 ' çoğalırlar. Mikroglial sayısı azaltılmış korumak için yazarlar her 3 günde astroglial hücre kültür ortamı değiştirin. Bu sürekli bir değişim hücre medyada da astrositik hücre monolayer şişesi 19 üstüne büyüyebilir mikroglial nüfus azalır.
    1. Kullanımı bir Pasteur pipet medya yapışık olmayan mikroglial hücrelerden her biri şişeler ile Aspire edin. Herhangi bir enkaz yaptı dropwise bir şekilde (5 mL/şişesi) steril filtre PBS her şişeler kullanarak arkasında yıkama.
    2. Steril filtre DMEM (ile sığır serum antibiyotik ve fetal) dropwise her şişeyi (5 mL/şişesi) ekleyin. Tüm yüzey kapsayacak şekilde dairesel hareketlerle hafifçe kışkırtmak.
    3. Bir 37 hücrelerde yer ve#176; 8-10 şişe confluency ulaşana kadar gün için % 5 CO 2 C İnkübatör (> % 95 plaka kapsama).
      Not: Birkaç protokol astrocytes confluency ulaştığınızda, 2 kültür 24 h, sallayarak gibi mekanik yöntemleri, yol üstünde tepe-in bu astrocytes, esas olarak microglia ve öncü hücreleri yalan hücreleri dekolmanı göstermiştir 19 , 20.
    4. Sigara astrositik hücre kültüründe 30 dk için 180 RPM yörünge sallayarak gerçekleştirerek azaltılır. Hücrelerin içinde süpernatant kaldırdıktan sonra taze medya şişeye (~ 15 mL) pipetted.
    5. Oligodendrocyte progenitör hücrelerin ortadan kaldırmak için
    6. 6 h 21 , 22 , 23, aspiratı süpernatant ve damlalıklı taze medya için 200 d/d sallama hızını artırın.
      Not: Microglia kültürlerde varlığı azaltmak için iki kimyasal yöntem ardışık olarak kullanılabilir (aynı anda) birincil hücre kültür yöntembilim: arabinoz sitozin (Ara-C) ve L-lösin metil ester (LME) 24.
    7. Hücre confluency (% 100) ulaştığınız zaman hemen 3-4 gün microglia, mekanik çıkarıldıktan sonra bu hücreler antimitotic bileşik arabinoz sitozin (Ara-C) 8 µM ile DMEM içinde 5 gün (değişikliği DMEM taze Ara-C günlük) tedavi edilebilir.
      Not: Bu bileşik hızla bölen hücreleri microglia 19 , 25 ve fibroblastlar gibi sayısını azaltır antimitotic bir ilaç, Ara-C eklemek için zaman noktası kritik olduğu için 26 . Microglia aksine, konfluent ne zaman, astrocytes durmak via temas inhibisyonu 27 Proliferasyona.
    8. Ara-C tedaviden kurtarmak hücreler için 2 gün izin.
    9. Confluency, hücre ulaştıktan sonra daha da mikroglial kirliliği azaltmak için pH 7.4, 37 ˚C 1 h için sabit DMEM L-lösin metil ester (LME) 50 mM kullanın.
      Not: LME hücre ve organelleri membran aşar ve hidrolize sonra üretilen L lösin bu hücrelerde organellerin içinde birikir. Bu amino asit birikimi bir ozmotik şişlik ve rüptür organellerin 28 , 29 yol açar. LME diğer hücreleri 20 , 30 ' a göre microglia, ortadan kaldırarak son derece etkili.

4. Astrocytes 6-şey tabak içinde yetiştirilmesi

  1. kaplama coverslips Poli-D-lisin ile
    1. sonra her 35 mm petri kabına seyreltilmiş Poly-D-lizin çözüm her coverslip için 100 µL ekleyin ve 1 h. bekleyin yerine bir coverslip
    2. Poli-D-lizin kaldırmak ve iki kez 2 mL steril su ile yıka.
    3. Su kaldırmak ve coverslips kapağın içinde kurumasını bekleyin. Coverslips-20 ° c ilâ iki hafta için mağaza.
      Not: Don seyreltilmiş Poly-D-lizin eriyik; iki haftaya kadar saklanabilir.
  2. Trypsinization
    1. bir Pasteur pipet kullanarak şişeler ortamından Aspire edin. 5 mL/şişesi yavaşça hücreleri durulama için PBS steril süzülmüş ekleyin.
    2. Aspiratı PBS kapalı ve 5 mL/şişesi % 0.25 tripsin ve 0,5 mM EDTA çözüm steril süzülmüş ekleyin. 37 ˚C, % 5 CO 2 kuluçka 10 dakika süreyle şişeye koyun
      Not: Hücreleri kuluçka iken, 5 mL/şişesi taze tam DMEM 37, sıcak ° C.
    3. Sonra 10 dk, kuluçka, tahrik tüm hücreleri şişesi kaldırdı emin olmak için. 5 mL sıcak tam DMEM de her şişeyi tripsin etkisiz hale getirmek için hızlı bir şekilde eklemek.
    4. Yavaşça yukarı ve aşağı herhangi kadar kırmak için birkaç kez hücreleri pipette " kümeleri ". Askıya alınan hücreleri iki şişe 15 mL konik santrifüj tüpü transfer.
    5. Hücre Pelet toplamak için
    6. santrifüj 200 x 5 min için g. Pelet orta 500 µL içinde yeniden askıya alma ve şişeler içinde hücreleri yerleştirmek için devam.
      Not: Hücrelerle yapılacak analizler örnekleri: 1) gen ekspresyonu; analiz etmek için ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) 2) protein ifade değerlendirilemiyor Western blot; 3) Akış Sitometresi Analizi nöral progenitör hücre sayısı ve proteinler ilgi ölçmek için; 4) protein ifade ve yerelleştirme çözümlemek için ayirt.
  3. Tohumlama astrocytes
    1. sonra tripsin ile birincil astrocytes tedavi (4.2 için bakın), hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 100 μL toplamak ve % 0.5 trypan mavi 100 μL ekleyin.
    2. Ekleyin 10 μL trypan toplanan süspansiyon mavi için hemasitometre ve uygun tüm hücreleri saymak.
    3. Formüller adım 3.3 şişeler hazırlamadan önce hücreleri yoğunluğunu hesaplamak için kullanın.
    4. Bir steril ekleyerek
    5. hazırla çok iyi yemekler, Poli-D-lizin coverslip her şey için kaplı. 50.000 hücreleri pipette ve taze orta (yaklaşık 2 mL) ile çok iyi her yemeğin hacmindeki geri kalanını doldurun.
    6. Çok iyi yemekler 37 ˚C kuluçka %5 CO 2 içine koyun ve 5-7 gün sonra astrocytes olabilir büyümek ve coverslips tüm yüzeyine kapak.

5. OGD protokolü için birincil Astrocytes

  1. OGD orta hazırlık
    1. ek Dulbecco ' s modifiye kartal ' s orta-Alerjik glikoz 3.7 g/L sodyum bikarbonat ve % 1 ile penisilin/streptomisin. Tablo 4 malzemelerinde bkz:.
    2. Tasfiye glikoz ücretsiz orta 20 mL % 95'i N 2 / %5 köpüren tarafından CO 2 min bir akışı 15 L / (debimetre ile belirtilir) ortamda gaz sistemi için serolojik pipet ekleyerek, 10 dk için.
      Not: Oksijen orta tasfiye sonra pH 7,4 (adım 2.1 nota bakın) adlı ayarlayın.
    3. Filtre 50 mL tüp filtre sistemi kullanılarak silinen glikoz-Alerjik orta.
      Not: Taze OGD orta köpüren ile % 95'i N 2 / %5 her deneme için yapmak, hücreleri oksijen tasfiye bir ortama maruz kalır emin olmak için kullanmadan önce CO 2.
  2. Deneysel bir işlem
    1. doku kültürü başlık içinde önceden hazırlanmış coverslips (4.3.5 adıma bakın) astrocyte medya kaldırmak ve herhangi bir glikoz hücreleri üzerinde iki kez kaldırmak için hücresel PBS ile yıkama.
    2. 2 mL OGD medya ekleyin Her şey ve çok iyi yemekler ile onların kapakları kapalı hipoksi odası içine yerleştirin
    3. Gaz karışımı giriş Vana bağlanmak ve çıkış vanası açık bırakın. Gaz karışımı % 95'i N 2 / %5 ile odası sifonu CO 2, 15 L/min 5 dakika süreyle
    4. Gaz akışını durdurmak ve ilk çıkış vanası üzerinde kelepçe kapatın, sonra gaz giriş Vana boru üzerinde kelepçe kapatın.
      Not: Sabunlu su ile odası ve mühür kapsayan hiçbir gaz kaçağı olduğundan emin olun. Mühür güvenli ise, hava kabarcığı yok oluşturmalıdır.
    5. Hücre kültür kuluçka 37 ° c 6 h OGD veya 1 h için tüm odası yerleştirin.
    6. Kuluçka süresi bittikten sonra OGD medya Aspire edin ve dikkatli bir şekilde normoxic için de her 4,67 cm 2 tam DMEM 2 mL damlalıklı işlemek 24 h

6. Birincil Astrocyte ayirt hazırlık için protokol

Not: astrocyte saflık değerlendirmek için nöronlar, microglia ve oligodendrocytes tarafından tespit edilebilir gibi farklı beyin hücresi türleri ayirt farklı hücre işaretçileri kullanarak. Nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri, PCNA ve propidium iyodür (PI) birincil astrocytes normoxic koşulları tarafından takip OGD maruz üzerinde kullanılabilir. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.

  1. Ayirt hazırlık
    Not: bu bir genel ayirt protokol, küçük değişiklikler (örneğin, uzun kuluçka dönemleri, en iyi bir sinyal elde etmek için gerçekleştirilen inkübasyon sıcaklığı). Her işareti Tablo 1-ebilmek var olmak kullanılmış üretici göre ' s protokolü.
      Hücre canlılığı, değerlendirmek için
    1. hücreleri ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe PI (tam DMEM içinde 5 mikron) ve yıkama iki kez 2 mL PBS için PI boyama gösteren 5 dk. daha az canlı hücrelerdir.
      Not: Kullanım hücreleri tedavi adım 5.2.6.
    2. PI boyama sonra hücreleri düzeltmek için
    3. ekleyin 2 mL % 4 formalin 4,67 cm 2 başına, 20 dk 4 ˚C az için. PCNA ile etiketli örnekleri için tercih edilen sabitleme metanol için 10 dk 4 ˚C az çözümdür.
      Uyarı: Formalin ve metanol zehirli.
      Not: Her zaman kontrol spesifik antikor her şirket iletişim kurallarından.
    4. Yıkama PBS 2 mL 5 min için hücrelerle ve 3 kez bu işlemi tekrarlayın.
    5. Çözüm engelleme hücreler kuluçkaya (% 0.5 iyonik olmayan yüzey aktif, % 10 PBS FBS) nazik sallayarak ile oda sıcaklığında 30 dk için.
    6. PBS 2 mL 5 min için hücrelerle yıka, yıkama 3 kez tekrarlayın.
    7. % 1'lik bir çözümde birincil antikor (PCNA, GFAP'nin) ile 4 ° C'de, gecede (16 h), kuluçkaya PBS FBS.
    8. Birincil antikor çözümü kaldırmak, PBS 2 mL 5 min için hücrelerle yıkayın ve 3 kez bu işlemi tekrarlayın.
    9. Incubate fluorophore % 1'lik bir çözümde ile Birleşik ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 h için PBS FBS.
    10. PBS 2 mL 5 min için hücrelerle yıka, 3 kez bu işlemi tekrarlayın. 1 µg/mL DAPI ekleyin (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) hücre çekirdeği leke 5 min için.
    11. Yıkama PBS 5 dk 2 mL hücrelerle, iki kez bu işlemi tekrarlayın ve PBS içinde devam.
    12. Coverslips montaj orta kullanma mikroskop Slayt üzerindeki hazırlayın.
  2. Confocal mikroskop
    1. mikroskobu ayarladıktan sonra coverslip yan mikroskop Sahne Alanı'nda yerleştirin.
    2. Yazılım kullanarak bir lazer ışını 543nm için GFAP'nin-Cy3 konjuge antikor adlı seçin.

7. Canlılığı tahlil hücre

  1. Trypsinize ve astrocytes numaralı adımları uygulayarak tarafından 4.3 ve 4.4 ölçmek.
  2. 1 x 10 4 hücreleri/iyi 96-şey tabakaları bana ekleyin ve onları confluency için büyümek.
  3. Adım 5 metodoloji kullanarak, her iki normoxic 1 h OGD kültürlü 96-şey tabak maruz veya 6 h OGD.
  4. Sonra OGD tedavi, normoxic medya 24 h için tüm hücrelere eklenir ve canlılığı MTT reaktif tahlil kullanılarak ölçülür (üretici firma olarak kullanmak ' s yönergeleri gösterir).
  5. Bir 5 mg/mL MTT çözümden her şey için toplam hacminin % 10 ekleyin ve 3 h 37 ˚C ile MTT reaktif için kuluçkaya.
  6. Ortamını çıkarın ve 200 µL Dimetil sülfoksit kullanarak kristalleri resuspend. Spektrofotometre, 570 plaka okuma nm.
    Not: Azalmış bir Absorbans kontrol hücreleri göre daha az canlılığı ile ilişkilendirmek.

Representative Results

Birincil astrositik kültürünün ana kaygıları nöronlar, oligodendrocytes, fibroblastlar ve microglia gibi diğer hücrelere varlığıdır. Şekil 1, izole sıçan cortices hücrelerden medya değişikliklerini her 3 günde ve vardı ya tedavi edilmemiş veya tedavi ile LME 1 h. 24 saat sonra eklendi, hücre immunostained GFAP'nin için vardı ve DAPI ile counterstained. Tedavi edilmezse hücreleri ortalama % 39 sigara-GFAP'nin pozitif hücrelerinin, LME tedavi hücreleri % 8 gösterdi gösterdi. Bu sonuçları nasıl LME tedavi ve medya bir zenginleştirilmiş-astrocyte kültür üreten 4.75 kat tarafından etkili bir şekilde azalmış sigara GFAP'nin pozitif hücrelerinin değişiklik gösterir. 1 h veya 6 h OGD astrocyte canlılık bu metodoloji sonra etkileyip etkilemediğini belirlemek için bir ÇMT tahlil astrocyte kültürler, 24 h hakaret sonra Şekil 2 gösterir. Canlılığı içinde anlamlı bir fark bu iki kez astrocyte reaktivite çalışma için kullanılabilir gösterilen herhangi bir durumda bulundu. Hücre çoğalması astrocytes içinde OGD tarafından tetiklenen etkileri biridir. %10 normoxic hücrelerdeki Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA) şekil 3 ' te 1 h OGD, gösterilen beklenen vivo içinde astrositik yanıt15sonra % 30 yükselmiştir. Son olarak, astrocytes 6 h 24 h normoxic koşullar tarafından takip OGD maruz bırakıldı. Bu süre içinde ayirt GFAP'nin karşı gerçekleştirildi. OGD Günese maruz kalan hücreleri astrocytes normoxic koşullar altında için karşılaştırıldı. Astrocytes olmadan OGD OGD uygulandı hücreleri açıkça reaktif astrocytes (şekil 4B) karakteristik hipertrofisi mevcut geleneksel Yildiz Seklinde morfolojisi (şekil 4A) gösterir. Bu hipertrofisi kortikal sıçan astrocytes normoxic ve OGD koşullarında (şekil 5) karşılık gelen farklı girişim kontrast (DIC) görüntü görüntülenmeyecektir.

Figure 1
Resim 1 . Birincil kortikal sıçan astrocytes kültür saflığı ile GFAP'nin ve DAPI doğrulamak için ayirt. (A) sol panelde temsil GFAP'nin pozitif hücreler (orta Masası çekirdeği (DAPI, mavi) ve doğru kapı aynası LME tedavi (üst paneli) ve LME tedavi (alt paneli) birleştirilmiş görüntüleri gösterir kırmızı), hücre. Beyaz ok hücreleri lekeli sigara-GFAP'nin pozitif göster. (B) miktar LME ve LME GFAP'nin pozitif çekirdek, hücre tedavi. Bir unpaired t-Testi gerçekleştirildi (p < 0.0001) ve hata çubukları ortalama SEM ölçek çubukları temsil 50 mikron ile temsil ve resimler 20 x büyütme oranında alınmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Astrocytes 24 saat maruz kalma OGD ile testin canlılığı. Astrocytes 96-şey levha kültürlü ve normoxic, 1 h OGD veya 6 h OGD koşullara maruz. Tedavi sonra hücreleri normoxic medya 24 h için eklenmiş ve canlılığı MTT tahlil kullanılarak ölçüldü. Absorbans karşılaştırıldığında kültür OGD maruz hücrelerde hücre canlılığı normoxic koşullarda hücreleri 570 nm gösterir. Veriler tek yönlü ANOVA ile analiz (p = 0.9669) ve SEM ile ortalama temsil eden hata çubukları mevcuttur Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Sıçan astrocytes yayılması artar maruz oksijen ve glikoz yoksunluğu için üzerine ve PCNA bir işareti olarak kullanarak algılanabilir. (A) sol panelin temsil eden PCNA pozitif hücrelerinin (yeşil), çekirdek (DAPI, mavi), orta paneli gösterir ve doğru kapı aynası normoxic hücre (üst paneli) birleştirilmiş görüntüleri gösterir ve 1 h OGD tedavi hücreleri (alt paneli). (B) yüzde PCNA normoxic OGD karşı pozitif hücrelerinin hücre tedavi. Unpaired bir testi gerçekleştirildi (p < 0.0001) ve hata çubukları ortalama SEM ölçek çubukları temsil 50 mikron ile temsil ve resimler 20 x büyütme oranında alınmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . İfade, gliyal Fibrillary asidik Protein (GFAP'nin) Birleşik Cy3 ile birincil fare kortikal astrocyte kültür. Bir normoxic ortamı gösterisinde karakteristik Yildiz Seklinde morfolojisi(a)Astrocytes. Ara filaman protein, GFAP'nin, hücre cesetleri doldurur ve ince sitoplazmik işlemleri halinde uzanır. (B) sonra 6 h OGD pozlama astrocytes Hipertrofik Morfoloji kabul etmiştir. Ölçekler 20 mikron temsil ve resimleri, 40 x büyütme confocal mikroskop içinde çekildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Kortikal sıçan astrocytes normoxic ve oksijen-glikoz yoksunluğu altında. GFAP'nin karşı bir Cy3 Birleşik antikor kullanarak lekeli ayirt astrocytes normoxic koşulları (üst sol kapı) altında veya 6 h OGD (alt sol kapı aynası,) in. Karşılık gelen farklı girişim kontrast (DIC) görüntü sağ panelde gösterilir. Ölçek çubuğu 20 mikron temsil eder ve resimleri 20 x büyütme oranında çekildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Amaç Antikor/işaretleyici Açıklama
Astrocyte kültür doğrulama IBA-1 Mikroglial hücreleri algılar
NeuN Olgun nöronlar tanımlar
Olig1 Olgun oligodendrocytes algılar
Olig2, NG2 Oligodendrocyte öncül hücreleri algılar
GalC Olgunlaşmamış ve olgun oligodendrocytes tanımlar
Nükleer silahların yayılmasına karşı PCNA Proliferasyona hücrelerdeki yüksek düzeyde ifade p36 protein bağlar
Hücre canlılığı Propidium iyodür (PI) DNA bağlanır, bu işaretleyici hücre canlılık eksikliği gösterir.
tr > MTT Önlemler mitokondriyal işlev Reaktivite GFAP'NİN Astrocyte reaktivite göstergesi

Tablo 1. Hücreleri ve hücresel çeşitli leke için kullanılan reaktifler listesi

Discussion

Bu iletişim kuralı astrocytes sıçan cortices üzerinden yalıtım açıklar. Bu yöntemde, microglia, oligodendrocytes ve fibroblastlar gibi hücresel diğer türleri ile kirlenme azaltmak için önemlidir. Microglia sayısını azaltmak için çeşitli adımlar alınabilir: medya, orbital sallayarak ve kimyasal tedaviler değiştirme. Kültür saflık ayirt seçici hücresel işaretçileri kullanarak veya en önemli hücre kirleticiler için onaylandıktan sonra deneyler yapılabilir. Örneğin, iyonize kalsiyum bağlama adaptör molekül 1 (Iba-1) karşı antikor microglia algılamak için kullanılabilir. Nöronal ölüm erken kültüründe başlar ve bu hücreler şişesi dokunarak sonra oligodendrocyte öncü hücreleri (OPCs) ile birlikte ortadan kalkar ve medya 3. gün31, değiştirin. Oligodendrocytic öncül hücreler antikorlar olig2 veya NG2 gibi kullanılarak belirlenebilir. GalC olgunlaşmamış ve olgun oligodendrocytes tanımlamak için kullanılan, ancak bu kültür aşamada bunlar bulunabilir olası değildir. Alternatif olarak, GFAP'nin pozitif hücrelerinin sayılabilir ve kirletici tahmin edilebilir. Bu son yöntemi belirli hücreler arasında ayırt değil, ama bir daha hızlı ve daha fazla ekonomi yöntembilimi astrositik olmayan hücreler kültür yüzdesini belirlemek için olacak.

Bir kez bir astrocyte zenginleştirilmiş kültür üretilen, astrocyte reaktivite çalışmaya OGD deneyler yapılabilir. Bir çözüm ile azot oksijen yerine köpüren tarafından tasfiye bir sık kullanılan protokolü32' dir. Metodolojimiz, biz 15 L/dak, 10 dakikadır 0.025 L. toplam hacmi için akış hızında glikoz-Ücretsiz medya içine oksijen azot gazı (% 95'i N2, % 5 CO2) ile temizlemek için kabarcıklanma yöntemini kullanın Oksijen temizlenir onaylamak için medyada sıvılar ve hava için bir oksijen metre kullanarak kalan oksijen konsantrasyonu ölçülür. Medyada 10 dakikadır tasfiye sonra kalan oksijen konsantrasyonu 7.9 mg/L 0.3 mg/l için azalmıştır. Ne kadar oksijen, N2 ile tasfiye değiştirmek için odası temizlenmesi gerekir belirlemek için odası üreticinin öneri (20 L/dak, 2-5 dk)'den az kullanılarak gerçekleştirildi. Tasfiye 15 L/dk 5 dk sonra odasında kalan oksijen konsantrasyonu % 0 oldu. Benzer Chambers'ı kullanarak diğer yöntemlerden bir 8-20 L/dk akış hızı ve 5-10 dk hava oksijen azot33,34ile yerine kez tasfiye.

Hücresel diğer modelleri gibi OGD sınırlamaları vardır ve sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır. OGD nöronlar için zararlı olabilir, ancak, astrocytes 24 s35için bu koşullarda dayanabilir. Astrocytes diğer hücrelerden sinyal eksik Bu sistemdeki izole başka bir kısıtlamadır. Bu sınırlamayı aşmak için bir yol aynı iskemik benzeri koşullarda diğer hücrelerden klimalı ortam kullanmaktır. Alternatif olarak, sitokinler veya diğer faktörler OGD36sonra medyaya eklenebilir.

Enerji eksikliği olan hücrelerde etkilerini incelemek için alternatif bir yöntem olduğunu ouabain medyaya eklemek için.  Bu bileşik özellikle ATP, OGD37,38etkileri benzer hücre içi üretimi depletes sodyum/potasyum pompa engeller. Ancak, bu yöntem bir gerçekçi olmayan iskemik inme senaryo oluşturan değişkenler tanıttı onun mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır ve hedef kapalı etkileri, indükler dezavantajı vardır.

Özet olarak, doğrudan neuroprotection için daha fazla katkıda bulunabileceğini farklı astrositik uyuşturucu hedefleri vitro etkilerini sınamak için bize izin verir bir izole hücre sistemi OGD yöntemidir. Ayrıca temel astrocyte Biyoloji çalışma için bir araç sağlar. Bu model inme bir vivo modelini kullanarak uyuşturucu gelişimi için deneysel koşullar haklı çıkarmak için kanıt güçlü bir temel oluşturabilir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Paola López Pieraldi teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. A.H.M. hibe 8G12MD007600 ve bu yayın desteklenen U54-NS083924 için minnettar olduğunu. NIH-NIMHD-G12-MD007583 hibe tesis destek için teşekkür ediyoruz. D.E.R.A. NIHNIGMS-R25GM110513 tarafından sağlanan burs için minnettardır. Ortak araçları alan kullanım için minnettarız ve Dr Priscila Sanabria optik görüntüleme tesis tarafından RCMI programının kullanımı için yardım vermek G12MD007583. Buna ek olarak, Jose Padilla filme ve görsel iletişim kuralı düzenleme olağanüstü rolü için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5” Roboz Company RS-6812 Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”  Roboz Company RS-5271 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”  Roboz Company RS-5882 Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp  Roboz Company RS-5095 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 Roboz Company RS-5135 Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers Roboz Company RS-4972 Peels brain meninges.
Dissection microscope Olympus SZX16 Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GibCo. Company 11995-065 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore Corning 431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL VWR 89130-896 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL VWR 89130-898 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL VWR 89130-900 To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL Santa Cruz Biotechnology sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL Eppendorf 022363204
Barrier Tips 200 uL Santa Cruz Biotechnology sc-201725
Barrier Tips 1 mL Santa Cruz Biotechnology sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19" VWR 14220-048
60mm petri dishes Falcon 351007
Sterile gauze pads Honeywell Safety 89133-086
Stomacher 80 Biomaster Sewar Lab System 030010019 Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags Sewar Lab System BA6040 Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL Pyrex 1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60  Sigma-Aldrich Company S1020 To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 Sigma-Aldrich Company S3895 To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope Nikon Eclypse Ti-S Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks Falcon 353136
Multi-well plate Falcon 353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round VWR 48380-046
Bright-Line hemacytometer Sigma-Aldrich Company Z359629
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
Ethyl alcohol  Sigma-Aldrich Company E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) Sigma-Aldrich Company L1002 Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich Company C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 Sigma-Aldrich Company P0899
Trypsin/EDTA GibCo. Company 15400-054
Trypan Blue Sigma-Aldrich Company T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Sterile Water Sigma-Aldrich Company W3500
 OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose Sigma-Aldrich Company D5030 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine  GibCo. Company 25030-081 Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Filter System 50mL with 0.22um pore Corning 430320
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Single Flow Meter  Billups-Rothenberg SMF3001 Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber  StemCell 27310 Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter VWR 21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture Linde Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10% Sigma-Aldrich HT501128 Solution used to fix cells.
Methanol  Fisher A4544 Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100) Sigma-Aldrich T8787
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN Cell Signaling 24307 Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA Cell Signaling 2586 Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich Company P4170 Apoptosis staining.
Anti-Olig1 Abcam AB68105 Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+ Wako 016-20001 Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3  Sigma-Aldrich Company C9205 Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488 Molecular Probe Life Technology A1101 Anti-Mouse Secondary Antibody.
Alexa Fluor 555 Molecular Probe Life Technology A21428 Anti-Rabbit Secondary Antibody.
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich Company D9542 Nuclear staining.
Confocal microscope Olympus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46, (6), 660-662 (1989).
  2. Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39, (5), 285-293 (2007).
  3. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46, (11), 3310-3315 (2015).
  4. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67, (2), 181-198 (2010).
  5. Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
  6. Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38, (6), 2001-2023 (2007).
  7. Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7, (5), e37574 (2012).
  8. Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11, (5), 400-407 (2005).
  9. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119, (1), 7-35 (2010).
  10. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8, (3), e60282 (2013).
  11. Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128, (6), 878-889 (2014).
  12. Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. 1347987 (2016).
  13. Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. (2016).
  14. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62, (8), 1227-1240 (2014).
  15. Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55, (5), 546-558 (2007).
  16. Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2, (4), 221-228 (1991).
  17. Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532, (7598), 195-200 (2016).
  18. Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9, (1), 1-14 (1991).
  19. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
  20. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6, (8), 2163-2178 (1986).
  21. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
  22. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, (3), 282-292 (1998).
  23. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, (3), 890-902 (1980).
  24. Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
  25. Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120, (1), 123-131 (1993).
  26. Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7, (1), 27-39 (1991).
  27. Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66, (3), 487-496 (2001).
  28. Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254, (18), 8914-8921 (1979).
  29. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131, (5), 2282-2290 (1983).
  30. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, (1), 128-137 (2006).
  31. Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, (11), 4345-4348 (1990).
  32. Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41, (2), 211-215 (1994).
  33. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
  34. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
  35. Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
  36. Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48, (4), 531-535 (2000).
  37. Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93, (2), 963-979 (2005).
  38. Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11, (3), 249-259 (2001).
Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı <em>Vitro</em> iskemik benzeri koşullar altında izleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).More

Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter