Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Storskala Rekonstruksjoner og Independent, Upartiske Clustering Basert på Morfologiske Metrics å klassifisere nevroner i Selektive populasjoner

Published: February 15, 2017 doi: 10.3791/55133
Automatic Translation
1, 1
1Physiology & Neurobiology, Geisel School of Medicine at Dartmouth

Summary

Denne protokollen beskriver store rekonstruksjoner av selektive nevronale populasjoner, merket følgende retrograd infeksjon med en modifisert rabies virus uttrykker fluorescerende markører, og uavhengig, upartisk klyngeanalyser som muliggjør omfattende karakterisering av morfologiske beregninger blant forskjellige nevrale underklasser.

Abstract

Denne protokollen beskriver store rekonstruksjoner av nerveceller kombinert med anvendelse av uavhengige og objektiv clustering analyser for å skape en omfattende undersøkelse av de morfologiske egenskaper ble observert blant en selektiv neuronal populasjon. Kombinasjon av disse teknikker utgjør en ny fremgangsmåte for innsamling og analyse av data nevroanatomi. Sammen utgjør disse teknikkene gjør det mulig i stor skala, og derfor mer omfattende, prøvetaking av selektive nevronale populasjoner og etablere objektive kvantitative metoder for å beskrive morfologisk unike nerve klasser innen en populasjon.

Protokollen skisserer bruk av modifiserte rabiesvirus til selektivt å merke neuroner. G-slettet rabies virus fungerer som en retrograd tracer følgende stereotaxic injeksjon i et mål hjernens struktur av interesse, og fungerer som et redskap for levering og uttrykk for EGFP i nerveceller. Et stort antall nerveceller blir infisert ved hjelp av denneteknikk og uttrykke GFP gjennom sine dendritter, produsere "Golgi-lignende" komplette fyllinger av enkelte nerveceller. Følgelig forbedrer virus-mediert retrograd tracing metoden på tradisjonelle fargestoffbaserte retrograd følgeteknikk ved å produsere komplette intracellulære fyll.

Individuelle godt isolerte neuroner som strekker seg over alle områder av hjernen område som undersøkes blir valgt for rekonstruksjon for å oppnå en representativ prøve av nerveceller. Protokollen skisserer prosedyrer for å rekonstruere celle organer og full dendrittiske arborization mønstre av merket nevroner som strekker seg over flere vevssnitt. Morfologiske data, inkludert stillinger hver nervecelle i hjernen struktur, er hentet for videre analyse. Standard programmeringsfunksjoner ble brukt til å utføre selvstendig klynge analyser og klase vurderinger basert på morfologiske beregninger. For å verifisere nytten av disse analysene, statistisk evaluering av en klyngeanalyse gjengivelseRMED på 160 nevroner rekonstruert i thalamic reticular kjernen i thalamus (TRN) av macaque ape ble gjort. Både den opprinnelige klyngeanalyse og statistisk evaluering som utføres her tyder på at TRN nevroner er delt inn i tre subpopulasjoner, hver med unike morfologiske egenskaper.

Introduction

Nevroanatomi er en av grunnlaget for nevrovitenskap 1 og nyere interesse "connectomics" har fornyet entusiasme for å forstå den morfologiske mangfoldet av nevronale populasjoner og sammenhenger mellom spesifikke nevroner 2. Metoder for merking og gjenreise nevroner har kraftig forbedret med nyvinninger, inkludert genetisk og virus-mediert krets tracing nærmer tre, fire, slik at mer omfattende morfologiske undersøkelser av neuronpopulasjoner 5. I tillegg til forbedringer i merking enkelte nerveceller har kvantitativ dataanalyse teknikker også dukket opp som gjør det mulig uavhengig og objektiv klassifisering av nevroner i forskjellige subpopulasjoner basert på morfologiske data 5, 6. Disse objektive teknikker er en forbedring på mer tradil kvalitative klassifiseringsmetoder som har vært standard i feltet for over et århundre. Målet med denne studien er å skissere, trinn-for-trinn, er kombinasjonen av virus-mediert merking av nevroner i en selektiv befolkning, store rekonstruksjoner av et omfattende utvalg av disse nevronene, og kvantitativ dataanalyse basert på uavhengig gruppering med statistisk evaluering. Ved å kombinere disse metodene, skissere vi en ny tilnærming mot innsamling og analyse av nevroanatomi data til rette omfattende prøvetaking og objektiv klassifisering av morfologisk unike nerve typer innenfor en selektiv nevronale befolkningen.

Som et eksempel på disse metoder vil vi beskrive vår analyse av en stor populasjon av neuroner i løpet av en enkelt sektor av thalamiske retikulære kjernen (TRN) av makakerape. Disse dataene er fra en tidligere studie 7. Metoder for selektiv merking TRN nevroner projisere til rygg Lateral geniculate kjernen i thalamus (dLGN) ved hjelp av kirurgisk injeksjon av modifiserte rabies virus koding EGFP 4, 8 (se tabell over spesifikke materialer / utstyr, rad 2) er skissert. Denne modifiserte rabies virus mangler genet som koder for en essensiell kappeproteinet, noe som eliminerer trans-synaptiske bevegelse av viruset. Når viruset kommer inn axon terminaler på injeksjonsstedet, fungerer den som en tradisjonell retrograd tracer med den viktige fordelen av å kjøre EGFP uttrykk gjennom hele dendrittiske arborization av infiserte nevroner 5, 9, 10. Følgelig kan dette G-slettet rabies virus brukes til å selektivt infisere og merke noen nevronale befolkningen etter injeksjon, og retrograd transport.

For å utføre en omfattende analyse av en bestemt neuronal populasjon, er det viktig å ta prøver fraen bred distribusjon av nevroner i befolkningen. På grunn av at virus-mediert merkingsteknikk frembringer fullstendig intracellulære ", Golgi-lignende" fyller mange neuroner med aksoner på viruset injeksjonsstedet, er det mulig å rekonstruere et meget stort utvalg av neuroner innenfor det fulle omfang av en hjernestrukturer. I tillegg, fordi den modifiserte rabiesvirus er så effektiv til å infisere og merking av et stort antall neuroner, er det mulig å rekonstruere hundrevis av nerveceller pr dyr. Prosedyrer for prøvetaking 160 neuroner i hele den visuelle delen av TRN 11 for å generere en fullstendig prøve av dLGN-utstikk TRN neuroner er skissert. Prosessen med å rekonstruere individuelle nevroner ved hjelp av et nevron rekonstruksjon system som omfatter et mikroskop, kamera, og rekonstruksjon programvare er beskrevet. Også beskrevet er metoder for å bestemme posisjonene til de enkelte neuroner i løpet av en hjernestruktur (i dette tilfellet innenfor TRN) og for å kontrollere viruset injeksjon site volum og plassering innenfor en struktur (i dette tilfellet i dLGN) ved hjelp av volumetriske kontur rekonstruksjoner. Trinnene for å eksportere morfologiske data og utføre selvstendig klynge analyser basert på morfologiske beregninger målt for hver nervecelle er skissert. Det er begrensninger for clustering metoder, og det finnes også en rekke forskjellige clustering algoritmer tilgjengelig. Følgelig er disse alternativer og fordelene ved noen av de mer vanlige algoritmer beskrevet. Klyngeanalyse gir ikke statistisk verifisering av det unike i klynger. Derfor er flere trinn skissert for å bekrefte optimal clustering samt forholdet mellom morfologiske data innenfor og på tvers klynger. Statistiske metoder for å vurdere klynger for TRN datasettet for å bekrefte at TRN nevroner er gruppert i tre unike klynger basert på 10 uavhengige morfologiske beregninger er beskrevet.

Dermed ved å skissere fremgangsmåten for selektiv merking, Rekonstruere, og analyse av morfologiske data fra en spesifikk neuronal populasjon, beskriver vi fremgangsmåter for kvantifisering av morfologiske forskjeller mellom neuronene innenfor en befolkning. Tidligere funn av forskjellige nevronale typer innen den visuelle delen av makakerape TRN er bekreftet med separate statistiske evalueringsmetoder. Sammen håper vi disse teknikkene vil være bredt gjeldende for nevroanatomi datasett og bidra til å etablere kvantitative klassifisering av mangfoldet i neuronpopulasjoner gjennom hjernen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: vev undersøkt i denne studien ble framstilt som en del av en egen studie fem. Derfor er alle de eksperimentelle metoder som involverer bruk av dyr som er blitt beskrevet i detalj i den Eksperimentelle metoder delen av Briggs et al. (2016). Alle prosedyrer som involverer dyr utført som en del av den tidligere studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komiteer. Trinnene for injeksjon av virus i dLGN og histologisk behandling av hjernevevet er kort beskrevet nedenfor i avsnitt 1 - 2.

1. stereo Injection

  1. Utfør alle kirurgiske prosedyrer i et sterilt miljø ved hjelp av aseptisk teknikk. Steam-sterilisere all metall kirurgiske instrumenter, gasbind og drapere materiale i autoklav. Steriliser alle materialer som kan skades av damp ved hjelp av kjemisk sterilisering (f.eks etylenoksid).
  2. Fremkall og vedlikeholde anestesi henhold til dyre- og protocol spesifikke krav.
    1. For virus injeksjon hos aper, indusere anestesi med ketamin (10 mg / kg) og vedlikeholde dyr under fullt kirurgisk anestesi med isofluran (1-3% inhalert oksygen) overvåking utløpt CO 2, EKG, respirasjon rate, og temperaturen kontinuerlig og periodisk kontroll for kjeve tone for å sikre riktig anestesidybde.
  3. Plasser dyret i en stereotaxic ramme for å stabilisere hode posisjon og for å tillate bruk av stereotaxic koordinater for å finne injeksjon strukturen av interesse (f.eks dLGN). Hvis måle visuelle responser, drops sted øyet (1% atropin øyedråper hvis elev dilatasjon er ønskelig, ellers faller saltvann øye) og deretter kontaktlinser i begge øynene for å hindre tørrhet. Hvis ikke måle visuelle svar, plasserer oftalmisk salve i øynene.
  4. Lag en midtlinjen skalp snitt og huden og musklene trekke.
  5. Ifølge stereotaxic koordinater for strukturen av interesse (dLGN) i en hemisphere, lage en liten kraniotomi.
  6. Gradvis lavere en innspilling elektrode (f.eks wolfram eller platina / iridium elektrode (se tabell over spesifikke materialer / utstyr, rad 3) festet til en micromanipulator som er manuelt plassert) gjennom kraniotomi inn i hjernen. Lavere impedans (<1 Megohm) og litt tykkere (~ 250 mikrometer diameter) elektroder kan benyttes for å trenge inn i dura, om ønskelig.
  7. Spill manipulatoren stilling ved kortikale overflaten og ved det punkt hvor visuelle respons blir målt. Visuelle svar er hørbar, tid-låst nevrale responser på lys blinket i øynene med et oftalmoskop eller liten LED / lommelykt.
  8. Bestemme plasseringen og tykkelsen på dLGN ved å bemerke manipulator stillinger i starten, midten og slutten av visuelle svar og trekke kortikale overflateposisjon fra disse verdiene. Spill dypet for hvert utviklet injeksjonssted innenfor dLGN.
    MERK: Ligner procedures kan brukes for å lokalisere ikke-visuelle strukturer ved hjelp av egnede sensoriske stimuli. I tillegg kan koples opptak / injeksjonssystemer også anvendes til å målrette små strukturer i hjernen.
  9. Når optimale injeksjonssteder er nevnt, fjerne opptaks elektrode og plassere en injeksjon pipette (glass pipette eller sprøyte) på samme stereotaxic posisjon og lavere til riktig dybde for hver injeksjon, og starter med den dypeste injeksjonsstedet og går videre til grun, venter minst 1 min etter injeksjon før du endrer elektrode posisjon. Glass pipetter med ytre diameter på ~ 50 pm kan redusere tilbakestrømning av virus i forhold til sprøyte tips (~ 200 mikrometer diameter).
  10. Ved hjelp av en injeksjon system (se tabell over spesifikke materialer / Equipmen t, rad 4), picospritzer eller sprøytepumpe, injisere små mengder (1 - 5 mL; referere til produsentens instruksjoner for injeksjon prosedyrer) modifisert rabies virus enn flere (3 - 10) Snødybdermed en hastighet på ~ 100 nL / min i målstrukturen (dLGN). Merk: Separate injeksjons gjennomføringer kan gjøres i større målet strukturer (f.eks ape dLGN). Juster totalt injeksjonsvolum i henhold til målstrukturen størrelse.
  11. Pause minst 5 min før trekke injeksjonen pipette. Når injeksjons pipette er fjernet, fyller kraniotomi med beskyttende materiale (lim bein brikke på plass, gjelder bein voks eller gelfoam), deretter sy muskelen og huden sammen igjen.
  12. Administrere analgetika (f.eks ketoprofen) og antibiotika før slutten av kirurgi og overvåke dyr kontinuerlig til dyr er ambulerende.
  13. For minst 3 dager og opp til 10 dager etter operasjonen, overvåke dyr daglig for å sikre sting er ren, tørr og intakt og dyr viser ingen tegn til smerte eller ubehag. Administrere daglige smertestillende og antibiotika etter behov. Begynn boligsosialt av post-kirurgisk dyr etter dyr er fullstendig restituert fra kirurgi.
    14. </ Ol>

    2. Tissue Høsting, Seksjonering, og Farging

    1. Tillat 7 - 14 dager etter retrograd transport av virus, så avlive dyret ved overdose av eutanasi løsning (f.eks Euthasol) og perfuse dyret transcardially med 0,1 M fosfat saltløsning, 4% paraformaldehyde, deretter 4% paraformaldehyde med 10% sukrose.
    2. Ta av hjernen (se 12 for analoge trinn i en gnager-modell) og plasser i 20 - 30% sukrose med 4% paraformaldehyde i 0,1 M fosfatbuffer og avkjøl i 1 - 2 dager.
    3. Når hjernen har sunket til bunnen av beholderen, fjernes den og skjære vevet i blokker som inneholder hjerneregionen med retrograd merkede nevroner (f.eks visuelle cortex) og injeksjons målstrukturen (f.eks dLGN). Kutt de samme blokker av vev fra den ikke-injiserte halvkule - disse vil tjene som kontrollseksjoner. For best resultat, begynner histologiske prosedyrer immediately på fersk seksjonert vev.
    4. § vev coronally med en tykkelse på 50 mikrometer per seksjon ved hjelp av et fryse mikrotom (se tabell over spesifikke materialer / utstyr, rad 5).
    5. Flekk alle seksjoner for cytokromoksydase aktivitet (se tabell over spesifikke materiell / utstyr, rader 5 - 8) for å visualisere cortical lagene og subkortikale strukturer 13. Merk: Profiler kan lagres over natten i kjøleskap i siste skylling etter cytokromoksydase flekken.
    6. Merk alle seksjoner med en primær antistoff mot GFP (1: 1000 fortynning, ~ 12 timers inkubasjon, se tabell over spesifikke materialer / utstyr, rad 9) etterfulgt av et sekundært antistoff som passer til hovedvert og merket med biotin 5 (1: 500 fortynning , 2-4 timers inkubasjon, se tabell over spesifikke materialer / utstyr, rad 10). Det anbefales å inkubere seksjoner i det sekundære antistoff over natten.
    7. Merk seksjoner med en avidin / biotin kompleks da reagere med DAB og peroxide til permanent beis alle merket nevroner 5.
    8. Monter delene på subbed glass og la tørke over natten.
    9. Avfette deler ved hjelp av en serie av alkohol og xylen rinses deretter dekke slip 14.

    3. Neuronal Reconstruction

    MERK: Alle rekonstruksjoner for originale eksperimenter ble gjort ved hjelp av et nevron rekonstruksjon system består av et mikroskop (se tabell over spesifikke materialer / utstyr, rad 14), festet kameraet (se tabell over spesifikke materialer / utstyr, rad 13), og rekonstruksjon programvare pakke (se tabell over spesifikke materiell / utstyr, rader 11 - 12). Programvare-assistert nevronale rekonstruksjon muliggjør visualisering av vev lysbilder kledde med databaserte tegninger av nevronale prosesser. Viktigere, digitaliserer programvaren morfologiske reconstrucsjons data i tre dimensjoner, som muliggjør utvinning av posisjonsspesifikk morfologisk informasjon. Den tilhørende data utvinning programmet (se tabell over spesifikke materialer / utstyr, rad 12) muliggjør utvinning av et rikt sett med morfologiske data fra hvert lagret gjenoppbygging.

    1. Plasser et lysbilde i objektglass holderen og fokusere på en enkelt del av interesse å bruke en lav-forstørrelse objektiv (f.eks 2X eller 10X). Kontroller at kamerabildet er synlig i programvaren visningen ved riktig posisjonering kameraet lukkeren.
    2. Velge merkede nerveceller i hjernen strukturen av interesse (f.eks TRN) som er rimelig isolert så som entydig å rekonstruere så mye av dendrittiske arborization som mulig. Fortrinnsvis velger neuroner hvis cellelegemet er fullstendig i løpet av en enkelt seksjon for å fange opp den største utstrekning av hver celle legeme og nøyaktig å anslå dens område og rundhet. Bruk 10X mikroskop mål å identifisere celle body i hjemmet delen.
    3. Når et godt farget, godt isolert nevron er identifisert, legge til "hjem" -delen inneholder cellekroppen til Seksjonssjef ved å klikke på "Ny §" -knappen. Skriv inn antall seksjoner for å inkludere (anbefaler 2 - 3 deler for å begynne). Tildele en del tykkelse på 50 mikrometer når du blir bedt om (se trinn 2.3).
    4. Spore konturene av relevante strukturer i hjernen i hjemmet delen som inneholder cellen kroppen. Bruk 2X objektiv / forstørrelse for kontur sporing.
      1. Først velger du "Contour" fra rullegardinmenyen øverst til verktøylinjen og velg deretter konturen type fra rullegardinmenyen (for eksempel "LGN" eller "TRN").
      2. Spore konturene av målstrukturen (f.eks TRN) samt tilstøtende strukturer, om ønsket, ved å klikke på punkter langs konturen ved hjelp av musen som uavgjort verktøy.
      3. Velg "Close Contour" ved å høyreklikke på musen og velge dette alternativetfra menyen for å fullføre og legge hver spores kontur.
    5. Plasser en markør på midten av målet struktur ved å klikke på ønsket markør symbol på høyre verktøylinjen og deretter klikke på ønsket sted i gjenoppbyggingen å plassere markøren på det stedet. Bruk samme type markør for å markere midten av målstrukturen i alle rekonstruksjoner.
    6. Når konturene er fullført, spore omrisset av cellen kroppen ved hjelp av 40 - 60X mål / forstørrelse. For å gjøre dette, velger du først "Neuron" fra rullegardinmenyen øverst til verktøylinjen og velg deretter nervecellen struktur å spore, i dette tilfellet "Cell Body". Neste spore cellen kroppen som i 3.4.
    7. Plasser en annen stil markør på midten av cellen kroppen, å følge instruksjonene på 3,5.
    8. Spore alle dendritter som begynner på cellekroppen.
      1. Først velger du "Dendritt" fra rullegardinmenyen. Deretter spore hver dendritt starter på celle body og ved hjelp av musen som uavgjort verktøy. Sørg for å justere z-depth hele tracing til nøyaktig fange vinkel og retning av dendrite.
      2. Plasser en node på hver gren punkt langs Dendritt ved å høyreklikke på musen og velge "Bifurcating Node" eller "Trifurcating Node" fra rullegardinmenyen. Bruk 40 - 60X objektiv / forstørrelse for alle dendrite rekonstruksjoner.
      3. På slutten av hver Dendritt, høyreklikk på musen og velg "Ending" fra rullegardinmenyen.
    9. Identifisere dendrittiske avslutninger som sannsynligvis vil fortsette inn i den tilstøtende delen og bringe disse i fokus på riktig z-dybde i mikroskopbilde. Inkluder viktige landemerker i nærheten som blodkar eller lett gjenkjennelige dendrite mønstre eller bunter i mikroskopbilde.
      1. Reduser forstørrelse til 20X eller 10X på mikroskopet (velg forstørrelses som gjør størst landemerke visualisering), og taet bilde av mikroskopet bildet ved hjelp av et digitalt kamera (f.eks mobiltelefon, nettbrett) håndholdt til dataskjermen.
    10. Flytt til den tilstøtende delen på lysbildet og stille opp konturene av tidligere spores seksjon med grensene for dLGN og TRN i den nye delen.
    11. Returner synsfeltet til den generelle delen av cellen kroppen (basert på konturer og viktige landemerker) og bringe forstørrelsen tilbake til 10 - 20X.
    12. Bruk bilde av dendrite avslutninger fra tidligere spores delen for å hjelpe til med å samkjøre avslutninger med begynnelsen av dendritter i den nye delen.
      1. Hvis du vil rotere sporing og flytte den til å justere dendritter, bruker du pil verktøyet til å velge gjenoppbygging, høyreklikk og velg "Flytt" fra rullegardinmenyen.
      2. Alternativt kan du bruke "Match" verktøy for å matche dendrittiske avslutninger til begynnelse. Velg Match verktøyet fra verktøylinjen øverst, og når du blir bedt om å klikke på avslutningeni gjenoppbyggingen og den tilsvarende videreføring punkt i bildet. Gjenta for 3 eller flere avslutninger.
    13. Når sporing fra forrige avsnitt er foret opp med dendritter i den nye delen, må det tilsvarende nye delen er valgt i seksjonsleder ved å klikke på den aktuelle delen. Eller legg til en ny del til Seksjonssjef, som beskrevet ovenfor i 3.3, justere z-dybde og plasseringen av hver ny seksjon i forhold til hjemmeseksjonen tilsvarende og sette hver del tykkelse på 50 mm (se trinn 2.3).
    14. Øke forstørrelsen til 40 - 60X og spore dendrite fortsettelser ved å høyreklikke med musen på slutten av dendrite fra rekonstruksjonen og velge "Legg til Ending" fra rullegardinmenyen, og sporing dendrite hjelp av musen som en tegne verktøyet. Følg bedt om å oppgi om videreføring er i den nye delen.
    15. Følge dendritter gjennom i det minste 3 tilstøtende seksjoner (en på hver side avhjemmet seksjon) etter trinn 03.08 til 03.15. Legg til gjenoppbygging før minst 3 totalt seksjoner er spores for nervecellen eller til dendritter kan ikke lenger bli fulgt eller funnet. Trace konturer i naboseksjoner følgende trinnene ovenfor, hvis ønskelig.

    4. Uavhengig Clustering

    Merk: Uavhengig cluster-analyser gjør det mulig objektive analyser av store, multi-dimensjonale datasett som ellers kan være vanskelig å visualisere og, viktigst, gi en kvantitativ vurdering av morfologisk mangfold. En matrisebasert programmering plattform er ganske nyttig for analyse av multi-dimensjonale datasett, og muliggjør sofistikert data manipulasjoner og statistiske analyser. De er oppført i trinn 4 funksjoner - 6 er definert i programmering plattform oppført i tabellen over spesifikke materialer / utstyr, rad 15.

    1. Utdrag morfologiske data fra hver enkelt neuronal rekonstruksjon med en extraction program knyttet til nevron gjenoppbygging system (se tabell over spesifikke materiell / utstyr, rader 11 - 12).
      1. Først velger de morfologiske data ønskede for hver gjenoppbygging inkludert: kontur informasjon, men da informasjon, morfologiske data cellekroppen og dendrittiske arborization, osv.
      2. Fra rullegardinmenyen Rediger i den øverste verktøylinjen, velger du "Velg alle objekter". Deretter velger du "Forgrenet Structure Analysis" fra rullegardinmenyen Analyse i den øverste verktøylinjen og klikk på hver kategori, og velg de ønskede analysemuligheter i hver kategori.
      3. Pakk alle ønskede data ved å klikke på "OK" -knappen i Analysis vinduet og lagre i et regneark format ved å høyreklikke på utgangs vinduer og velge "Eksporter til Excel".
    2. Utarbeide en Master regneark (se tabell over spesifikke materialer / utstyr, rad 16), hvor hver morfologiske variable / megtric er representert ved en enkelt numerisk observasjon per neuron. I denne Master regneark, holde oversikt over raden identifikator for hver nervecelle.
    3. Kontroller at alle variabler som inngår i klyngen analyse (f.eks morfologiske beregninger) er uavhengige av hverandre. For eksempel, vil antallet av noder er korrelert med antall grener i en dendrittisk eller aksonal arborization. Følgelig, skal bare en av disse to variable være inkludert i en klynge analyse.
    4. Sørg for at hver måling inneholder en observasjon for hver variabel, dvs. hvert nevron (måling), må ha en datapunkt (observasjon) tilsvarer hver morfologisk metrisk (variabel). Hvis observasjoner for en bestemt variabel (for eksempel axon lengde) mangler for en undergruppe av nevroner, kan denne variabelen (axon lengde) ikke tas med i klyngeanalyse.
    5. Organiser dataene på Master-regneark til en enkelt matrise der hver rad representerer et nevron og each kolonnen inneholder numeriske data for hver morfologisk metriske (figur 1). For eksempel, et datasett inkludert neuroner 100 der det er observasjoner for 5 uavhengige variabler vil være representert av en 100 x 5 (rad-for-kolonne) matrise. Det er ikke nødvendig å ta noen identifikasjon for hver nervecelle i matrisen - raden indeksen vil tjene som hvert nevron unike identifikator. Det bør også være uten hull eller "NaN» s i matrisen. Lagre matrisen som en enkelt variabel (f.eks Data = [100 x 5 matrise]; se Opplysning kodefilen for eksempelkode).
    6. Velge en algoritme for å beregne avstanden mellom punkter som representerer individuelle nevroner i et n-dimensjonalt rom, hvor N er definert ved antall variable. The 'pdist' funksjonen lar fleksibilitet ved beregning av mellom-neuron avstander. Standard avstand beregningen er Euklidsk avstand og har vært brukt tidligere for tilsvarende analyser av neuronal morphological data 5, 6.
    7. Med mellom-nevron avstander utgangen av 'pdist' funksjon, bruk 'kobling' funksjon for å danne klynger. Igjen, flere clustering alternativer er tilgjengelige. Ward metode og Tyngdepunktet avstand har gitt lignende resultater i analyser av morfologiske datasett 5, 6.
    8. Om ønskelig, kan du bruke 'kmeans' funksjon som et alternativ gruppering tilnærming til 'pdist' og 'linkage' funksjoner. 'kmeans' syssels squared Euklidsk avstand for å beregne mellom-nevron avstander og deretter Tyngdepunktet avstand for å tildele klynger.
    9. For å visualisere et hierarkisk klynge tre, bruke 'dendrogram "-funksjonen på produksjonen av" sammenhengen "drift. Denne funksjonen har en standardinnstilling som begrenser visualisering 30 målinger, men det kan overstyres ved å angi antall målinger (<em> f.eks nevroner) som vises. Dendrogrammet illustrerer ledd avstander på y-aksen for hver av neuronene, identifisert ved deres rad indeks på x-aksen.
      MERK: Utgangene 'kobling' og 'dendrogram' ikke definerer det optimale antallet klynger. Utgangen av 'kmeans' ikke tilordne målinger til klynger, men det betyr ikke teste om disse klyngene er optimal. Separate statistiske sammenligninger og verifikasjon av optimal gruppering kan bli utført (se nedenfor).

    5. Verifisering av Clustering

    Merk: Som nevnt ovenfor, gjør det klyngeanalysen i seg selv ikke direkte gir en statistisk vurdering av om de klynger som er illustrert i klyngen dendrogram er unike og representativt for prøven. Metoder for å verifisere klynger fra dendrogram er foreslått 15, men disse ikke gir statistisk verifikasjon av optimal clustering. Det er multiple metoder for å verifisere optimal clustering.

    1. Metode 1: Evaluering clustering:
      1. Bruk 'evalclusters' funksjon som angir hvilken metode som brukes for å beregne klynger, som for eksempel 'kmeans' eller 'kobling'. En Gaussian blanding modell utgang kan også bli vurdert (se trinn 5.2 nedenfor, se Opplysning kodefilen for eksempelkode).
      2. Angi vurderingskriterium fra en rekke alternativer (f.eks 'CalinskiHarabasz' - for beskrivelser av kriterier alternativer, se Hjelp-menyen, søker etter "evalclusters").
      3. Angi et område av optimale klyngenumre for å teste (f.eks [1: 6] for å teste hvorvidt 1, 2, 3, 4, 5, eller 6 klyngene er optimalt).
        Merk: Utgangen av 'evalclusters' er et optimalt antall klynger gitt clustering algoritmen og kriterium spesifisert.
    2. Metode 2: Gaussian blanding modell clustering:
      MERK: Gaussian blanding modell clustering Algorithms (GMM) antar at observasjoner for hver variabel kommer fra en blanding av Gaussiske fordelinger som definerer hver antatte klynge, hver med sin egen middelverdi og kovarians. GMM bruker deretter en forventning maksimering algoritme for å tildele posteriore sannsynligheter for hver måling, noe som indikerer sannsynligheten for å tilhøre en bestemt klynge 16.
      1. Implementere en GMM ved hjelp av 'fitgmdist' funksjon ved å taste inn den antatte antall klynger observer i dataene. Alternativt, for å unngå a priori tildeling av antall klynger, bruker hovedkomponentanalyse (PCA) med en rekke ulike optimale klase tall ved hjelp av fremgangsmåten her (se Supplemental kodefilen for eksempelkode).
      2. Bruk 'PCA-funksjonen på de opprinnelige dataene matrise og lagre de viktigste komponent score som en utgang.
      3. I en sløyfe som starter på 1 og går gjennom et antall mulige optimale klynger, bruke the 'fitgmdist "-funksjonen på de viktigste komponent score og generere GMM for hvert nummer av mulige optimale klynger.
      4. Vurdere hver GMM ved å undersøke den negative log sannsynlighet, Akaike informasjon kriterium, og Bayes informasjon kriterium. GMM med lavest kriteriene er optimal.
      5. Om ønsket teste om gjennomsnittsverdiene for hver gruppe er vesentlig forskjellige når antall klynger er optimal (middel for hver gruppe blir lagret i "mu" utgangen fra hver GMM).

    6. Statistiske analyser av Gruppert data

    1. Når det optimale antallet klynger bestemmes ved hjelp av hierarkisk clustering og evaluert, gå tilbake til de opprinnelige dataene, separate nerveceller i klynger, og finne ut hvilke morfologiske beregninger bidra til gruppering av nerveceller i unike klasser.
    2. Sortere de opprinnelige morfologiske metriske data slik at nevroner er gruppert etter klynge oppdrag. For å undersøke sammenhengen mellom morfologiske data på tvers av nevroner (for alle nevroner eller for nevroner delt inn i grupper), utføre lineær regresjon passer til 2- og 3-veis sammenligninger av morfologiske metriske observasjoner. Disse passer kan estimeres ved hjelp av 'fit' funksjon og evaluert ved hjelp av 'fitlm' funksjon der godhet passer utganger inkluderer R 2 og p-verdiene for regresjon passer.
    3. For å undersøke statistiske sammenhenger mellom nevroner i hver klynge, bruke ikke-parametrisk to-utvalg (Wilcoxon rank sum test) eller flere prøve sammenligninger tester (ANOVA), avhengig av antall klynger. Viktigere, sikrer bruk av multiple-sample ANOVAs at p-verdiene er korrigert for multiple sammenligninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidligere vist at store rekonstruksjoner av nevroner i en selektiv befolkning er mulig etter injeksjon av modifiserte rabies virus i dLGN 5. Nylig ble det samme vev anvendt for å rekonstruere 160 neuroner i den visuelle delen av TRN (Bragg et al, i gjennomgang;. Figur 2A-B) ved å følge den detaljerte metodiske trinn som er beskrevet ovenfor. I TRN studien ble tre unike klynger av TRN nevroner identifisert basert på uavhengig klynge analyse av 10 morfologiske beregninger: celle område på kroppen, cellelegemet rundhet, medial-lateral posisjon i forhold til midten av TRN, dorsal-ventral posisjon inne i TRN , antallet dendrittiske trær, gjennomsnittlig dendrittisk avstand til noder, midlere lengde på 3 rd og høyere ordens dendritter, gjennomsnittlig vinkel på 1 m ordens dendritter, gjennomsnittlig fasevinkelen for den totale dendrittiske arborization, og vinkelavviket til åtal dendrittiske arborization. TRN nevronene ble equivalently fordelt over disse tre klynger (Figur 2C). Separate statistiske sammenligninger av alle 10 morfologiske beregninger over nevroner i de tre klyngene ga statistisk signifikante forskjeller mellom klynger for alle, men to av de morfologiske beregninger inkludert i den opprinnelige klyngeanalyse. Således, basert på det hierarkiske treet dendrogram som genereres fra klyngeanalysen (figur 2C) og de separate statistiske sammenligninger av morfologiske beregninger over klynger, blir TRN neuroner klassifisert i tre unike grupper.

I denne studien vi spesielt ønsket å anvende statistiske metoder for separat å evaluere klynger bestemt med en klyngeanalyse. Den TRN datasett fra den tidligere studien ble undersøkt for å fastslå om de tre klynger observerte var optimal. Separat tilleggs cluster-analyser, nemlig PCA og GMM clusovervintring, ble utført for å bekrefte de tidligere clustering metoder (figur 1). Tre viktige utfall separat verifisere før klyngeanalyse. For det første, når den opprinnelige klynge analysemetoden ble evaluert ved hjelp av de 'evalclusters enes funksjon å angi «binding» funksjon for å generere klynger, det optimale antallet av klynger var 3, samsvarer med den opprinnelige konklusjon basert på det hierarkiske treet dendrogram (figur 2C). Dernest PCA ble utført på de opprinnelige dataene matrise av 10 morfologiske beregninger for 160 TRN nevroner som en alternativ måte å gruppere nevroner basert på bidrag fra morfologiske beregninger. Tre GMM ble generert, forutsatt TRN nevronene ble gruppert i 1, 2 eller 3 unike klynger. Den negative log sannsynlighet (NLL) og Akaike informasjon kriterium (AIC) ga den laveste, og derfor mest informative, verdier og begge verdiene var optimal når GMM brukt 3 klynger for å beskrive TRN morfologiske data (Figure 3). For det tredje, GMM-baserte clustering ble separat evaluert ved hjelp av "evalclusters enes funksjon og det optimale antallet klynger var 3. Dermed observasjoner av hierarkisk tre dendrogram, statistiske sammenligninger av morfologiske beregninger over nevroner delt i tre grupper, PCA og GMM- baserte clustering, og separate vurderinger av de enkelte clustering metode (hydraulikk og GMM), alle ga det samme resultatet som TRN nevroner er optimalt delt inn i 3 grupper basert på de 10 morfologiske beregninger utnyttet.

Figur 1
Figur 1: Data Format. Eksempel datamatrise med n rader som svarer til antallet av neuroner og m = 5 kolonner svarende til det totale antall uavhengige variabler som skal inkluderes i klyngeanalyse (ikke inkludere hoder i datamatrise).


Figur 2: Uavhengig Clustering av 160 TRN nerveceller. A. Venstre, fotografi av enkelt koronale snitt gjennom dLGN av et dyr, farget for cytokromoksydase aktivitet for å visualisere dLGN lag og mot GFP å visualisere virus injeksjon. Pil viser regioner av tette retrograd merket TRN nevroner. § orientering følger rygg-ventral / medial-lateral (DV / ML) kompass under og skala bar representerer 500 mikrometer for alle panelene i A. For det andre fra venstre, skisserer konturene av dLGN (rød) og TRN (rødbrun) for alle seksjonene som inneholder virus injeksjon (svarte konturer). Gule Stjernene viser injeksjonsstedet sentre. Orientering og skala barer som i en. Tredje fra venstre, 3-d gjengivelser av konturer og injeksjonsstedet, orientering og skala barer som i A. Høyre, kart over steder av rekonstruert TRN nevroner, fargekodet i henhold til klyngen oppdraget (C) i en enkelt aggregat TRN kontur (rødbrun). Orientering og skala barer som i en. B. Venstre, samlet konturene av TRN (svart) og dLGN (grå) med 5 rekonstruert TRN nevroner farget varm å kjøle henhold til deres medial-lateral posisjon i TRN. Orientering henhold til DV / ML kompass i A, skala bar representerer 500 mikrometer. Høyre, fotografier av de samme fem TRN nevroner med matchende farge skala barer som representerer 100 mikrometer. C. Hierarkisk tre dendrogram følgende cluster analyse illustrerer ledd avstander mellom 160 rekonstruert TRN nevroner basert på 10 uavhengige morfologiske beregninger. Tre klynger som er vist i blått, grønt og rødt. Alle deler av denne figuren er tilpasset fra tall som er inkludert i Bragg et al. (I gjennomgang).mager "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Cluster Evaluering. Plot av to ulike kriterieverdier, negativ log sannsynlighet (NLL, rød) og Akaike informasjon kriterium (AIC, blå) generert fra tre GMM forutsatt 1, 2, eller 3 klynger. GMM med 3 klynger tilby de laveste kriterieverdiene.

Supplemental File Kode: Eksempel kode skrevet i et Matlab-kompatibel språk, til å utføre cluster analyse på et eksempel datamatrise fulgt av klynge evaluering ved hjelp av PCA og GMM tilnærminger. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nevroanatomi studier har vært en pilar i nevrovitenskap og nyere interesse connectomics og struktur-funksjon relasjoner har fornyet entusiasme for detaljert morfologisk karakterisering av selektive nevronale populasjoner. Tradisjonelt har nevroanatomi studier støttet seg på kvalitative klassifiseringer av nerveceller i morfologisk forskjellige klasser av nerveceller som er definert av ekspert neuroanatomists. Med fremskritt innen teknikker for å rekonstruere nevroner og utpakking morfologiske data, er det nå mulig å bruke mer avanserte og kvantitative data analysemetoder for å klassifisere morfologisk forskjellige nevrale klasser på en objektiv måte. I denne studien er trinnvise metoder skissert for 1) selektivt merking hundrevis av individuelle nerveceller ved hjelp av virus-mediert retrograd merking metoder; 2) systematisk gjenreise hundrevis av individuelle nerveceller for å danne et helhetlig og derfor representativt utvalg av nevroner i en selektiv befolkningen; og 3) uavhengig gruppering analyser med statistisk evaluering for å bestemme optimale klynger av nevroner i en selektiv populasjonen basert på morfologiske beregninger. Disse analysemetodene er verifisert ved å bruke forskjellige clustering metoder til et eksisterende datasett fra TRN nevroner og vi demonstrere basert på tre separate evalueringsmetoder som TRN nevroner er optimalt gruppert i tre morfologisk forskjellige undergruppene.

En stor fordel med de protokoller som er beskrevet i denne studien er deres fleksibilitet. G-slettet rabies virus har vært effektiv i å drive EGFP uttrykk i hundrevis av retrograd merket nevroner etter injeksjon inn i en målstruktur. Det samme rabies virusstamme er like effektivt i flere arter, inkludert system apekatter 5, 9, ildere (Hasse & Briggs, i revisjon) og gnagere 7,"> 8. Følgelig modifiserte rabies virus kan anvendes for å selektivt merke den komplette dendrittiske arborization mønstre av enhver populasjon av neuroner etter injeksjon inn i en målstruktur. Antistoffarging mot GFP fulgt av DAB / peroksyd reaksjon anbefales fordi dette fører til varig farging av merkede nevroner og gjør det mulig for vevssnitt for å bli visualisert under et mikroskop uten hjelp av fluorescensmikroskopi (som bleker fluorescerende markør med lengre eksponering). imidlertid alternative farvemetoder er tilgjengelig og / eller fluorescens direkte kan visualiseres om ønsket. en fordel ved å måle rå fluorescens er at ulike virus kjøre uttrykk for ulike fluorescerende molekyler kan kombineres, for eksempel for å fastslå hvorvidt nevroner prosjektet til flere mål strukturer i hjernen. i tillegg kan du fremgangsmåten ovenfor brukes på alle tilgjengelige morfologiske data (for eksempel axoner og dendritter) for å muliggjøre stadig robust Morphologisk klassifisering av nerveceller. Det er også viktig å merke seg at mindre mengder av rabiesvirus kan også injiseres for å generere sparser retrograd merking, som kan være fordelaktig for rekonstruksjoner av aksoner i tillegg til dendritter.

En ytterligere fordel av de analysemetoder som er beskrevet i denne studien er at flere forskjellige clustering metoder kan anvendes, og sammenlignes. På hvert trinn i klyngeanalyse, ulike alternativer er tilgjengelige for å beregne mellom-nevron avstander i parameterrommet samt ulike algoritmer for å generere klynger. I tillegg har flere evalueringsmetoder er tilgjengelige. Sistnevnte er spesielt nyttig som et middel for å kontrollere optimal gruppering, som skissert i de representative resultater delen. Utvilsomt flere algoritmer for å frembringe partikkelbunter og for evaluering av optimal clustering blir tilgjengelig som banen beveger seg fremover. Sammen vil disse analysemetoder fortsette å improve kvantitative tilnærminger innen nevroanatomi og øke robustheten funn.

Det er økende interesse for automatisering av nevronale rekonstruksjoner fordi ved hånd rekonstruksjoner av individuelle merket nevroner er tidkrevende, krever trening og erfaring, og er fortsatt litt subjektiv. Fordi datamaskinbaserte automatiske neuronal rekonstruksjoner som fremdeles utsatt for feil, blir elektronmikroskopi-baserte nevroanatomi data fremdeles analysert ved hjelp av mennesker (se for eksempel 17). Det er imidlertid sannsynlig at automatiserte nevronale rekonstruksjon vil være tilgjengelig i nær fremtid. Automatisert neuronal rekonstruksjon vil kreve enda mer nøye på dataanalyse slutten, og dermed clustering analyserer og evalueringsmetoder skissert her vil bli enda viktigere som feltet fortsetter å avansere teknologisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke legene. Ed Callaway og Marty Usrey for å tillate oss å bruke vev utarbeidet som en del av en tidligere studie og Libby Fairless og Shiyuan Liu for hjelp med nevronale rekonstruksjoner. Dette arbeidet ble finansiert av NIH (NEI: EY018683) og Whitehall Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SADΔG-EGFP E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten FHC UEPSGGSE1N2M Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II Drummod Scientific 3-000-204, 110V Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome Thermo Scientific
DAB Sigma Aldrich D5905-50TAB 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C Sigma Aldrich C2037-100MG
Catalase Sigma-Aldich C9322-5G
Rabbit anti-GFP Life Technologies/Thermo Fisher #A-11122  Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit Vector Laboratories #BA-1000 Secondary antibody
Neurolucida System  MicroBrightField Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer MicroBrightField Data export software
Microfire Camera  Optronics 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope Nikon Instruments Inc. Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab The MathWorks Inc.  Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel Microsoft Spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cajal, S. R. y Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. , Maloine. (1911).
  2. Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
  3. Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
  4. Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
  5. Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
  6. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
  7. Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).
  8. Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
  9. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
  10. Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
  11. Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
  14. Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
  15. Thorndike, R. L. Who belongs in the family? Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
  16. Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
  17. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).

Tags

Neuroscience nevroanatomi retrograd tracer endret rabies virus neuronal rekonstruksjon uavhengige clustering algoritmer klynge evaluering
Storskala Rekonstruksjoner og Independent, Upartiske Clustering Basert på Morfologiske Metrics å klassifisere nevroner i Selektive populasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bragg, E. M., Briggs, F. Large-scale … More

Bragg, E. M., Briggs, F. Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations. J. Vis. Exp. (120), e55133, doi:10.3791/55133 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter