Summary
Denne protokol beskriver store rekonstruktioner af selektive neuronale populationer, mærket efter retrograd infektion med en modificeret rabiesvirus udtrykker fluorescerende markører, og uafhængig, uvildig klynge analyser, muliggøre omfattende karakterisering af morfologiske målinger blandt forskellige neuronale underklasser.
Abstract
Denne protokol skitserer store rekonstruktioner af neuroner kombineret med anvendelsen af uafhængige og upartiske clustering analyser at skabe en omfattende undersøgelse af de morfologiske karakteristika observeret blandt en selektiv neuronal population. Kombination af disse teknikker udgør en ny tilgang til indsamling og analyse af neuroanatomiske data. Tilsammen udgør disse teknikker gør det muligt i stor skala, og derfor mere omfattende, sampling af selektive neuronale populationer og etablere upartiske kvantitative metoder til at beskrive morfologisk unikke neuronale klasser inden for en population.
Protokollen beskriver anvendelsen af modificeret rabiesvirus til selektivt at mærke neuroner. G-slettet rabies virus fungerer som et tilbageskridt sporstof følgende stereotaktisk injektion i et mål hjernens struktur af interesse og tjener som et middel til levering og ekspressionen af EGFP i neuroner. Et stort antal neuroner er smittet ved hjælp af denneteknik og udtrykke GFP gennem hele deres dendritter, der producerer "Golgi-lignende" komplette fills enkelte neuroner. Derfor virus-medierede retrograd sporing metode forbedrer traditionelle farvestofbaserede retrograd tracing teknikker ved at producere komplette intracellulære fills.
Individuelle godt isolerede neuroner spænder alle regioner af hjernen område under undersøgelsen er udvalgt til genopbygning for at opnå et repræsentativt udvalg af neuroner. Protokollen skitserer procedurer til at rekonstruere celle organer og fuldføre dendritiske arborization mønstre af mærkede neuroner spænder flere vævssnit. Morfologiske data, herunder positioner af hver neuron i hjernen struktur, ekstraheres til yderligere analyse. Standard programmering funktioner blev udnyttet til at udføre uafhængig klynge analyser og klynge evalueringer baseret på morfologiske målinger. For at verificere anvendeligheden af disse analyser, statistisk evaluering af en klyngeanalyse PerfoRMED på 160 neuroner rekonstrueret i thalamiske retikulære kerne af thalamus (TRN) af makak abe blev lavet. Både den oprindelige klynge analyse og de statistiske evalueringer her viser, at TRN neuroner er adskilt i tre subpopulationer, hver med unikke morfologiske karakteristika.
Introduction
Neuroanatomi er en af grundpillerne i neurovidenskab 1 og nylige interesse i "connectomics" har fornyet begejstring for at forstå den morfologiske diversitet neuronale populationer og forbindelserne mellem specifikke neuroner 2. Metoder til mærkning og genopbygning neuroner har forbedret med de seneste nyskabelser, herunder genetiske og virus-medieret kredsløb sporing nærmer 3, 4, muliggør mere omfattende morfologiske undersøgelser af neuronale populationer 5. Ud over forbedringer i mærkning individuelle neuroner, har kvantitative data analyseteknikker også frem, at gøre det muligt for uafhængige og upartiske klassifikation af neuroner i adskilte subpopulationer baseret på morfologiske data 5, 6. Disse upartiske teknikker er en forbedring på mere traditional kvalitative klassificering metoder, der har været standard på området i over et århundrede. Målet med denne undersøgelse er at skitsere, trin-for-trin, kombinationen af virus-medieret mærkning af neuroner inden for et selektivt befolkning, store rekonstruktioner af en omfattende stikprøve af disse neuroner, og kvantitativ dataanalyse baseret på uafhængige klyngedannelse med statistisk vurdering. Ved at kombinere disse metoder, vi skitsere en ny tilgang til indsamling og analyse af neuroanatomiske data for at lette omfattende prøvetagning og uvildig klassifikation af morfologisk unikke neuronale typer inden for et selektivt neuronal population.
Som et eksempel på disse metoder beskriver vi vores analyse af en stor population af neuroner inden for en enkelt sektor af thalamiske retikulære kerne (TRN) af makakabe. Disse data er fra en tidligere undersøgelse 7. Metoder til selektivt mærkning TRN neuroner rager til dorsale Lateral geniculate kerne af thalamus (dLGN) ved hjælp af kirurgisk injektion af modificeret rabiesvirus koder EGFP 4, 8 (se tabel for specifikke materialer / udstyr, række 2) er skitseret. Denne modificerede rabiesvirus mangler genet, der koder et væsentligt kappeprotein, eliminere trans-synaptisk bevægelse af virusset. Når virus ind Axon terminaler på injektionsstedet, det virker som en traditionel retrograd tracer med vigtig fordel ved at køre EGFP udtryk gennem hele dendritiske arborization af inficerede neuroner 5, 9, 10. Følgelig kan denne G-deleteret rabiesvirus anvendes til selektivt at inficere og mærke enhver neuronal population efter injektion og retrograd transport.
For at udføre en omfattende analyse af en specifik neuronal population, er det vigtigt at prøve fraen bred fordeling af neuroner i befolkningen. Da virus-medieret teknik mærkning frembringer fuldstændig intracellulære, "Golgi-lignende" fylder af mange neuroner med axoner på virus injektionsstedet, er det muligt at rekonstruere et meget stort udsnit af neuroner inden for det fulde omfang af en hjerne struktur. Desuden, fordi den modificerede rabiesvirus er så effektiv til at inficere og mærkning stort antal neuroner, er det muligt at rekonstruere hundredvis af neuroner per dyr. Procedurer for prøveudtagning 160 neuroner i hele den visuelle del af TRN 11 for at generere en omfattende prøve af dLGN-udragende TRN neuroner er skitseret. Processen med at rekonstruere individuelle neuroner ved anvendelse af en neuron rekonstruktion, der indbefatter et mikroskop, kamera og genopbygning software er beskrevet. Der beskrives også metoder til at bestemme positioner af enkelte neuroner inden en hjerne struktur (i dette tilfælde i TRN) og til at kontrollere virus injektion siddee omfang og placering i en struktur (i dette tilfælde inden for dLGN) ved hjælp af volumetriske kontur rekonstruktioner. Skridt til at eksportere morfologiske data og udføre uafhængig klynge analyser baseret på morfologiske målinger målt for hvert neuron er skitseret. Der er begrænsninger for klyngedannelse metoder, og der er også en række forskellige klyngedannelse algoritmer til rådighed. Følgelig er disse muligheder, og fordelene ved nogle af de mere almindeligt anvendte algoritmer beskrevet. Klyngeanalysen giver ikke statistiske verifikation af det unikke i klynger. Derfor er yderligere trin skitseret at verificere optimal clustering samt relationerne mellem morfologiske data inden for og på tværs af klynger. Statistiske metoder til evaluering klynger for TRN datasættet at bekræfte, at TRN neuroner er grupperet i tre unikke klynger baseret på 10 uafhængige morfologiske målinger er beskrevet.
Således ved at skitsere skridt til selektivt mærkning, Rekonstruktion og analysere morfologiske data fra en specifik neuronal population, beskriver vi fremgangsmåder til kvantificering morfologiske forskelle blandt neuroner i en population. Tidligere fund af forskellige neuronale typer inden den visuelle del af makak abe TRN bekræftes med separate statistiske evalueringsmetoder. Sammen håber vi disse teknikker vil være bredt anvendelig til neuroanatomiske datasæt og hjælpe med at etablere kvantitativ klassificering af mangfoldigheden af neuronale populationer gennem hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Den undersøgt i dette studie væv blev fremstillet som en del af en separat undersøgelse 5. Derfor er alle af de eksperimentelle fremgangsmåder, der involverer anvendelse af dyr er blevet beskrevet i detaljer i afsnittet Eksperimentelle metoder af Briggs et al. (2016). Alle procedurer, der involverer dyr udført som en del af den forudgående undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og Brug udvalg. Trinene til injektion af virus i dLGN og histologisk behandling af hjernevæv er kort beskrevet nedenfor i afsnit 1 - 2.
1. stereotaktisk injektion
- Udføre alle kirurgiske procedurer i et sterilt miljø ved anvendelse af aseptisk teknik. Steam-sterilisere alle metal kirurgiske instrumenter, gaze og drapere materiale i autoklave. Sterilisere alle materialer, der kunne tage skade af damp ved hjælp af kemisk sterilisering (f.eks ethylenoxid).
- Fremkald og vedligeholde anæstesi i henhold til dyre- og protokol-specifikke krav.
- For virus injektion i aber, fremkalde anæstesi med ketamin (10 mg / kg) og vedligeholde dyr under samlede kirurgiske anæstesi med isofluran (1 - 3% inhaleret i ilt) overvågning udløbet CO2, EKG, respiration sats, og temperaturen kontinuerligt og periodisk kontrol til kæben tone for at sikre korrekt bedøvelse dybde.
- Placer dyr i en stereotaktisk ramme til at stabilisere hoved position og tillade brug af stereotaksiske koordinater til at finde den indsprøjtning struktur af interesse (f.eks dLGN). Hvis måling visuelle reaktioner, sted øjendråber (1% atropin øjendråber hvis der ønskes elev dilatation, ellers saltvand øjendråber) og derefter kontaktlinser i begge øjne til at forebygge tørhed. Hvis ikke måle visuelle svar, placere oftalmologiske salve i øjnene.
- Lav en midtlinie hovedbund snit og trække huden og musklerne.
- Ifølge stereotaktisk koordinater for strukturen af interesse (dLGN) i en hemisphere, lave en lille kraniotomi.
- Gradvist sænke en optagelse elektrode (f.eks wolfram eller platin / iridium elektrode (se tabel for specifikke materialer / udstyr, række 3) fastspændt på et mikromanipulator, der er manuelt placeret) gennem kraniotomi ind i hjernen. Lavere impedans (<1 MW) og lidt tykkere (~ 250 um diameter) elektroder kan anvendes til at trænge ind i dura, hvis det ønskes.
- Optag manipulatoren stilling ved kortikale overflade og på det punkt, hvor visuelle respons måles. Visuelle svar er hørbar, tid-låst neuronale reaktioner på lys glimtede i øjnene med et oftalmoskop eller lille LED / lommelygte.
- Bestem placering og tykkelse dLGN ved at bemærke manipulator positioner i starten, midten og slutningen af visuelle svarene og trække den kortikale overflade position fra disse værdier. Optag dybet for hver designet injektionssted inden for dLGN.
BEMÆRK: Lignende Procedures kan anvendes til lokalisering af ikke-visuelle strukturer ved anvendelse af passende sensoriske stimuli. Derudover kan koblet optage / indsprøjtningssystemer også anvendes til at målrette små hjernens strukturer. - Når optimale Injektionsstederne noteres, fjern elektrode og placere en injektion pipette (glaspipette eller injektionssprøjte) på samme stereotaktisk position og lavere til passende dybde til hver injektion, begyndende med den dybeste injektionsstedet og går videre til det lavest, venter mindst 1 min efter injektion, før du ændrer elektrode position. Glaspipetter med ydre diameter på ~ 50 um kan reducere tilbagestrømning af virus i forhold til syringe tip (~ 200 um diameter).
- Brug af et indsprøjtningssystem (se tabel for specifikke materialer / Equipmen t, række 4), picospritzer eller sprøjtepumpe, injicere små mængder (1 - 5 ul, henvises til producentens instruktioner til injektion procedurer) modificeret rabiesvirus over flere (3 - 10) dybderved en hastighed på ~ 100 nL / min inden målstrukturen (dLGN). Bemærk: Separate injektion gennembrydninger kan foretages i større mål strukturer (f.eks abe dLGN). Juster samlede injektionsvolumen ifølge målstrukturen størrelse.
- Pause mindst 5 min før tilbagetrækning injektionspipetten. Når injektionspipetten fjernes, fylde kraniotomi med beskyttende materiale (lim knogle stykke på plads, gælder knogle voks eller Gelfoam), derefter sutur musklen og huden sammen igen.
- Administrer analgetika (f.eks ketoprofen) og antibiotika forud for afslutningen af operationen og overvåge dyr kontinuerligt indtil dyret er ambulant.
- For mindst 3 dage og op til 10 dage efter operationen, overvåge dyr dagligt for at sikre suturer er rene, tørre, og intakt og dyr viser ingen tegn på smerte eller ubehag. Administrere daglige analgetika og antibiotika efter behov. Begynd sociale boliger af post-kirurgisk dyr efter dyr er kommet sig helt fra kirurgi. </ Ol>
- Tillad 7 - 14 dage for retrograd transport af virus, så aflive dyret ved overdosis af eutanasi løsning (f.eks Euthasol) og perfundere dyret transkardialt med 0,1 M phosphatpufret saltvand, 4% paraformaldehyd, derefter 4% paraformaldehyd med 10% sucrose.
- Fjern hjernen (se 12 for analoge trin i en gnaver-model), og i 20 - 30% saccharose med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer og opbevares i køleskab i 1 - 2 dage.
- Når hjernen er sunket til bunden af beholderen, fjerne den og skære vævet i blokke indeholdende hjernen region med retrogradt mærkede neuroner (f.eks visuelle cortex) og injektionen målstrukturen (f.eks dLGN). Skær de samme blokke af væv fra den ikke-injicerede hemisfære - disse vil tjene som kontrol sektioner. For de bedste resultater, begynde histologiske procedurer immediately på frisk sektioneret væv.
- Afsnit væv coronalt i en tykkelse på 50 um i afsnit ved hjælp af en fastfrysning mikrotom (se tabel for specifikke materialer / udstyr, række 5).
- Farv alle sektioner for cytochrom oxidase aktivitet (se tabel for specifikke materialer / udstyr, rækker 5 - 8) at visualisere kortikale lag og subkortikale strukturer 13. Bemærk: Sektioner kan opbevares natten over i et køleskab i sidste skylning efter cytochrom oxidase pletten.
- Mærke alle sektioner med et primært antistof mod GFP (1: 1000 fortynding, ~ 12 h inkubation, se tabel af specifikke materialer / udstyr, række 9) efterfulgt af et sekundært antistof matcher den primære vært og tagget med biotin 5 (1: 500 fortynding , 2 - 4 timers inkubation, se tabel af specifikke materialer / udstyr, række 10). Det anbefales at inkubere sektioner i det sekundære antistof natten over.
- Label sektioner med et avidin / biotin kompleks derefter reagere med DAB og peroxid permanent plette alle mærkede neuroner 5.
- Monter afsnit om subbed objektglas og lad tørre natten over.
- Affedte sektioner ved hjælp af en række af alkohol og xylen skylninger derefter dække slip 14.
- Placer et dias i diasholderen mikroskopet og fokusere på et enkelt afsnit af interesse ved hjælp af en lav-forstørrelse mål (f.eks 2X eller 10X). Kontroller, at kameraet billedet er synligt i softwaren visning ved korrekt positionering af kameraet lukkeren.
- Vælg mærkede neuroner i hjernen struktur af interesse (f.eks TRN), der er rimeligt isoleret således, at utvetydigt rekonstruere så meget af den dendritiske arborization som muligt. Fortrinsvis vælge neuroner hvis cellen kroppen er fuldt inden for en enkelt sektion for at fange den største udstrækning af hver celle krop og præcist estimere dens areal og rundhed. Brug 10X mikroskop mål at identificere celle body i hjemmet sektion.
- Når en godt farvet, godt isoleret neuron er identificeret, tilføje afsnittet "hjem" indeholder cellen krop til sektionsleder ved at klikke på "Ny Section" knappen. Indtast antallet af sektioner for at inkludere (anbefale 2 - 3 sektioner for at begynde). Tildel et afsnit tykkelse på 50 um når du bliver bedt (se trin 2.3).
- Spore konturerne af relevante hjernens strukturer i hjemmet sektion, der indeholder cellelegemet. Brug 2X målsætning / forstørrelse til kontur sporing.
- Vælg først "Contour" fra drop-down menuen på den øverste værktøjslinje, og vælg derefter konturen typen fra drop-down menuen (fx "LGN" eller "TRN").
- Trace konturerne af målstrukturen (f.eks TRN) samt tilstødende strukturer, hvis det ønskes, ved at klikke på punkter langs konturen med mus som uafgjort værktøj.
- Vælg "Luk Contour" ved at højreklikke med musen og vælge denne indstillingfra menuen for at afslutte og vedlægge hver spores kontur.
- Placer en markør i midten af målstrukturen ved at klikke på den ønskede markør symbol på højre værktøjslinje og derefter klikke på det ønskede sted i genopbygningen at placere markøren på det pågældende sted. Brug samme type markør for at markere midten af målstrukturen i alle rekonstruktioner.
- Når konturerne er færdige, tegn omridset af cellelegemet anvendelse af 40 - 60X mål / forstørrelse. For at gøre dette, skal du først vælge "Neuron" fra drop-down menuen på den øverste værktøjslinje, og vælg derefter neuron struktur at spore, i dette tilfælde "Cell Body". Næste spore celle kroppen som i 3.4.
- Placer en anden stil markør i midten af cellen kroppen, efter trinene i 3,5.
- Spore alle dendritter udgår fra cellelegemet.
- Vælg først "Dendrite" fra drop-down menuen. Derefter spore hver dendritceller starter ved celle body og med mus som uafgjort værktøj. Sørg for at justere z-dybden i hele sporing til præcist at fange vinklen og retningen af dendritceller.
- Placer en knude på hver gren punkt langs dendritceller ved at højreklikke med musen og vælge "bifurcating Node" eller "Trifurcating Node" fra drop-down menuen. Brug 40 - 60X objektiv / forstørrelse for alle dendritceller rekonstruktioner.
- Ved afslutningen af hver dendritceller, højreklikke på musen og vælg "Ending" fra drop-down menuen.
- Identificer dendritiske slutninger, som sandsynligvis vil fortsætte ind i den tilstødende sektion og bringe disse i fokus på passende z-dybde i mikroskopet billedet. Medtag store seværdigheder i nærheden såsom blodkar eller let genkendelige dendritceller mønstre eller bundter i mikroskop billedet.
- Reducer forstørrelse til 20X eller 10X på mikroskopet (vælg forstørrelsen, der giver størst vartegn visualisering), og tageet billede af mikroskopet billedet ved hjælp af et digitalt kamera (f.eks mobiltelefon, tablet) håndholdt til computerskærmen.
- Flyt til den tilstødende sektion på objektglasset og line up konturerne af tidligere sporede sektion med grænserne for dLGN og TRN i den nye sektion.
- Retur synsfeltet til det generelle område af cellelegemet (baseret på konturer og store seværdigheder) og bringe forstørrelsen tilbage op til 10 - 20X.
- Brug foto af dendritceller slutninger fra den tidligere spores afsnit for at hjælpe med at justere slutninger med begyndelsen af dendritter i den nye sektion.
- Hvis du vil rotere opsporing og flytte det til at tilpasse dendritter, bruge pilen til at markere genopbygning, højreklikke og vælge "Move" fra drop-down menuen.
- Alternativt kan du bruge "Match" værktøj til at matche dendritiske slutninger til begyndelser. Vælg Match værktøj fra den øverste værktøjslinje og når du bliver bedt, skal du klikke på slutningeni genopbygningen og den tilsvarende fortsættelse punkt i billedet. Gentag for 3 eller flere endelser.
- Når sporing fra det foregående afsnit er linet op med dendritter i den nye sektion, skal du sørge for tilsvarende nye sektion er valgt i sektionen Manager ved at klikke på den aktuelle sektion. Eller tilføje en ny sektion til sektion manager, som beskrevet ovenfor i 3.3, justering af z-dybde og placering af hver ny sektion i forhold til hjemmet afsnittet herom og sætte hver sektion tykkelse til 50 mm (se trin 2.3).
- Øge forstørrelsen til 40 - 60X og spore dendritceller fortsættelser ved at højreklikke med musen på enden af dendritceller fra genopbygning og vælge "Føj til Ending" fra drop-down menuen, og derefter spore dendritceller ved hjælp af musen som en tegne værktøj. Følg hurtig til at angive, om fortsættelse er i den nye sektion.
- Følg dendritter gennem mindst 3 tilstødende sektioner (en på hver side afhjemmet sektion) efter trin 3,8-3,15. Tilføj til genopbygningen indtil mindst 3 af total sektioner er spores til neuron, eller indtil de dendritter kan ikke længere følges eller fundet. Trace konturer i tilstødende sektioner efter ovenstående trin, hvis det ønskes.
- Uddrag morfologiske data fra hver enkelt neuronal rekonstruktion bruger en ext-fraktion program i forbindelse med den neuron genopbygning systemet (se tabel for specifikke materialer / udstyr, rækker 11 - 12).
- Først skal du vælge de morfologiske data ønskes for hver rekonstruktion herunder: kontur information, markør oplysninger, morfologiske data for celle krop og dendritiske arborization osv.
- Fra Edit rullemenuen i den øverste værktøjslinje, skal du vælge "Vælg alle objekter". Vælg derefter "forgrenet struktur Analysis" fra drop-down menuen Analyse i den øverste værktøjslinje, og klik på hver fane, og vælg de ønskede analysemuligheder i hver fane.
- Uddrag alle ønskede data ved at klikke på "OK" knappen i Analyse vinduet og gemme i et regneark ved at højreklikke på output vinduer og vælge "Eksporter til Excel".
- Udarbejde en Master regneark (se tabel for specifikke materialer / udstyr, række 16), hvor hver morfologisk variabel / migTric er repræsenteret ved et enkelt numerisk observation per neuron. I denne Master regneark, registrerer rækken identifikator for hver neuron.
- Kontroller, at alle variabler i klyngeanalyse (f.eks morfologiske målinger) er uafhængige af hinanden. For eksempel vil antallet af knudepunkter korrelerer med antallet af grene i en dendritisk eller axonal arborization. Derfor bør kun én af disse to variable inkluderes i en klyngeanalyse.
- Kontroller, at hver måling indeholder en observation for hver variabel, dvs. hver neuron (måling), skal have et data-punkt (observation), der svarer til hver morfologiske metriske (variabel). Hvis observationer for en særlig variabel (fx axon længde) er utilstrækkeligt til en delmængde af neuroner, kan denne variabel (Axon længde) ikke medtages i klyngen analyse.
- Organiser dataene på Master regneark i en enkelt matrix, hvor hver række repræsenterer et neuron og each kolonne indeholder numeriske data for hver morfologiske metric (figur 1). For eksempel, et datasæt inklusive 100 neuroner, for hvilke der er observationer for 5 uafhængige variable ville være repræsenteret ved en 100 x 5 (række-for-kolonne) matrix. Det er ikke nødvendigt at medtage nogen identifikation for hver neuron i matricen - rækken indekset vil tjene som hver neuron unikke identifikator. Der bør også være nogen huller eller "NaN" 'ere i matrixen. Gem matrix som en enkelt variabel (f.eks data = [100 x 5 matrix], se supplerende kode fil for prøve kode).
- Vælg en algoritme til at beregne afstande mellem punkter, der repræsenterer individuelle neuroner i et n-dimensionalt rum, hvor n er defineret ved antallet af variabler. Den "pdist" funktion muliggør fleksibilitet ved beregningen mellem-neuron afstande. Beregningen Standard afstand er euklidisk afstand og er tidligere blevet anvendt til lignende analyser af neuronal morphological data 5, 6.
- Med den mellem-neuron afstande output af "pdist 'funktion, bruge' sammenkædning 'funktionen til at danne klynger. Igen, flere klyngedannelse muligheder. Wards metode og tyngdepunkt afstand har givet lignende resultater i analyser af morfologiske datasæt 5, 6.
- Hvis det ønskes, bruge 'kmeans funktion som et alternativ clustering tilgang til' pdist "og" sammenkædning "funktioner. 'kmeans' beskæftiger kvadreret euklidiske afstand til at beregne mellem-neuron afstande og tyngdepunkt afstand for at tildele klynger.
- For at visualisere en hierarkisk klynge træ, bruge 'dendrogram "funktionen på produktionen af" sammenkædning "operation. Denne funktion har en standardindstilling, der begrænser visualisering til 30 målinger, men det kan tilsidesættes ved at angive antallet af målinger (<em> f.eks neuroner) vises. Dendrogrammet illustrerer liftkontakterne afstande på y-aksen for hver af de neuroner, der er konstateret ved deres rækkeindekset på x-aksen.
BEMÆRK: Udgangene af "sammenkædning" og "dendrogram 'definerer ikke det optimale antal klynger. Udgangen af 'kmeans' sætter tal målinger til klynger, men det gør ikke teste, om disse klynger er optimale. Separate statistiske sammenligninger og verifikation af optimal klyngedannelse kan udføres (se nedenfor). - Metode 1: Evaluering klyngedannelse:
- Brug 'evalclusters' funktion med angivelse af den anvendte metode til beregning af klynger, såsom 'kmeans "eller" sammenkædning ". En Gaussisk blanding model output kan også blive evalueret (se trin 5.2 nedenfor, se supplerende kode fil for prøve kode).
- Angiv kriteriet evaluering fra en række muligheder (fx 'CalinskiHarabasz «- for beskrivelser af kriterium muligheder, Se menuen Hjælp, der søger efter" evalclusters ").
- Angiv et område af optimale klynge numre til at teste (f.eks [1: 6] for at teste, om 1, 2, 3, 4, 5, eller 6 klynger er optimale).
Bemærk: Udgangen af 'evalclusters' er et optimalt antal klynger givet clustering algoritme og kriteriet.
- Metode 2: Gaussian blanding model klyngedannelse:
BEMÆRK: Gaussian blanding model clustering algorithms (GMM'er) antager, at observationer for hver variabel kommer fra en blanding af gaussiske fordelinger definerer hver formodet klynge, hver med deres egen middelværdi og kovarians. GMM bruger derefter en forventning maksimering algoritme til at tildele posteriore sandsynligheder for hver måling, der angiver sandsynligheden for at tilhøre en bestemt klynge 16.- Gennemføre en GMM at bruge 'fitgmdist "funktion ved at indtaste den formodede antal klynger observerbare i dataene. Alternativt at undgå a priori tildeling af antallet af klynger, bruge principal komponenter analyse (PCA) med en række forskellige optimale klynge numre ved hjælp trinene her (se supplerende kode fil for prøve kode).
- Brug "PCA" funktionen på de oprindelige data matrix og gemme de vigtigste komponent scores som en udgang.
- I en løkke starter ved en og går gennem nogle antal formodede optimale klynger, bruge the 'fitgmdist "funktionen på de vigtigste komponent scores og generere GMM'er for hvert nummer af formodede optimale klynger.
- Evaluer hver GMM ved at undersøge den negative log sandsynlighed Akaike information kriterium, og Bayes information kriterium. GMM'en med de laveste kriterier er optimal.
- Om ønsket teste, om middelværdierne for hver klynge er signifikant forskellige, når antallet af klynger er optimal (hjælp af hver klynge er lagret i "mu" output af hver GMM).
- Når det optimale antal klynger bestemmes ved hierarkisk klyngedannelse og evalueres, vende tilbage til den oprindelige data, separate neuroner i klynger, og afgøre, hvilke morfologiske målinger bidrager til gruppering af neuroner til unikke klasser.
- Sortere oprindelige morfologiske metriske data, såsom at neuroner er grupperet efter klynge opgave. For at undersøge relationer mellem morfologiske data på tværs af neuroner (for alle neuroner eller for neuroner opdelt i klynger), udføre lineær regression passer til 2- og 3-vejs sammenligninger af morfologiske metriske observationer. Disse passer kan estimeres ved hjælp af »fit« funktion og evalueret ved hjælp af 'fitlm "funktion, hvor godhed fit udgange omfatter R 2 og p-værdier for regression passer.
- For at undersøge de statistiske relationer mellem neuroner i hver klynge, anvende ikke-parametrisk to stikprøver (Wilcoxon rank-sum test) eller multipel-samplesammenligninger tests (ANOVA), afhængig af antallet af klynger. Vigtigt er det, at anvende multiple-prøve ANOVA'er sikrer, at p-værdier korrigeres for multiple sammenligninger.
2. Tissue Høst, Sektionsinddeling, og Farvning
3. Neuronal Genopbygning
BEMÆRK: Alle rekonstruktioner for originale forsøg blev foretaget ved hjælp af en neuron rekonstruktion system bestående af et mikroskop (se tabel for specifikke materialer / udstyr, række 14), der er knyttet kamera (se tabel for specifikke materialer / udstyr, række 13), og genopbygning software pakke (se tabel for specifikke materialer / udstyr, rækker 11 - 12). Software-assisteret neuronal rekonstruktion muliggør visualisering af væv slides belagt med edb-baserede tegninger af neuronale processer. Vigtigere er det, software digitaliserer morfologiske genopbygningention data i tre dimensioner, der gør det muligt udvinding af position-specifikke morfologiske oplysninger. Det tilknyttede dataudtræk program (se tabel for specifikke materialer / udstyr, række 12) gør det muligt ekstraktion af et rigt sæt af morfologiske data fra hver gemte genopbygning.
4. Uafhængig Clustering
Bemærk: Uafhængig klynge analyser muliggøre upartiske analyser af store, flerdimensionelle datasæt, der ellers ville være vanskelige at visualisere og, vigtigst, give en kvantitativ vurdering af morfologisk mangfoldighed. En matrix-baseret programmering platform er ganske nyttigt til analyse af multi-dimensionale datasæt og muliggør sofistikerede datamanipulationer og statistiske analyser. De funktioner, der er anført i trin 4 - 6 er defineret i programmeringen platform anført i tabellen i specifikke materialer / udstyr, række 15.
5. Verifikation af Clustering
Bemærk: Som nævnt ovenfor, er klyngen analyse selv ikke direkte give et statistisk vurdering af, om de klynger illustreret i klyngen dendrogram er unikke og repræsentativ for prøven. Metoder til kontrol klynger fra dendrogram er blevet foreslået 15, men disse giver ikke statistiske verifikation af optimal klyngedannelse. Der er multiple metoder til kontrol optimal klyngedannelse.
6. Statistiske Analyser af Clustered data
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere vist, at store rekonstruktioner af neuroner inden for et selektivt befolkning er muligt efter injektion af modificeret rabiesvirus i dLGN 5. For nylig blev det samme væv udnyttes til at rekonstruere 160 neuroner i den visuelle del af TRN (Bragg et al, i revision;. Figur 2A-B) efter de detaljerede metodologiske ovenfor beskrevne trin. I TRN undersøgelsen blev tre unikke klynger af TRN neuroner identificeret på baggrund af uafhængig klyngeanalyse af 10 morfologiske data: cellelegemet område, cellelegemet rundhed, medial-lateral position i forhold til midten af TRN, dorsal-ventral stilling i TRN , antal dendritiske træer, gennemsnitlig dendritiske afstand til knudepunkter, gennemsnitslængde på 3. og højere ordens dendritter, gennemsnitlig vinkel på 1 m ordens dendritter, gennemsnitlig fasevinkel af den samlede dendritiske arborization, og vinkelafvigelse af attal dendritiske arborization. TRN neuroner blev tilsvarende fordelt på disse tre klynger (Figur 2C). Separate statistiske sammenligninger af alle 10 morfologiske målinger på tværs af neuroner i de tre klynger gav statistisk signifikante forskelle på tværs af klynger for alle, men to af de morfologiske målinger indgår i den oprindelige klynge analyse. Således baseret på hierarkisk træ dendrogram genereret fra bundtet analyse (Figur 2C) og de separate statistiske sammenligninger af morfologiske målinger på tværs klynger er TRN neuroner klassificeret i tre unikke grupper.
I denne undersøgelse, vi specifikt ønskede at anvende statistiske metoder til separat evaluere klynger bestemt med en klyngeanalyse. Den TRN datasæt fra den tidligere undersøgelse blev evalueret for at afgøre, om de tre klynger observerede var optimal. Separat ekstra klynge analyser, nemlig PCA og GMM Cluslersted, blev udført for at verificere de kendte clustering metoder (figur 1). Tre vigtige resultater separat kontrollere klyngeanalyse før. For det første, da den oprindelige klynge analysemetode blev evalueret under anvendelse af de »evalclusters 'funktion at angive det» binding «funktion til at generere klynger, det optimale antal klynger var 3, matching den oprindelige konklusion baseret på det hierarkisk træ dendrogram (figur 2C). For det andet PCA blev udført på de oprindelige data matrix af 10 morfologiske målinger for 160 TRN neuroner som et alternativt middel til at gruppere neuroner baseret på bidrag fra morfologiske målinger. Tre genetisk modificerede mikroorganismer blev genereret under antagelse TRN neuroner blev grupperet i 1, 2 eller 3 unikke klynger. Den negative log sandsynlighed (NLL) og Akaike information kriterium (AIC) gav det laveste, og derfor mest informative, værdier og begge værdier var optimale, når GMM brugte 3 klynger til at beskrive TRN morfologiske data (Figure 3). For det tredje blev GMM-baserede klynger separat evalueret ved brug af "evalclusters 'funktion og det optimale antal klynger var 3. Således observationer af hierarkisk træ dendrogram, statistiske sammenligninger af morfologiske målinger på tværs af neuroner adskilt i de tre klynger, PSA og GMM- baseret klyngedannelse, og separate evalueringer af hver gruppering metode (kobling og GMM), alle gav samme resultat, TRN neuroner optimalt adskilt i 3 klynger baseret på de 10 morfologiske målinger udnyttet.
Figur 1: Data Format. Eksempel data matrix med n rækker svarende til antallet af neuroner og m = 5 kolonner, der svarer til det samlede antal uafhængige variable til at omfatte i klyngen analyse (inkluderer ikke overskrifter i data matrix).
Figur 2: Uafhængig Gruppering af 160 TRN neuroner. A. Venstre, fotografi af enkelt koronale snit gennem dLGN af ét dyr, farvet for cytochrom oxidase aktivitet at visualisere dLGN lag og imod GFP at visualisere virus injektion. Pilen angiver regioner i tætte retrogradt mærkede TRN neuroner. Afsnit orientering følger dorsale-ventrale / medial-lateral (DV / ML) kompas nedenfor og skala søjle repræsenterer 500 um for alle paneler i A. Andet fra venstre, kontur skitserer af dLGN (rød) og TRN (maroon) for alle dele, der indeholder virus injektion (sorte konturer). Gule stjerner indikerer injektionsstedet centre. Retning og Skalering barer som i A. Tredje fra venstre, 3-d gengivelser af konturer og injektionsstedet, orientering og skala barer som i A. Right, kort over steder af rekonstrueret TRN neuroner, farvekodet i henhold til klynge opgave (C) inden for en enkelt samlet TRN kontur (maroon). Retning og Skalering barer som i A. B. Venstre, samlede konturer TRN (sort) og dLGN (grå) med 5 rekonstruerede TRN neuroner farvede varm til at køle efter deres mediale-lateral position i TRN. Orientering i henhold til DV / ML kompas i A, skala søjle repræsenterer 500 um. Right, fotografier af de samme 5 TRN neuroner med farve-matchede stænger skala repræsenterer 100 um. C. Hierarkisk træ dendrogram efter klyngeanalyse illustrerer sammenkædning afstande mellem 160 rekonstruerede TRN neuroner baseret på 10 uafhængige morfologiske målinger. Tre klynger illustreret i blå, grøn og rød. Alle dele af dette tal er tilpasset fra tal, der indgår i Bragg et al. (Bedømmelsesudvalg).lank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Cluster Evaluering. Plot af to forskellige kriterium værdier, negativ log sandsynlighed (NLL, rød) og Akaike information kriterium (AIC, blå) dannet fra tre genetisk modificerede mikroorganismer under antagelse 1, 2, eller 3 klynger. GMM'er med 3 klynger sikre de lavest mulige kriterium værdier.
Supplerende Kode Fil: Eksempel kode, skrevet i et Matlab-kompatibelt sprog, til at udføre klynge analyse på et eksempel data matrix efterfulgt af klynge evaluering hjælp PCA og GMM tilgange. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neuroanatomiske undersøgelser har været en af grundpillerne i neurovidenskab og nylige interesse i connectomics og mellem struktur og funktion har fornyet begejstring for detaljeret morfologisk karakterisering af selektive neuronale populationer. Traditionelt har neuroanatomiske undersøgelser påberåbt kvalitative klassifikationer af neuroner i morfologisk forskellige klasser af neuroner, der er defineret af ekspert neuroanatomists. Med fremskridt i teknikker til rekonstruktion neuroner og udvinding morfologiske data, er det nu muligt at udnytte mere sofistikerede og kvantitative data analysemetoder til at klassificere morfologisk forskellige neuronale klasser på en saglig måde. I denne undersøgelse er trin-for-trin metoder skitseret for en) selektiv mærkning hundredvis af individuelle neuroner ved hjælp af virus-medieret retrograd mærkningsmetoder; 2) systematisk rekonstruere hundredvis af individuelle neuroner til at danne en omfattende og derfor repræsentativt udsnit af neuroner inden for en selektiv befolkning; og 3) uafhængige klyngedannelse analyser med statistisk vurdering at bestemme optimale klynger af neuroner inden for et selektivt population baseret på morfologiske målinger. Disse analysemetoder kontrolleres ved at anvende forskellige klyngedannelse metoder til en eksisterende datasæt af TRN neuroner og vi demonstrere baseret på tre separate evalueringsmetoder, som TRN neuroner er optimalt grupperet i tre morfologisk forskellige subpopulationer.
En væsentlig fordel ved de protokoller, der er beskrevet i denne undersøgelse er deres fleksibilitet. G-slettede rabiesvirus har været effektiv i kørsel EGFP udtryk i hundredvis af retrograd mærkede neuroner efter injektion i en target struktur. Den samme rabiesvirus stamme er lige effektive i flere arter, herunder makakaber 5, 9, fritter (Hasse & Briggs, i revision), og gnavere 7,"> 8. Følgelig modificeret rabiesvirus kan anvendes til selektivt at mærke de komplette dendritiske arborization mønstre af enhver population af neuroner efter injektion i en målstrukturen. Anbefales antistoffarvning mod GFP efterfulgt af DAB / peroxid reaktion, fordi dette forårsager permanent farvning af mærkede neuroner og muliggør vævssnit, der skal visualiseres under et mikroskop uden hjælp af fluorescensmikroskopi (som bleger fluorescerende mærke med længere eksponering). imidlertid er alternative farvningsmetoder er tilgængelige og / eller fluorescens kan visualiseres direkte, hvis det ønskes. en fordel ved at måle rå fluorescens er, at forskellige vira, kørsel udtryk for forskellige fluorescerende molekyler kan kombineres, for eksempel for at afgøre, om neuroner projicerer til flere mål hjernens strukturer. Derudover kan de trin, der er skitseret ovenfor anvendes på alle tilgængelige morfologiske data (f.eks axoner og dendritter) at muliggøre stadig mere robust morphologisk klassificering af neuroner. Det er også vigtigt at bemærke, at mindre mængder af rabiesvirus også kan injiceres for at generere sparser retrograd mærkning, som kan være fordelagtigt for rekonstruktioner af axoner foruden dendritter.
En yderligere fordel ved de analysemetoder, der er skitseret i denne undersøgelse er, at flere forskellige klyngedannelse tilgange kan anvendes og sammenlignes. På hvert trin i klyngen analyse, forskellige muligheder for at beregne mellem-neuron afstande i parameter rummet samt forskellige algoritmer til at generere klynger. Derudover flere evalueringsmetoder er tilgængelige. Sidstnævnte er særligt nyttigt som et middel til at verificere optimal klyngedannelse, som skitseret i repræsentative resultater sektion. Utvivlsomt, yderligere algoritmer til generering af klynger og til vurdering af optimal klyngedannelse vil blive tilgængelige som feltet bevæger sig fremad. Tilsammen vil disse analysemetoder fortsat Improve kvantitative metoder inden for neuroanatomi og øge robustheden af resultaterne.
Der er stigende interesse for automatisering af neuronale rekonstruktioner fordi ved hånd rekonstruktioner af individuelle mærkede neuroner er tidskrævende, kræver uddannelse og erfaring, og stadig er noget subjektivt. Fordi computerbaserede automatiske neuronale rekonstruktioner er stadig fejlbehæftet, er elektronmikroskopi-baserede neuroanatomiske data stadig analyseret ved mennesker (se eksempel 17). Det er dog sandsynligt, at automatiseret neuronal rekonstruktion vil være tilgængelig i den nærmeste fremtid. Automatiseret neuronal genopbygning vil kræve endnu mere kontrol på dataanalyse ende, således klyngedannelse analyser og evalueringsmetoder skitseret her, vil blive endnu vigtigere, da feltet fortsætter med at rykke teknologisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Drs. Ed Callaway og Marty Usrey for at tillade os at bruge væv udarbejdet som et led i en forudgående undersøgelse og Libby Fairless og Shiyuan Liu om hjælp med neuronale rekonstruktioner. Dette arbejde blev finansieret af NIH (NEI: EY018683) og Whitehall Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
- Cajal, S. R. y Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. , Maloine. (1911).
- Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
- Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
- Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
- Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
- Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
- Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).
- Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
- Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
- Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
- Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
- Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
- Thorndike, R. L. Who belongs in the family? Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
- Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
