Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran

Summary

Bu protokol değiştirilmiş kuduz virüsü floresan işaretlerini ifade ve bağımsız, tarafsız küme farklı nöronal alt sınıfları arasında morfolojik metrik kapsamlı karakterizasyonu olanak analizleri ile retrograd enfeksiyonu takiben etiketli seçici nöronal popülasyonlarının büyük ölçekli rekonstrüksiyon açıklar.

Abstract

Bu protokol, bağımsız ve tarafsız kümelenme kullanımı ile birlikte nöronların büyük ölçekli rekonstrüksiyon seçici nöronal nüfus arasında gözlenen morfolojik özelliklerinin kapsamlı bir anket oluşturmak için analiz özetliyor. Bu tekniklerin kombinasyonu Nöroanatomik verilerin toplanması ve analiz için yeni bir yaklaşım oluşturmaktadır. Birlikte, bu teknikler büyük ölçekli etkinleştirmek ve selektif nöronal popülasyonlarının dolayısıyla daha kapsamlı, örnekleme ve bir nüfus içinde morfolojik benzersiz nöronal sınıfları tanımlamak için tarafsız nicel yöntemler kurmak.

protokol seçici nöronlar etiketlemek için modifiye kuduz virüsünün kullanımını özetliyor. ilgi hedef beyin yapısına stereotaksik enjeksiyonu takiben retrograd tracer gibi kuduz virüsü eylemleri G-silinmiş ve nöronlarda EGFP teslimat ve ifade için bir araç olarak hizmet vermektedir. nöronların çok sayıda bu kullanarak enfekteteknik ve bireysel nöronların "Golgi gibi" tam doldurur üreten, kendi dendritler boyunca GFP ifade eder. Buna göre, virüs aracılı retrograd izleme yöntemi tam hücre içi dolgular üreterek geleneksel boya bazlı retrograd izleme teknikleri geliştirir.

çalışılan beyin bölgesi tüm bölgelerini kapsayan bireysel iyi izole edilmiş nöronları temsili bir örneği elde etmek için yeniden için seçilir. protokol hücre gövdeleri yeniden ve çoklu doku bölümleri kapsayan etiketli nöronların dendritik arborization kalıplarını tamamlamak için prosedürler sıralanıyor. Beyin yapısı içinde her bir nöronun pozisyonları da dahil olmak üzere morfolojik veriler, daha fazla analiz için ayıklanır. Standart programlama fonksiyonları bağımsız küme analizleri ve morfolojik metriklere dayanan küme değerlendirmelerini gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Bir kümeleme analizi perfo bu analizlerin programı, istatistiksel değerlendirme doğrulamak içinmakak maymunu talamus (TRN) talamik retiküler çekirdeğinde yeniden 160 nöronlar üzerinde rmed yapıldı. Orijinal kümeleme analizi ve burada yapılan istatistiksel değerlendirmeler, hem TRN nöronlar üç alt popülasyonlar, benzersiz morfolojik özelliklere sahip her ayrılır olduğunu göstermektedir.

Introduction

Nöroanatomi "connectomics" in nörobilim ¹ ve son faiz temellerinden biri nöronal popülasyonlarının morfolojik çeşitlilik ve belirli nöronlar ² arasındaki bağlantıları anlamak için coşku yeniledi olduğunu. Etiketleme yöntemleri ve yeniden nöronlar büyük ölçüde genetik ve virüs aracılı devre izleme de dahil olmak üzere son yenilikler ile iyileştirilmiştir nöronal nüfus ⁵ daha kapsamlı morfolojik araştırmalar sağlayan, ^{3, 4} yaklaşır. Bireysel nöronlar etiketleme gelişmelere ek olarak, nicel veri analiz teknikleri de bu morfolojik verilerle ^{5, 6} dayalı farklı alt popülasyonlar halinde nöronların bağımsız ve tarafsız sınıflandırma etkinleştirmek ortaya çıkmıştır. Bu tarafsız teknikler daha Traditiona üzerine bir gelişme vardırBir asrı aşkın süredir alanında standart olmuştur l nitel sınıflandırma yöntemleri. Bu çalışmanın amacı, ana hatlarıyla adım-adım olduğunu, bir seçici nüfus içindeki nöronların virüs aracılı etiketleme kombinasyonu, bir bu nöronların kapsamlı numune ve nicel veri analizi büyük ölçekli rekonstrüksiyon ile bağımsız kümeleme dayalı İstatistiksel değerlendirme. Bu yöntemleri birleştirerek, bir selektif nöronal nüfus içinde kapsamlı örnekleme ve morfolojik eşsiz nöronal türleri tarafsız sınıflandırma kolaylaştırmak için toplama ve nöroanatomik verilerin analizi doğru yeni bir yaklaşım özetlemektedir.

Bu yöntemlerin bir örneği olarak, makak maymunu talamik retiküler nükleus (TRN) tek bir sektörü içinde nöronların büyük bir nüfusun analizimizi açıklar. Bu veriler daha önceki çalışmada ⁷ vardır. seçici dorsal Latera projelendirme TRN nöronların etiketleme YöntemleriEGFP ^{4, 8} kodlayan modifiye kuduz virüsünün cerrahi enjeksiyon kullanılarak talamus (dLGN) l Dirsekli çekirdeği özetlenen (Özel Malzemeler / Ekipman, satır 2 Tablo). Bu modifiye kuduz virüsü geni, bir esas kat proteinini kodlayan virüs trans-sinaptik hareketi ortadan yoksundur. Virüs enjeksiyon yerinde akson terminalleri girdikten sonra, enfekte nöronlar ^{5, 9, 10,} tam dendritik arborization boyunca EGFP ifade sürüş önemli yararı ile geleneksel retrograd tracer gibi davranır. Bu duruma göre, bu G-silinmiş kuduz virüs seçici bulaşabilir ve enjeksiyon ve retrograd taşıma sonraki herhangi bir nöronal popülasyonu etiket kullanılabilir.

Belirli bir nöronal nüfusun geniş kapsamlı bir analizi gerçekleştirmek için, örnek için önemlidirnüfus içinde nöronların geniş bir dağılımı. Virüs-aracılı etiketleme tekniği tam hücre içi üretimi için, "Golgi gibi" virüs enjeksiyon yerinde akson birçok nöron doldurur, bir beyin yapısı tam kapsam dahilinde nöronların çok büyük bir örnek yeniden oluşturmak mümkündür. değiştirilmiş kuduz virüsü enfekte edilmesi ve nöron çok sayıda etiketleme de çok etkili olduğu için, ayrıca, hayvan başına nöronların yüzlerce yeniden oluşturmak mümkündür. DLGN verme TRN nöronların kapsamlı bir örnek oluşturmak için TRN ¹¹ görsel sektör genelinde 160 nöronlar örnekleme için prosedürler özetlenmektedir. Bir mikroskop, kamera ve yeniden yazılımı içeren bir nöron rekonstrüksiyon sistemini kullanarak bireysel nöronlar yeniden süreci açıklanmıştır. Ayrıca tarif edilen (TRN içinde bu durumda) beyin yapısı içinde tek tek nöronların konumlarını belirlemek için ve virüs, enjeksiyon sit doğrulamak için yöntemlerhacimsel kontur rekonstrüksiyon kullanarak (dLGN içinde bu durumda) bir yapı içinde e hacmi ve konumu. Her bir nöron için ölçülen morfolojik ölçümlerini özetlenen morfolojik verileri dışa ve bağımsız küme gerçekleştirmek için adımlar dayalı analizleri. kümeleme yöntemleri sınırlamalar vardır ve mevcut farklı kümelenme algoritmaları çeşitli de vardır. Bu duruma göre, bu seçenekler ve daha yaygın olarak kullanılan algoritmalar bazı avantajları açıklanmaktadır. kümeleme analizi kümeleri tekliği istatistiksel doğrulama sağlamaz. Bu nedenle, ek adımlar optimum kümelenme yanı sıra içinde ve gruplar arasında morfolojik veriler arasındaki ilişkileri doğrulamak için özetlenmiştir. Bu TRN nöronlar onaylamak için TRN veri kümesi için kümeleri değerlendirmek için istatistiksel yöntemler tarif edilmiştir 10 bağımsız morfolojik metriklere dayalı üç benzersiz kümeler halinde gruplandırılmış.

Böylece, seçici etiketleme için adımları özetleyerek, Yeniden ve belirli bir nöronal nüfus morfolojik verilerini analiz, bir popülasyon içindeki nöronlar arasındaki morfolojik farklılıklar ölçülmesi için yöntemler açıklanmaktadır. makak maymunu TRN'nin görsel sektöründe farklı nöron tiplerinin önceki bulguları ayrı istatistiksel değerlendirme yöntemleri ile teyit edilir. Birlikte, bu teknikler, nöroanatomik veri kümelerine geniş uygulanabilir ve beyin üzerinden nöronal nüfus çeşitliliği kantitatif sınıflandırma kurmak yardımcı olacağını umuyoruz.

Protocol

Not: Bu çalışmada incelenen doku ayrı bir çalışma ⁵ bir parçası olarak hazırlandı. Bu nedenle, hayvan kullanımını kapsayan deneysel yöntemler tüm Briggs ve diğ Deneysel Yöntemler bölümünde detaylı olarak tarif edilmiştir. (2016). önceki çalışmanın bir parçası olarak yürütülen hayvanları da içeren tüm işlemler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından kabul edildi. 2 - dLGN virüsün enjeksiyonu ve beyin dokusunun histolojik inceleme için adım bölümler 1, aşağıda kısaca tarif edilmektedir.

1. Stereotaksik Enjeksiyon

1. aseptik teknikler kullanılarak, steril bir ortamda tüm cerrahi prosedürleri gerçekleştirmek. otoklavda tüm metal cerrahi aletler, gazlı bez ve asmak malzeme Buhar sterilize edin. Kimyasal sterilizasyon (örneğin etilen oksit) kullanarak buhar ile zarar görebilir tüm malzemeleri sterilize edin.
2. Neden ve hayvansal ve p göre anestezi bakımırotocol özgü gereksinimleri.
   1. Maymunlarda virüs enjeksiyon için, ketamin (10 mg / kg) ile anestezi neden ve izofluran ile dolu cerrahi anestezi altında hayvanların bakımını - CO ₂ süresi izleme (1% 3 oksijen inhale), EKG, solunum hızı ve sıcaklık sürekli ve periyodik olarak kontrol çene sesi için uygun anestezi derinliği sağlamak.
3. Baş pozisyonunun stabilize etmek ve stereotaksik koordinatların kullanımı ilgi enjeksiyon yapısı (örn dLGN) bulmalarını sağlamak için bir stereotaksik çerçeve hayvan yerleştirin. görsel yanıtları ölçmek, bir yerde göz (aksi tuzlu göz damlaları, öğrenci dilatasyon istenirse% 1 atropin göz damlası) düşer ve daha sonra her iki gözde kontakt lensler kuruluğunu önlemek için. görsel yanıtları ölçmek değilse, gözlerde oftalmik merhem yerleştirin.
4. Bir orta hat kafa derisi kesi yapmak ve cilt ve kasların geri çekin.
5. stereotaksik göre bir hemisph ilgi yapısı (dLGN) koordinatlarıere, küçük bir kraniotomi yapmak.
6. Yavaş yavaş bir kayıt elektrot (örneğin tungsten veya platin / iridyum elektrodu (Belirli Malzemeler / Ekipman, satır 3 bkz: İçindekiler) elle konumlandırılmış bir micromanipulator kenetlenir) beynin içine kraniyotomi ile indirin. istenirse alt empedans (<1 M?) ve biraz daha kalın (~ 250 mikron çapında) elektrotlar, dura nüfuz kullanılabilir.
7. kortikal yüzeyde ve görsel tepkiler ölçülür noktada manipülatör konumunu kaydedin. Görsel tepkiler zaman kilitli ışık nöronal yanıtları bir oftalmoskop veya küçük LED / el feneri ile gözlerde parladı, duyulabilir.
8. Görsel yanıtların başlangıç, orta ve sonunda manipülatör pozisyonları belirterek ve bu değerlerden kortikal yüzey pozisyonunu çıkarılarak dLGN yerini ve kalınlığını belirler. dLGN içinde her tasarlanmış enjeksiyon site için derinliklerini kaydedin.
   NOT: Benzer proceduRes, uygun duyu uyarıcılar ile görsel olmayan yapıların yerini belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, birleştirilmiş kayıt / enjeksiyon sistemleri de küçük beyin yapıları hedef için kullanılabilir.
9. Optimum enjeksiyon yerleri belirtilmiştir sonra, derin enjeksiyon yerinde başlayan ve sığ geçmeden, her enjeksiyon için uygun derinliğe kadar aynı stereotaksik konumu ve düşük (cam pipet veya enjeksiyon şırınga) kayıt elektrot kaldırmak ve bir enjeksiyon pipet koyun elektrot pozisyonunu değiştirmeden önce enjekte sonra en az 1 dakika bekledikten. 50 um ~ dış çapı cam pipetler şırınga uçları (~ 200 mikron çapında) ile karşılaştırıldığında virüsün geri akmasını azaltabilir.
10. Çoklu (3 üzerinde modifiye kuduz virüsünün - (enjeksiyon işlemleri için üretici talimatlarına başvurun 5 uL 1) - bir enjeksiyon sistemi kullanarak, Picospritzer veya şırınga pompası (/ Equipment t, satır 4 Özgül Malzemelerin Tabloya bakınız), küçük hacimlerde enjekte 10) derinlikleriHedef yapısı (dLGN) olan ~ 100 nL / dakika hızında uygula. Not: Ayrı enjeksiyon girmeler daha büyük bir hedef yapıları (örneğin maymun dLGN) yapılabilir. Hedef yapısı büyüklüğüne göre toplam enjeksiyon hacmi ayarlayın.
11. Enjeksiyon pipet geri çekilmeden önce en az 5 dakika Pause. Enjeksiyon pipet çıkarıldığında, daha sonra yeniden bir araya kas ve cilt sütür (yerinde tutkal kemik parçası, kemik mumu veya gelfoam uygulanır) koruyucu malzeme ile kraniotomi doldurun.
12. Analjezikler yönetme (örneğin ketoprofen) ve ameliyat sonu öncesinde antibiyotik ve hayvan ayaktan kadar sürekli hayvan izlemek.
13. en az 3 gün boyunca ve ameliyatı takiben 10 gün öncesine kadar, dikişler, temiz, kuru ve sağlam ve hayvan ağrı veya rahatsızlık emaresi göstermiyor sağlamak için günlük hayvan izleyin. gerektiği gibi günlük analjezik ve antibiyotik uygulayın. Hayvan tamamen ameliyattan kurtarıldı sonra ameliyat sonrası hayvanın sosyal konut başlayın.
</ Ol>

2. Doku Hasat, Kesit ve Boyama

1. 14 gün virüsün retrograd taşınması için, daha sonra, 0.1 M fosfat tamponlu tuz,% 4 paraformaldehit,% 10 sukroz ile daha sonra% 4 paraformaldehid ile transkardiyal hayvan ötanazi (örneğin Euthasol) aşırı dozu ile hayvan euthanize ve serpmek - 7 izin verin.
2. 2 gün 1 -% 4, 0.1 M fosfat tamponu içinde paraformaldehit ve buzdolabına% 30 sukroz - 20 beyin (bir kemirgen modelinde benzer adımlar için ¹²⁾ ve yer çıkarın.
3. Beyin kabın dibine batırdı zaman çıkarın ve retrograd etiketli nöronlar beyin bölgesini içeren bloklar halinde doku (örneğin görsel korteks) ve enjeksiyon hedef yapıyı (örneğin dLGN) kesti. olmayan enjekte yarımkürede doku aynı blokları Cut - bu kontrol bölümleri olarak görev yapacak. En iyi sonuçlar için, histolojik işlemler immediatel başlayacakTaze kesit doku y.
4. Bir dondurma mikrotom kullanılarak Bölüm başına 50 mikron kalınlığında koronal Bölüm doku (Belirli Malzemeler / Ekipman, sıra 5 Tablo).
5. Kortikal katmanları ve subkortikal yapılar ¹³ görselleştirmek için - sitokrom oksidaz etkinliği için tüm bölümleri leke (8 Specific Malzeme / Ekipman, satır 5 Tablo). Not: Bölümler sitokrom oksidaz leke aşağıdaki son durulama bir gece boyunca buzdolabında muhafaza edilebilir.
6. GFP karşı primer antikor ile tüm bölümleri etiket (1: 1,000 seyreltme, ~ 12 saat inkübasyon; Belirli Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız, satır 9) birincil ana eşleşen bir ikincil antikor tarafından takip ve biotin ⁵ ile etiketlendi (1: 500 seyreltme , 2-4 saat inkübasyon;) 10 satır, Özgül Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. Ikincil antikor bir gece boyunca bölümleri inkübe önerilir.
7. Bir avidin / biotin kompleksi ile etiket bölümleri daha sonra kalıcı olarak etiketlenmiş nöronlar ⁵ leke DAB ve peroksit ile reaksiyona girer.
8. Altyazılı cam slaytlar bölümleri monte ve kuru gecede izin verin.
9. Daha sonra alkol ve ksilen bir dizi ile çalkalanması kullanarak Defat bölümler kayma ¹⁴ kapsamaktadır.

3. nöronal İmar

NOT: Orijinal deneyler için tüm rekonstrüksiyonlar mikroskop oluşan bir nöron rekonstrüksiyon sistemi kullanılarak yapılmış, ekli kamera (13 satır, Özgül Malzemeleri / Ekipman Tablo) ve rekonstrüksiyon yazılımı (14 satır, Özgül Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız) paketi (- 12 Specific Malzeme / Ekipman, satır 11 Tablo). Yazılım destekli nöronal yeniden nöronal süreçlerin bilgisayar tabanlı çizimler ile üst üste doku slaytlar görselleştirme sağlar. Önemli olarak, program da morfolojik reconstruc dijital haleüç boyutlu yon verileri, konum özgü morfolojik bilgi sağlayan çıkarma. Ilişkili veri çıkarma programı (12 satır, Özgül Malzemeleri / Ekipman Tablo) kaydedilen her yeniden gelen morfolojik zengin bir veri seti okunmasını sağlar.

1. Mikroskop lamı tutucu bir slayt yerleştirin ve düşük büyütmeli objektif (örn 2X veya 10X) kullanarak tek bir ilgi bölümünde odaklanın. Kamera görüntüsü düzgün kamera deklanşörü konumlandırarak yazılım görünümünde görünür olduğundan emin olun.
2. Açıkça mümkün olduğunca dendritik arborization kadarını yeniden şekilde makul izole edilir faiz (örn TRN) beyin yapısı içinde etiketli nöronlar seçin. hücre gövdesi her hücre vücudun en büyük ölçüde yakalamak ve doğru bir şekilde alanı ve yuvarlaklığını tahmin etmek için tek bir bölüm içinde tamamen ise tercihen nöronlar seçin. Hücre b tanımlamak için 10X mikroskop objektif kullanınev bölümünde ody.
3. İyi lekeli, iyi izole edilmiş nöron tespit edildikten sonra, "Yeni Bölüm" butonuna basarak Bölüm Yöneticisi hücre gövdesi içeren "ev" bölümüne ekleyin. içerecek şekilde bölümlerin sayısını girin (- başlamak için 3 bölümden 2 tavsiye). istendiğinde 50 mikron bir bölümü kalınlığı atama (Adım 2.3).
4. hücre gövdesi içeren ev bölümünde ilgili beyin yapılarının hatlarını çiziniz. kontur izleme için 2X objektif / büyütme kullanın.
   1. Birincisi, üst araç çubuğundaki açılır menüden "Kontur" seçin ve açılan menüden (örneğin "LGN" veya "TRN") den kontur türünü seçin.
   2. Bir beraberlik aracı olarak fareyi kullanarak kontur boyunca noktalarda tıklayarak, istenirse, hedef yapısı (örn TRN) yanı sıra komşu yapıların hatlarını çiziniz.
   3. fareyi sağ tıklayarak ve bu seçeneği seçerek "Kapat Kontur" seçinMenüden tamamlamak ve her izlenen konturu çevrelemek için.
5. o konumda bir işaretçi yerleştirmek için yeniden istediğiniz konuma tıklayarak sonra sağ araç çubuğundaki istenen işaret sembolü tıklayıp hedef yapının merkezinde bir işaret yerleştirmek. Tüm rekonstrüksiyonlarında hedef yapının merkezini işaretlemek için işaretleyici aynı tip kullanın.
6. 60X hedefleri / büyütme - kontür tamamlandıktan sonra, 40 kullanılarak hücre vücudun anahat iz. Bunu yapmak için, önce üst araç çubuğundaki açılır menüden "Neuron" seçin ve ardından bu durumda "Hücre Body" de, iz nöron yapısını seçin. Sonraki 3.4 olarak hücre gövdesi iz.
7. 3.5'de belirtilen adımları izleyerek, hücre gövdesi merkezinde farklı bir stil işaretleyici yerleştirin.
8. hücre gövdesinden başlayarak tüm dendrit Trace.
   1. İlk olarak, açılan menüden "Dendrite" seçeneğini seçin. Sonra hücre bod başlayan her dendrit izy ve beraberlik aracı olarak fareyi kullanarak. doğru dendrit açısını ve yönünü yakalamak için izleme boyunca z-derinliğini ayarlamak için emin olun.
   2. fareyi sağ tıklayarak ve açılan menüden "çatallanan Düğüm" veya "Trifurcating Düğüm" seçerek dendrit boyunca her şube noktada bir düğüm yerleştirin. tüm dendrit rekonstrüksiyon için 60X objektif / büyütme - 40 kullanın.
   3. Her dendrit sonunda, fareyi sağ tıklayın ve açılan menüden "Bitiş" seçeneğini seçin.
9. Bitişik bölüme devam mikroskop görüntü uygun z-derinlikte odak noktası haline getirilmesi için muhtemel dendritik sonlar belirleyin. Böyle mikroskop görüntü kan damarları veya kolayca tanınabilir dendrit desenler veya demetler halinde yakındaki büyük işaretlerini ekleyin.
   1. (En büyük dönüm noktası görselleştirme sağlar büyütme seçin) mikroskop 20X veya 10X büyütme azaltın ve almakBir dijital fotoğraf makinesi kullanılarak mikroskop görüntünün bir resim (örneğin cep telefonu, tablet) bilgisayar ekranına el.
10. slaytta bitişik bölüme taşıyın ve yeni bölümünde dLGN ve TRN sınırları daha önce takip bölümün hatlarını sıraya.
11. (Kontür ve önemli yerlerinden dayalı) hücre vücudun genel alana görüş alanını dönmek ve geri 10 büyütme getirmek - 20X.
12. yeni bölümünde dendritler başlangıçlar ile sonlar uyum konusunda yardımcı olmak için önceden takip bölümünden dendrit uçlarının fotoğrafı kullanın.
    1. izleme döndürmek ve yeniden seçmek için ok aracını kullanın dendrite hizalamak için taşımak için, sağ tıklayın ve açılan menüden "Move" seçeneğini seçin.
    2. Alternatif olarak, başlangıçlar dendritik sonlar maç için "Match" aracını kullanın. üstteki araç çubuğundan Maç aracını seçin ve istendiğinde, biten tıklayınyeniden yapılanma ve görüntüsünde karşılık gelen devamıdır noktası. 3 veya daha fazla sonlar için tekrarlayın.
13. önceki bölümden izleme yeni bölümünde dendritler ile dizilmiş sonra, gelen yeni bir bölüm mevcut bölümünü tıklayarak bölüm yöneticisi seçili olduğundan emin olun. buna göre ev bölümüne her yeni bölüm göreli z-derinliği ve konumunu ayarlayarak ve 50 mm (Adım 2.3 bakınız) her bölüm kalınlığı ayarı, 3.3 yukarıda tarif edildiği gibi ya da, Bölüm Yöneticisi yeni bir bölüm eklemek.
14. 40 büyütme artırın - 60X ve daha sonra da fare kullanarak dendrit izleme, yeniden gelen dendrit ucundaki fareyi sağ tıklayarak ve açılan menüden "Bitiş ekle" seçerek dendrit devamlarını takip aracı çizin. devamı yeni bölümünde ise belirtmek için istemi izleyin.
15. her bir tarafında (en az 3 bitişik bölümleri ile dendritler takipEv bölüm) Adımları 3.8 aşağıdaki - 3.15. en az 3, toplam bölümler nöron için veya dendritler artık takip ya da bulunabilir kadar takip kadar yeniden ekleyin. istenirse, yukarıdaki adımları izleyerek komşu bölümlerde hatlarını çiziniz.

4. Bağımsız Kümeleme

Not: Bağımsız küme, aksi takdirde önemlisi, görselleştirmek ve zor olabilir büyük, çok boyutlu veri setleri tarafsız analizler sağlayacak morfolojik çeşitlilik kantitatif bir değerlendirmesini sağlamak analiz eder. Bir matris tabanlı programlama platformu çok boyutlu veri setleri analizi için oldukça yararlıdır ve karmaşık veri manipülasyonlar ve istatistiksel analizler sağlar. Adım 4 listelenen fonksiyonlar - 6 Özgül Malzemeleri / Ekipman Tablo listelenen programlama platformu tanımlanan, 15 satır.

1. Bir ext kullanarak her nöronal yeniden gelen morfolojik veri ayıklayınnöron rekonstrüksiyon sistemi ile ilişkili reaksiyona karşı programı (- 12 Specific Malzeme / Ekipman, satır 11 Tablo).
   1. Kontur bilgi işaretleyici bilgileri, hücre gövdesi ve dendritik arborization, vb morfolojik veriler: Birincisi, dahil olmak üzere her yeniden inşası için istenen morfolojik verileri seçin.
   2. Üst araç çubuğundan Düzenle açılır menüden, "tüm nesneleri seçin" seçeneğini seçin. Sonra üst araç çubuğunda Analiz açılır menüden "Dallı Yapı Analizi" seçin ve her sekmesine tıklayın ve her sekmede istediğiniz analiz seçeneklerini seçin.
   3. Analiz penceresinde "Tamam" butonuna tıklayarak istenen tüm verileri ayıklamak ve çıkış pencereleri ve "Excel'e Ver" seçeneğini sağ tıklayarak bir çizelge formatında kaydedin.
2. (Belirli Malzemeleri / Ekipman bkz: İçindekiler 16 satır) Master-tabloyu derlemek olduğu her morfolojik değişken / megastrik nöron başına tek bir sayısal gözlem ile temsil edilmektedir. Bu Usta e-tabloda, her bir nöron için satır tanımlayıcı bir kaydını tutmak.
3. Küme analizine dahil tüm değişkenler (örneğin morfolojik ölçümler) birbirlerinden bağımsız olduğundan emin olun. Örneğin, düğüm sayısı dendritik veya aksonal arborization içindeki dalların sayıca ile ilişkili olacaktır. Bu duruma göre, bu iki değişkenin tek küme analizine dahil edilmelidir.
4. Her morfolojik metrik (değişken) karşılık gelen bir veri noktası (gözlem) olması gerekir, her nöron (ölçüm), yani emin her ölçüm her değişken için bir gözlem içerdiğinden emin olun. (Örneğin, akson uzunluğu) belirli bir değişken için gözlemler nöronların bir alt kümesi için eksik varsa, bu değişken (akson uzunluğu) küme analizi dahil edilemez.
5. Her satır bir nöron ve EAC temsil ettiği tek bir matris içine Ana elektronik tablo verileri düzenlemekh sütunu, her morfolojik metrik (Şekil 1) için sayısal veriler içeriyor. Örneğin, 100 nöronlar da dahil olmak üzere bir veri kümesi olan 100 x 5 (satır-by-sütuna) matrisi ile temsil edilecektir 5 bağımsız değişkenler için gözlemler vardır. satır dizini her nöronun benzersiz tanımlayıcı olarak hizmet verecek - matris içinde her bir nöron için herhangi bir kimlik dahil gerekli değildir. Ayrıca matris içinde hiçbir boşluk veya "NaN" ler olmalıdır. Tek bir değişken olarak matrisi kaydedin (örneğin Veri = [100 x 5 matris]; Yan Kod örnek kod için Dosya bakınız).
6. n değişkenlerinin sayısına göre tanımlanan bir n-boyutlu uzayda bireysel nöronlar temsil noktalar arasındaki mesafeleri hesaplamak için bir algoritma seçin. 'Pdist' fonksiyonu arası nöron mesafeleri hesaplanmasında esneklik sağlar. Varsayılan mesafe hesaplama Öklid mesafe ve nöronal morphologica benzer analizler için daha önce kullanılmıştırl veri ^{5, 6.}
7. arası nöron 'pdist' fonksiyonu çıkışını mesafeler ile kümeleri oluşturmak için 'bağlantı' işlevini kullanın. Yine, çoklu kümelenme seçenekleri mevcuttur. Ward yöntemi ve ağırlık merkezi mesafesi morfolojik veri setleri ^{5, 6} analizlerde benzer sonuçlar vermiştir.
8. İstenirse, 'pdist' ve 'bağlantı' fonksiyonlarına alternatif kümelenme yaklaşımı olarak 'kmeans' işlevini kullanın. 'Kmeans' sonra kümeleri atamak için ağırlık merkezi mesafe arası nöron mesafeleri hesaplamak ve Öklid mesafe kare çalışmaktadır.
9. hiyerarşik küme ağaç görselleştirmek için, 'bağlantı' operasyonu çıkışında 'dendrogram' işlevini kullanın. Bu fonksiyon 30 ölçümleri görselleştirme sınırlayan bir varsayılan ayarı vardır, ama ölçümlerin sayısını (<belirterek geçersiz kılınabilirem> örneğin nöronlar) görüntülenir. dendrograma x ekseni üzerindeki satır indeksi ile belirlenen nöronların her biri için y-ekseni üzerinde bağlantı mesafeleri göstermektedir.
   NOT: 'bağlantı' ve 'dendrogram' çıkışları kümelerinin optimum sayıda tanımlamak yok. 'Kmeans' çıktı kümeleri ölçümleri atamak, ancak bu kümeler uygun olup olmadığını test etmez. Ayrı istatistiksel karşılaştırmalar ve optimal kümelenme doğrulama (aşağıya bakınız) yapılabilir.

Kümelenme 5. Doğrulama

Not: Yukarıda belirtildiği gibi, küme analizi kendisi doğrudan küme dendrogram gösterilen kümeleri benzersiz ve örnek temsilcisi olsun bir istatistiksel değerlendirme sağlamaz. Dendrogram gelen kümeleri doğrulamak için yöntemler, ancak bu optimum kümelenme istatistiksel doğrulama vermeyin, ¹⁵ ileri sürülmüştür. Çok vardırOptimal kümeleme doğrulamak için ple yöntemler.

1. Yöntem 1: değerlendirilmesi kümeleme:
   1. Böyle 'kmeans' veya 'bağlantı' olarak kümeleri, hesaplamak için kullanılan yöntem belirterek 'evalclusters' işlevini kullanın. Bir Gauss karışım modeli çıkışı da değerlendirilebilir (aşağıdaki Adım 5.2; Yan Kod örnek kod için Dosya bakınız).
   2. (- "Evalclusters" ararken, Yardım menüsüne bakın, kriter seçeneklerinin açıklamaları için, örneğin 'CalinskiHarabasz') bir dizi seçenek arasından değerlendirme kriterini belirtin.
   3. Test etmek için en uygun küme numaraları aralığı belirtir (örneğin, [1: 6], 1, 2, 3, 4, 5 ya da 6 kümeleri uygun olup olmadığını test etmek için).
      Not: 'evalclusters' çıktısı, belirtilen kümelenme algoritmasını ve kriter verilen küme optimal bir sayıdır.
2. Yöntem 2: Gauss karışım modeli kümeleme:
   NOT: Gauss karışım modeli kümeleme Algorithms (gmms) her değişken için gözlemler her olası küme, kendi ortalama ve kovaryans her tanımlayan Gauss dağılımları karışımından geldiğini varsayalım. GMM ardından belirli bir kümeye ¹⁶ ait olasılığını gösteren her ölçüm için arka olasılıklarını atamak için bir beklenti maksimizasyonu algoritması kullanır.
   1. veri gözlenebilir kümelerin farazi numarasını girerek 'fitgmdist' fonksiyonunu kullanarak bir GMM uygulamak. Alternatif olarak, kümelerin sayısının önsel atama önlemek için, burada anlatılan adımları kullanarak farklı optimum küme sayıları bir dizi temel bileşenler analizi (PCA) kullanın (İlave kod örnek kod için Dosya bakınız).
   2. orijinal veri matrisi üzerinde 'pca' işlevini kullanın ve bir çıkış olarak ana bileşeni puanlarını kaydedin.
   3. Bir döngü 1'den başlayan ve varsayılan optimum kümelerin bazı numara ile gidiş, inci kullanmaktemel bileşen puanları e 'fitgmdist' fonksiyonu ve varsayılan optimum kümeler her numara için gmms oluşturmak.
   4. Negatif günlük olasılığını, Akaike bilgi ölçütü ve Bayes bilgi kriterini inceleyerek her GMM değerlendirin. düşük kriterlerine GMM en uygunudur.
   5. İstenirse, kümelerin sayısı (her kümenin araçlarının her GMM "mu" çıktı saklanır) optimum olduğunda her küme için ortalama değerler önemli ölçüde farklı olup olmadığını test edin.

Kümelenmiş Verilerin 6. İstatistiksel Analizler

1. kümelerin en uygun sayısı hiyerarşik kümelenme kullanılarak tespit ve değerlendirildikten sonra, kümeler halinde orijinal veri, ayrı nöronlar dönmek ve morfolojik ölçümlerini benzersiz sınıflara nöronların kümelenme katkıda belirlemek.
2. nöronlar küme atama göre gruplandırılmış şekilde orijinal morfolojik metrik verileri sıralamak. nöronlar arasında (bütün nöronlar için veya kümeler halinde ayrılmış nöronlar için) morfolojik veriler arasındaki ilişkileri incelemek için gerçekleştirmek lineer regresyon morfolojik metrik gözlemlerin 2- ve 3-yollu karşılaştırmalar uyuyor. Bu uyan 'fit' fonksiyonunu kullanarak tahmin ve fit çıktıların iyilik regresyon uyuyor R ² ve p değerleri içerir hangi 'fitlm' fonksiyonunu kullanarak değerlendirilebilir.
3. Her küme nöronlar arasındaki istatistiksel ilişkiyi incelemek için küme sayısına bağlı olarak non-parametrik iki örneklem (Wilcoxon rank-sum testi) veya çoklu-örnek karşılaştırmalar testleri (ANOVA), kullanın. Önemli bir şekilde, birden çok örnekli ANOVA kullanımı p değerleri çoklu karşılaştırmalar için düzeltilir sağlar.

Representative Results

Bir seçici nüfus içinde nöronların büyük ölçekli rekonstrüksiyonlar dLGN ⁵ modifiye kuduz virüsünün mümkün enjeksiyonu takiben olduğunu göstermiştik. Son zamanlarda, aynı doku TRN görsel sektörde 160 nöronların yeniden kullanılmıştır (Bragg ve arkadaşları, yorumda,. Şekil 2A-B), yukarıda tarif edilen ayrıntılı metodolojik aşağıdaki basamakları. TRN çalışmasında, TRN nöron üç benzersiz kümeleri bağımsız 10 morfolojik metrik küme analizine dayanarak belirlenmiştir: Hücre vücut alanı, hücre gövdesi yuvarlaklık, TRN içinde TRN, dorsal-ventral pozisyona merkezine medial-lateral pozisyon akraba dendritik ağaçlar, düğümleri ortalama dendritik mesafe, 3 ^rd ortalama uzunluğu ve yüksek dereceli dendritler, ^1. sipariş dendritler ortalama açısı, toplam dendritik arborization ortalama faz açısı, ve açısal sapma sayısıtal dendritik arborization. TRN nöronlar eşdeğer bu üç kümelerden (Şekil 2C) arasında dağıtıldı. Üç kümeler halinde nöronlar arasında 10 morfolojik metrik ayrı istatistiksel karşılaştırmalar orijinal küme analize dahil morfolojik metrik tüm ama iki kümeler arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar bulunmuştur. Böylece, küme analizi (Şekil 2C) ve gruplar arasında morfolojik metrik ayrı istatistiksel karşılaştırmalar üretilen hiyerarşik ağaç dendrogram dayalı TRN nöronlar üç benzersiz gruba ayrılır.

Bu çalışmada, biz özellikle ayrı bir küme analizi ile belirlenen kümeleri değerlendirmek için istatistiksel yöntemleri uygulamak istedi. önceki çalışmanın TRN veri kümesi gözlenen üç kümeleri optimum olup olmadığını belirlemek için değerlendirildi. Ayrı ek küme, yani PCA ve GMM Clus analizlerimetreler önce kümeleme yöntemi (Şekil 1) kontrol etmek için yapılmıştır. Üç anahtar sonuçlar ayrı ayrı önce küme analizi doğrulayın. Orijinal küme analizi yöntemi kümeleri oluşturmak için 'bağlantı' fonksiyonunu belirterek 'evalclusters' fonksiyonunu kullanarak değerlendirildiğinde Öncelikle, kümelerin en uygun sayıda hiyerarşik ağaç dendrogram (Şekil 2C) dayalı orijinal sonuca eşleşen 3 oldu. İkincisi, PCA morfolojik metrik katkıları dayalı nöronlar gruplama alternatif bir araç olarak 160 TRN nöronlar için 10 morfolojik metrik orijinal karekod gerçekleştirildi. Üç gmms TRN nöronlar, 1, 2 ya da 3 farklı kümeler halinde gruplandırılmıştır varsayılarak elde edildi. Negatif günlük olabilirlik (NLL) ve Akaike bilgi kriteri (AIC) düşük bulunmuştur ve bu nedenle en bilgilendirici, değerler ve GMM (Figür TRN morfolojik verileri tanımlamak için 3 küme kullanıldığında her iki değer optimum edildie 3). Üçüncüsü, GMM tabanlı kümeleme ayrı hiyerarşik ağaç dendrogram 3. Böylece gözlemler, üç kümeleri, PCA ve GMM- ayrılır nöronlar arasında morfolojik metrik istatistiksel karşılaştırmalar 'evalclusters' fonksiyonunu ve kümelerin en uygun numarasını kullanarak oldu değerlendirildi tabanlı kümeleme ve her kümeleme metodu (bağlantı ve GMM) ayrı değerlendirmeler, tüm TRN nöronlar optimal kullanılan 10 morfolojik metriklere dayalı 3 kümeleri ayrılır aynı sonucu vermiştir.

Şekil 1: Veri Biçimi. küme analizi dahil etmek bağımsız değişkenlerin toplam sayısına karşılık gelen nöronlar ve m = 5 sütun sayısına karşılık gelen n satır ile Örnek Karekod (Veri matrisinde başlıkları dahil değildir).

Şekil 2: 160 TRN Nöronlar Bağımsız Kümeleme. Sitokrom oksidaz etkinliği için boyanmıştır A. Sol bir hayvanın dLGN boyunca tek koronal kesit fotoğrafı, dLGN katmanları görselleştirmek ve GFP karşı virüsü enjeksiyonu görselleştirmek için. Ok yoğun retrograd etiketli TRN nöron bölgeleri gösterir. Bölüm yönelimi altında dorsal-ventral medial-lateral / (DV / ML) pusula takip ve ölçek çubuğu A tüm paneller için 500 mikron temsil eder. İkinci soldan, kontur virüs enjeksiyonu (siyah konturlar) içeren tüm bölümler için dLGN (kırmızı) ve TRN (kestane) özetliyor. Sarı yıldız enjeksiyon yeri merkezlerini gösterir. A gibi Oryantasyon ve ölçek barlar. A gibi kontür ve enjeksiyon yerinde, yönlendirme ve ölçek barlar sol, 3-d kaplamalar üçüncü. Sağ, konumların haritaları yeniden bir TRN nöronlar, renk kodlu bir tek agrega TRN kontür (bordo) içinde küme atama (C) 'ye göre. A gibi Oryantasyon ve ölçek barlar. B. TRN'nin içindeki medial-lateral pozisyona göre soğutmak için sıcak renkli 5 yeniden TRN nöronlar ile TRN (siyah) ve (gri) dLGN sol, toplam kontür. A DV / ML pusulaya göre yönlendirme, ölçek çubuğu 500 mikron temsil eder. Doğru, renk uyumlu ölçek barları ile aynı 5 TRN nöronların fotoğraflar 100 mikron temsil eder. Cı. 10 bağımsız morfolojik metriklere dayalı 160 yeniden TRN nöronlar arasındaki bağlantı mesafeleri gösteren kümeleme analizi aşağıdaki hiyerarşik ağaç dendrogram. Üç kümeleri mavi, yeşil ve kırmızı gösterilen. Bu rakamın tüm bölümleri Bragg ark dahil rakamlar uyarlanmıştır. (incelemede).sıska "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Küme Değerlendirilmesi. İki farklı kriter değerlerinin arsa, negatif günlük olabilirlik (kırmızı NLL) ve Akaike bilgi kriteri 1, 2 ya da 3 kümeleri varsayarak üç gmms üretilen (AIC, mavi). 3 kümeleri gmms en kriter değerleri sağlar.

Yan Kod Dosya: Örnek kod, bir Matlab uyumlu bir dilde yazılmış, PCA ve GMM yaklaşımları kullanarak küme değerlendirme tarafından izlenen bir örnek veri matrisi üzerinde küme analizi gerçekleştirmek için. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Discussion

Nöroanatomik çalışmalar nörobilim ve connectomics ve yapı-işlev ilişkilerinin son bir ilgi ayağı seçici nöronal popülasyonlarının detaylı morfolojik karakterizasyonu için coşku yeniledi kalmıştır. Geleneksel olarak, nöroanatomik çalışmalar uzman neuroanatomists tarafından tanımlanan nöronların morfolojik farklı sınıflara nöronların nitel sınıflandırmaları yararlanmıştır. nöronlar yeniden ve morfolojik veri ayıklamak için tekniklerindeki gelişmeler sayesinde, tarafsız bir şekilde morfolojik farklı nöronal sınıfları sınıflandırmak daha sofistike ve nicel veri analizi yöntemleri kullanmak artık mümkün. Bu çalışmada, adım adım yöntemler 1 için tarif edilmiştir) virüs aracılı retrograd etiketleme yöntemleri kullanılarak tek tek nöronların seçici etiketleme yüz; 2) bireysel nöronların sistematik yeniden yüzlerce içinde nöronların kapsamlı ve dolayısıyla temsili bir numune oluşturmak için Seçici nüfus; ve 3) bağımsız kümeleme morfolojik ölçümlere dayalı bir seçici nüfus içindeki nöronların optimal kümeleri belirlemek için istatistiksel değerlendirme ile analiz eder. Bu analiz yöntemleri TRN nöronların varolan veri kümesi farklı kümeleme yöntemleri uygulayarak tarafından doğrulanan ve biz TRN nöronlar optimum üç morfolojik ayrı alt popülasyonlar halinde kümelenmiş üç ayrı değerlendirme yöntemlerine dayalı işlemini göstermektedir.

Bu çalışmada açıklanan protokollerin önemli bir avantajı, bunların esneklik. G-silinen kuduz virüsü bir hedef yapısı içine enjeksiyonu takiben retrograd etiketli nöronların yüzlerce EGFP ifade sürüş etkili olmuştur. Aynı kuduz virüsü ^suşu, makak (revizyon Hasse & Briggs) maymunlar ^{5, 9,} dağ gelinciği, ve kemirgenler ⁷ dahil olmak üzere birden türlerde benzer etkilidir"> 8. Bu duruma göre, modifiye edilmiş kuduz virüsü seçici, bir hedef yapısı içine enjeksiyonu takiben nöronların bir nüfusun tam dendritik arborization desen etiket kullanılabilir. DAB / peroksit reaksiyonu takip GFP karşı antikor boyama, bu sürekli boyama neden olduğu önerilir nöronlar etiketlenmiş ve. Bununla birlikte, alternatif boyama yöntemleri mevcuttur ve / veya floresan ile doğrudan ölçüm istenirse. bir avantaj görselleştirilebilir doku bölümleri (daha uzun maruz kalma ile floresan etiket ağartıcıdır) floresans mikroskop yardımı olmadan, bir mikroskop altında görüntülenmiştir sağlar ham floresans farklı floresan moleküller ekspresyonunu farklı virüs nöronlar birden fazla hedef beyin dokusuna çıkıntı olup olmadığını belirlemek için, örneğin, kombine edilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, yukarıda belirtilen adım (örneğin akson ve dendritlerin için) kullanılabilir tüm morfolojik verilerin uygulanabilir giderek güçlü morpho etkinleştirmek içinnöronların mantıksal sınıflandırma. Kuduz virüsü küçük miktarlarda da dendrit ek akson rekonstrüksiyon için avantajlı olabilir seyrek retrograd etiketleme oluşturmak amacıyla enjekte edilebilir olduğuna dikkat etmek de önemlidir.

Bu çalışmada açıklanan analiz yöntemleri ek bir avantajı, çok sayıda farklı kümelenme yaklaşımları kullanılabilmekte ve mukayese edilebilir olmasıdır. küme analizinde her adımda, farklı seçenekler kümeleri oluşturmak için arası nöron parametre uzayında mesafeleri yanı sıra farklı algoritmalar hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, birden çok değerlendirme yöntemleri mevcuttur. bir araç uygun kümeleme doğrulamak için Örnek Sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi ikinci, özellikle yararlıdır. Kuşkusuz, kümeleri oluşturmak için ve tarla ilerledikçe kullanılabilir hale gelecektir optimum kümelenme değerlendirmek için ek algoritmaları. Birlikte, bu analiz yöntemleri IMPRO devam edeceknöroanatomi alanında nicel yaklaşımlar ettik ve bulguların sağlamlığı artırmak.

Bireysel etiketli nöronların nedeniyle by-el rekonstrüksiyon, zaman alıcı eğitim ve deneyim gerektiren ve hala biraz subjektif nöronal rekonstrüksiyonlarında otomasyonunda artan bir ilgi vardır. Bilgisayar tabanlı otomatik nöronal rekonstrüksiyon hala hata eğilimli olduğundan, elektron mikroskobu tabanlı nöroanatomik veriler hala (örneğin ¹⁷⁾ bakın insanlar tarafından analiz edilir. Ancak, otomatik nöronal yeniden yakın gelecekte mevcut olacak olasıdır. Otomatik nöronal yeniden böylece kümeleme analizi ve alan teknolojik ilerlemeye devam ettikçe burada özetlenen değerlendirme yöntemleri daha da önemli hale gelecektir, veri analizi ucunda daha fazla inceleme gerektirir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SADΔG-EGFP	E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute		Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten	FHC	UEPSGGSE1N2M	Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II	Drummod Scientific	3-000-204, 110V	Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome	Thermo Scientific
DAB	Sigma Aldrich	D5905-50TAB	3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C	Sigma Aldrich	C2037-100MG
Catalase	Sigma-Aldich	C9322-5G
Rabbit anti-GFP	Life Technologies/Thermo Fisher	#A-11122	Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	#BA-1000	Secondary antibody
Neurolucida System	MicroBrightField		Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer	MicroBrightField		Data export software
Microfire Camera	Optronics		2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope	Nikon Instruments Inc.		Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab	The MathWorks Inc.		Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel	Microsoft		Spreadsheet program