Summary
Este protocolo descreve a produção de um anticorpo terapêutico num sistema de expressão de mamífero. Os métodos descritos incluem a preparação de ADN do vector, transfecção estável e adaptação isento de soro de uma linha celular de rim embrionário humano 293, configurado de culturas em larga escala e a purificação utilizando cromatografia de afinidade.
Introduction
O sucesso de anticorpos terapêuticos continua a impulsionar o investimento substancial no desenvolvimento de anticorpos como uma onda de terapêuticas próxima geração começa. O mercado de anticorpo deverá ser remodelada por fragmentos de anticorpos 1, conjugados de anticorpos droga-2, anticorpos biespecíficos 3 e anticorpos modificados com propriedades favoráveis 4. Outra classe ganhando interesse farmacêutico são biossimilares. anticorpos biossimilares são "altamente semelhantes" replicar produtos de um anticorpo terapêutico que já recebeu aprovação regulatória. A biossimilar proposto deve ser comparável com o anticorpo originador no que diz respeito à sua estrutura, função, toxicidade animal, a segurança clínica e eficácia, farmacocinética humana (PK), farmacodinâmica (PD) e imunogenicidade 5, 6.
A aprovação rates de anticorpos biossimilares têm sido lentos devido às limitações estritas sobre a qualidade final do produto. Os processos de fabrico exactas, tais como linhas de células e condições de cultura específica através dos passos de processamento finais podem permanecer proprietária. O que é mais, a produção de anticorpos envolve inerentemente um grau de variabilidade que pode adicionar ao desafio de produzir um produto altamente semelhantes. A caracterização e comparação físico-química e biofísica abrangente é bastante difícil, mas uma série de estudos que demonstram as características dos anticorpos biossimilares estão surgindo na literatura 7, 8, 9.
Geração de um anticorpo terapêutico começa com a transfecção de células hospedeiras de mamífero com um vector portador de genes para o respectivo anticorpo. projeto do vetor, as condições da linha celular e cultura são aspectos fundamentais para configurar o exsistema de pressão.
As sequências de DNA de anticorpos podem ser provenientes de Drogas Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ou publicações de pesquisa, incluindo patentes. Por exemplo, a sequência de trastuzumab está disponível através da droga Bank (DB ID: DB00072). A sequência de aminoácidos das regiões variáveis podem ser submetidos a concepção do gene e a optimização para a síntese nas espécies hospedeiras desejadas. É importante para um anticorpo biológico similar que nenhuma modificação é feita com a sequência de aminoácidos. Uma vez sintetizados, os genes de anticorpo pode ser subclonado no vector apropriado de escolha.
anticorpos IgG humana consistem de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Expressão fortemente regulada de ambas as cadeias é essencial para a produção óptima de proteína IgG heterólogo em células de mamífero 10. Intra-, bem como ligações dissulfureto inter-cadeias tem que ser formado e uma série de modificações pós-tradução tem que estar emtroduced durante a biossíntese da proteína. Uma série de vectores estão disponíveis, que foram especificamente concebidos para expressar genes de anticorpos (consultar a Tabela de Materiais). Estes vectores específicos de anticorpos normalmente expressam as regiões constantes para ambas as cadeias pesada e leve de modo que apenas as regiões variáveis de cada cadeia requerem clonagem.
A transfecção de células com duas construções independentes (co-transfecção), é a abordagem mais comum para a libertação de genes pesada e leve que codifica cadeia. Isto é, cada gene é conduzido pelo seu próprio promotor e transcrito como cadeias de anticorpo separadas antes de serem montadas no retículo endoplasmático. Por outro lado, os vectores multi-cistrónico têm elementos internos local de entrada de ribossoma (IRES) incorporados que permitem a expressão de múltiplos genes como um único transcrito de ARNm com tradução permitida a partir de regiões internas do ARNm 11. Neste exemplo, as pesadas e leves genes codificadores da cadeia são acoplados numa Arrangement para conseguir a co-expressão de ambas as cadeias de anticorpos 10, 12.
Enquanto as células transfectadas transientemente produzir proteína suficiente para executar um número limitado de experiências, as linhas celulares transfectadas de forma estável que tenham sido submetidos a selecção para a integração do genoma pode proporcionar rendimentos mais elevados. Quantidades de proteína mais elevado para permitir que o desenvolvimento do ensaio, relativa a caracterização in vitro e pode proporcionar uma indicação da qualidade de anticorpos em consideração para aplicações a jusante, tais como a linha celular clonal e selecção de candidatos de chumbo.
O objetivo deste artigo é descrever a expressão estável e a purificação de um anticorpo terapêutico produzido num sistema de expressão de mamífero. Com efeito, este método pode ser aplicado para a expressão de um anticorpo biológico similar. O método pode ser utilizado para a caracterização inicial de anticorpos, antes de prosseguir para o crítico, embora ste demoradops de identificar um clone desejável para o fabrico de maior escala. Além disso, este método pode ser utilizado para expressar proteínas e outros não apenas anticorpos.
O protocolo detalhado seguinte descreve a expressão do anticorpo trastuzumab terapêutica. Esta consiste na preparação de DNA do vector seguido por transfecção estável na linha celular HEK-293 e a purificação da proteína do anticorpo por um método de cromatografia automatizado.
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Protocol
NOTA: Um vector de expressão de mamífero adequado deve ser utilizado para este protocolo. Aqui, uma única construção que contém duas cassetes de expressão é utilizado (isto é, expressão da cadeia pesada e leve é conduzida por promotores separados). Trastuzumab cadeias pesadas e leves foram previamente clonado no vector. Este vector foi um presente de Andrew Beavil, obtido através de um lucro não-para-repositório plasmídeo 13.
1. Recuperação e scale-up de DNA Vector
NOTA: O ADN do vector foi recebido como uma cultura Stab agar mole em Escherichia coli XL-1 Blue estirpe; vector transporta resistência à higromicina.
- Insira uma facada inoculação estéril ou alça no agar macio da cultura facada em seguida, raia uma placa de agar Luria Bertani (LB) preparado com 75 ug / ml de higromicina para colónias isoladas. Incubar a placa a 37 ° C durante 18-24 h.
- Inocular uma colónia isolada em 5 ml de caldo Terrific (TB) contendo 75 ug / ml de higromicina. incuBATE a cultura a 37 ° C durante 18-24 horas com agitação 225 rpm.
- Utilizar a cultura durante a noite para preparar um stock de glicerol de ADN do vector misturando suavemente a 800 ul de cultura com 200 ul de 80% de glicerol num criotubo e congelamento a -80 ° C.
- Adicionar 100 ul da cultura durante a noite a 100 ml de TB contendo 75 ug / ml de higromicina num balão agitador confundido (isto é, diluição 1 / 1.000). Incubar a cultura a 37 ° C durante 18-24 horas com agitação 225 rpm.
- Após cultura durante a noite, extrai-se e purifica-se o ADN de acordo com as instruções do fabricante do kit de preparação MIDI / Maxi com a seguinte excepção; durante o passo de, ou eluem ressuspender o ADN final com água (pH 7,0-8,5).
- Verifique a pureza e concentração de DNA por leituras de absorvância a 260 e 280 nm, em seguida, armazena o ADN à temperatura de -20 ° C.
NOTA: Opcional (altamente recomendado): DNA Sequence utilizando primers específicos de vetor para confirmar a identidade.
2. Transfecção estável de células HEK 293-
- Crescer e manter as células HEK-293 (células de suspensão) de acordo com protocolos padrão em meio isento de soro suplementado com 0,1% de agente tensioactivo não iónico em balões de Erlenmeyer. Mantem-se a 2 x 10 5 culas / ml e subcultura cada quarto dia. Células de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2 e 120 rotação rpm.
NOTA: As células devem ter sido em cultura por não menos de 4 dias e não mais de 4 semanas antes da transfecção. As células HEK-293 crescidas como monocamadas em meio contendo soro, também pode ser usado para este procedimento. - No dia antes da transfecção, as células HEK-293 de sementes a 3 x 10 5 culas / ml em poços de uma placa de 12 poços em 2 ml de Dulbecco Modified Eagle Meios (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10% ( FBS). No dia da transfecção, verificar que as células atingiram 80-90% de confluência
- Diluir DNA e polietilenimina (PEI) separadamente em meios de transfecção, em seguida, misture bem.
- Dilui-se 1,25 ^ g de DNA vector por poço (15 ug por 12 poços) em 300 ul de meio de transfecção. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Dilui-se 2,5 ul de solução de 1 mg / ml de PEI (30 uL para poços 12; ou seja, 1: 2 proporção de ADN para pei) em 300 ul de meio de transfecção. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Adicionar ADN diluído para PEI diluído, misturar suavemente e incuba-se à temperatura ambiente durante 15 min.
- Adicionar 50 ul de ADN / PEI mistura gota a gota a cada poço da placa. Balance a placa suavemente para distribuir a mistura de transfecção, em seguida, colocar a placa a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas.
- Adicionar 50 ug / ml de higromicina B por poço e retornar placa a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 dias.
NOTA: Ao dia 10, as células transfectadas un-terão morrido e isolada a partir da superfície da placa, enquanto que as células estavelmente transfectadas serão viáveis e ligado à placa. - Substitua o material em poços com1/4 volume de meio isento de soro e 3/4 volume de DMEM suplementado com FBS a 10% (isto é, 0,5 ml de meio isento de soro + 1,5 ml de DMEM = 7,5% de concentração sérica final) e incubar durante 4 dias.
- Substituir os meios de comunicação em poços com 1/2 meios isentos de soro de volume e 1/2 volume de DMEM suplementado com FBS a 10% (isto é, meios isentos de soro 1 ml + 1 ml de DMEM = concentração de soro final de 5%) e incubar durante 4 dias.
- Substituir os meios de comunicação em poços com 3/4 meios isentos de soro de volume e 1/4 volume de DMEM suplementado com FBS (isto é, 1,5 ml de meio isento de soro + 0,5 ml de DMEM = concentração sérica final de 2,5%) a 10% e incubar durante 4 dias.
- Substituir os meios de comunicação em poços com 2 ml de meio isento de soro suplementado com 0,1% de agente tensioactivo não iónico (isto é, a concentração sérica final 0%) e incubar durante 4 dias.
NOTA: Manter a 50 ug / pressão selectiva higromicina B ml de células durante a adaptação sem soro. As células adaptadas a meio sem soro separar da superfície de poços e podem agrupar-iN suspensão. Consulte o passo 2.1 para condições de cultura com o suplemento adicional de 50 ug / ml de higromicina B. - Usando uma pipeta, misturar suavemente as culturas em suspensão as células em placa e da piscina de 12 poços para um tubo separado.
- Usando um hemocitómetro, enumerar células reunidas e sementes em 30 ml de meio isento de soro, num balão de Erlenmeyer a 2 x 10 5 culas / ml. Células de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2 e 120 rotação rpm. Subcultura e expandir cada quatro dias.
- Continuar a expandir o tamanho da cultura a densidade celular necessária para obter 10 frascos a 1 x 10 7 células / frasco de criopreservação em azoto líquido. Congelar as células em meio isento de soro contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
NOTA: condicionado mídia contendo o anticorpo pode ser colhido em cada subcultura para confirmar a produção de proteína ou usado para otimizar as condições de purificação. Para colher os meios condicionados e manter células para subcultura, centrifugar a cultura em300 xg durante 5 min e depois filtrar-esterilizar sobrenadante através de um filtro de 0,22 um. sobrenadante filtrado pode ser mantida a 4 ° C durante 1-2 semanas ou -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
3. Grande Escala da Produção de Anticorpos de lote Overgrow Cultura
NOTA: A produção de anticorpos pode ser seguido por passo de 2,11, onde as células existentes são expandidos para a densidade celular necessária com base no volume de cultura overgrow lote a configuração. Caso contrário, as células que foram descongelados a partir de criopreservação começar nesta fase uma vez expandido até uma densidade celular apropriada e volume. Vários suplementos de cultura podem ser utilizados para optimizar a produção de anticorpos; o uso de triptona para aumentar o rendimento de anticorpo é demonstrado no presente protocolo.
- Semear as células a 2 x 10 5 culas / ml em meio isento de soro de 100 mL em dois frascos de Erlenmeyer (comparar os rendimentos de anticorpo a partir de culturas de un-suplementado e suplementada em nutrientes). Cultura a 37 ° C, 5% de CO 2
- Após 24 h, adicionar triptona até uma concentração final de 0,5% de cultura suplementado com nutrientes. Equalizar volume de cultura suplementado-un com meios livres de soro.
- A partir do dia 8, realizar contagens de células das culturas diários utilizando um hemocitómetro para monitorar a viabilidade celular. Colheita dos sobrenadantes de cultura uma vez que a viabilidade das células é inferior a 80%.
- Colheita sobrenadante por centrifugação das culturas a 3000 xg durante 15 min e depois filtrar-esterilizar o sobrenadante (contendo o anticorpo) através de um filtro de 0,22 um. Armazenar os sobrenadantes a 4 ° C (de curto prazo) ou congelar a -20 ° C (a longo prazo).
4. Anticorpo A purificação por cromatografia de afinidade usando um Cromatografia Líquida de Proteínas Rápida automatizada (FPLC) do sistema
NOTA: O procedimento que se segue pode geralmente ser aplicada a sistemas mais automatizados. A purificação pode ser realizada à temperatura ambiente ou a 4 ° C (sistema FPLC se é mantida numa sala fria).Uma série de testes de aferição pode ser realizada para identificar as condições óptimas de purificação incluindo a matriz de coluna adequada, tampão, tampão de eluição e do pH de ligação para assegurar a recuperação máxima de anticorpo purificado a partir de meios condicionados (consulte a secção de resultados). As condições óptimas são dependentes do anticorpo ou proteína ser purificado. Purificações foram realizadas num sistema de FPLC automatizado. Purificações foram realizadas à temperatura ambiente usando uma coluna 5 ml de Proteína A coluna.
- Prepare os seguintes tampões com água ultrapura e ajustar ao pH recomendado, em seguida, filtrar através de um filtro de 0,22 um.
- Prepare 1 litro de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 (tampão de ligação) através da mistura do seguinte: 0,14 M de NaCl, 0,0027 M de KCl, 0,01 M de Na 2 HPO 4 e 0,001 M de KH 2 PO 4. Ajuste o pH se necessário, antes de se filtrar o tampão.
- Preparar 500 ml de M de glicina-HCl a pH 2,7 (tampão de eluição) 0,1. Ajustar o pH antes de filtrar o lustreer.
- Preparar 50 ml de Tris pH (tampão de neutralização) 9,0 1.
- Certifique-se de todas as conexões eléctricas e de comunicação do sistema com computador são feitas. Os dispositivos devem ser visíveis no software do módulo 'Sistema de Controle'. Assegurar célula UV é fixado em 280 nm, comprimento de onda. Opcional: Calibrar medidor de pH, se estiver ligado e para ser usado.
- Imergir tubos de entrada de A, B e bomba da amostra em água ultrapura para lavar o sistema. Purifica as bombas com uma seringa, se houver ar no tubo ou uma suspeita de ar no sistema. Lavar o sistema com água por operação manual através do controlador de sistema, ou através de um método automatizado. Observe que a pressão, condutividade, traçado UV280 e pH permaneçam consistentes e que o limite de pressão para a coluna não seja excedido de acordo com as especificações do fabricante.
NOTA: Anormalidades pode indicar ar ou bloqueio no sistema que devem ser abordadas antes de prosseguir. - No módulo controlador do sistema, inicie o caudal ao 1ml / min manualmente através de bomba A em qualquer carga (ignorando loop de amostra) ou injetar (através do loop de amostra) posição para começar a ligar a coluna. tubulação do sistema de desconexão na entrada posição da coluna e retire a tampa ligada à entrada da coluna.
- Permitir que a água flua do tubo de gota a gota do sistema na parte superior da coluna, em seguida, fixar a tubagem do sistema para a coluna. Ter a entrada da coluna e acessório de entrada transbordando com gotas de água garante uma conexão livre de bolhas de ar.
- Fixe a saída da coluna na saída a jusante e verificar todas as conexões estão bem apertados. Com a coluna agora ligado ao sistema, não exceder os limites de limite de pressão máxima e caudal, conforme descrito nas especificações da coluna.
- Lavagem da coluna com 5 volumes de coluna (CV) de água. Se necessário, continue lavagem da coluna até UV280 traçado estabilizou.
- Mergulhe tubos de entrada de A em tampão de ligação B na eluição de tampão e bomba da amostra em tampão de ligação tO equilibrar o sistema em tampões correcção. Encha os tubos de entrada com tampão usando PumpWash pela operação manual.
- No módulo do software do 'Method Editor', utilize o assistente método para configurar um método de cromatografia de afinidade para a coluna que se destina a ser utilizado.
NOTA: Sistemas automáticos de FPLC vêm com métodos pré-cheias com as configurações recomendadas (ou seja, vazão e limite de pressão) e execute os passos com base na coluna (fabricante, matriz e tamanho) seleccionado para a purificação.- Use as seguintes etapas de execução para Proteína A cromatografia de afinidade:
- sistema de equilibrar com 5 CV de tampão de ligação e recolher flowthrough no recipiente de resíduos.
- amostra de carga para a coluna (volume a ser carregado é especificada manualmente no método) e recolher flowthrough para um recipiente separado.
- sistema de lavagem com 5 CV de tampão de ligação e recolher flowthrough em um recipiente separado.
- coluna eluir com 5 CV isocratIC fraccionamento utilizando tampão de eluição e recolher amostras de anticorpo purificado em fracções por colector de fracções.
- sistema de equilibrar com 5 CV de tampão de ligação e recolher flowthrough no recipiente de resíduos.
- Use as seguintes etapas de execução para Proteína A cromatografia de afinidade:
- Uma vez que o método tem sido de configuração, especificar o volume de meio condicionado a ser aplicada à coluna e guardar o método.
NOTA: O volume especificado no método deve ser de 5-10 ml menos do que o volume real para evitar a introdução de ar durante o exemplo de execução. O volume especificado utilizado neste protocolo é 90-120 ml. - Submergir o tubo de bomba da amostra para dentro do vaso que contém o meio condicionado.
- Preparar um recipiente separado para recolher flowthrough amostra através do tubo de saída especificada.
NOTA: É importante recolher o flowthrough no caso ocorre um erro durante a execução ou a capacidade de ligação da coluna é excedido exigindo a flowthrough para ser reaplicada para a coluna ou a purificação repeated. - Prepare tubos de coleta no coletor de fração. Adicionar 100 ul de tampão de neutralização por 1 ml de volume de fracção. O sistema de FPLC irá eluir automaticamente as fracções em tubos de colheita.
- No módulo do software do 'Sistema de Controle', abra o método a ser executado.
NOTA: O método de execução é iniciado em uma série de páginas que incluem a verificação das variáveis do método, a configuração do coletor de frações e definir o nome arquivo de resultado e local de armazenamento. - Clique em Iniciar para iniciar a execução. O prazo pode ser monitorado no módulo do 'Sistema de Controle'.
- Após a conclusão da purificação prazo, verificar o cromatograma resultando no módulo 'Avaliação' no software do sistema.
- Combinar todas as fracções contendo proteína num tubo, a troca de tampão separada e concentra-se em PBS utilizando um dispositivo de filtro de centrífuga com 30 kDa de peso molecular de corte. Realize os passos de centrifugação de acordo com o fabricante doinstruções.
- Medir a concentração de anticorpo utilizando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante.
- Se outra purificação prazo é para ser realizado, privilegiada a tubulação da bomba de amostra em tampão de ligação e repita os passos 4,9-4,14.
- Na conclusão de corridas de purificação, mergulhe tubos de entrada de A, B e bomba da amostra em água ultrapura e lavar o sistema e coluna como executou na etapa 3.
- Submergir A, B e tubulação da bomba de exemplo no procedimento de lavagem 20% de etanol e repita para o armazenamento do sistema e coluna.
- Desligue a coluna da tomada a jusante e substituir rolha de coluna, em seguida, desligue coluna na entrada e substituir tampa, volte a ligar a tubulação para o sistema. Armazenar na coluna a 4 ° C.
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Representative Results
Produção estável de trastuzumab por células HEK-293 transfectadas foi confirmada utilizando interferometria-camada de bio (BLI), como apresentado na Figura 1. Uma curva padrão de IgG foi gerado através da medição da taxa de ligação entre um padrão de anticorpos IgG e proteína A biossensor (Figura 1A). A amostra de sobrenadante em bruto foi medida de modo análogo, em seguida, a sua concentração interpolada a partir da curva padrão (Figura 1B). A concentração do sobrenadante foi medido como sendo de cerca de 25 ug / ml (amostrada a partir de 50 ml recolhidos a subcultura) duas semanas após a adaptação sem soro e antes da criação de células em culturas em lote Overgrow.
Sobrenadante recolhido em cada subcultura após a adaptação livre de soro foi reunido e utilizado para optimizar as condições de purificação; de aferição dos tampões de ligação e de eluição foi realizada como se mostra na Figura 2 Figura 2A com base no sinal de UV280. Uma vez que a Proteína A coluna equilibra, um aumento no sinal de UV280 representa o carregamento da amostra; Este aumento é devido ao sobrenadante flowthrough que passa através da coluna (contendo proteínas não ligadas que absorvem luz UV neste comprimento de onda), enquanto que os anticorpos tenham sido capturado pela coluna. Uma vez que a amostra tiver terminado o carregamento, o sinal UV280 retorna à linha de base como quaisquer proteínas não ligadas remanescentes são lavados. A eluição ocorre medida que o pH diminui para o pH óptimo para libertar os anticorpos capturados pela coluna, representada por um aumento no sinal de UV280 com anticorpos eluídos fraccionados e recolhidos pelo colector de fracções. Durante todo o exemplo de execução, as variações de condutividade com base na concentração de sal nas memórias intermédias enquanto que a pressão do sistema deve manter-se relativamente constante. Eluição óptima, o pH e o tampão foi observado em primeiro lugar (Figura 2B); observou-se que o anticorpo ELbuído mais eficientemente fora da coluna a um pH mais baixo usando 0,1 M de glicina HCl ou ácido cítrico. No entanto, abaixo de pH 2,7 houve nenhuma melhoria no perfil de eluição. Além disso, os picos de eluição com HCl 0,1 M de glicina revelou-se menos alargado quando comparados com ácido cítrico 0,1 M a pH semelhante (Figura 2B). Subsequentemente, glicina-HCl 0,1 M pH 2,7 foi usada para optimizar as condições de tampão de ligação (Figura 2A). O efeito dos diferentes tampões de ligação em eluição também foi comparada (Figura 2A). Observou-se que o PBS pH 7,4 e 20 mM de fosfato de sódio pH 7 tinham perfis de eluição comparáveis, enquanto que a adição de NaCl 3 M de tampão de fosfato de sódio (para aumentar a ligação do anticorpo à coluna) não foi favorável. Devido à facilidade de preparação de tampão PBS, PBS pH 7,4 foi seleccionado como o tampão de ligação para purificações futuras.
Os cromatogramas de purificação de lote cobrir cultures são mostrados na Figura 3; cultura suplementado com triptona é comparado a cultura suplementado-un. Notou-se que a adição de triptona suplementado com a cultura resultou em um aumento do sinal de UV280 durante o passo de carregamento da amostra, em comparação com a cultura suplementado-un. A cultura suplementado com triptona produziu 3,8 mg e a cultura suplementado com un 1,7 mg de trastuzumab, com base em proteína recuperada após a permuta do tampão e a concentração. Controlo de Qualidade do anticorpo purificado foi confirmada por electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), tal como mostrado na Figura 4. Trastuzumab crescido em un-completados e condições suplementado com triptona resulta em perfis de anticorpos semelhantes sob condições não redutoras e redutoras. Como esperado, uma banda de destaque em aproximadamente 150 kDa confirma anticorpo correctamente dobrado; outras bandas representam formas fragmentadas do anticorpo, um resultado da quebra de ligações dissulfureto e um artefac induzida pelo métodot. Da mesma forma, duas bandas a 50 e cerca de 25 kDa confirmar a presença de anticorpos de cadeias pesadas e leves, respectivamente.
Figura 1: Confirmação da produção de proteínas por células HEK-293 transfectadas de forma estável usando interferometria-camada de bio (BLI). (A) Curva padrão foi gerado através da medição da taxa de ligação padrão anticorpo de IgG à proteína A biossensor ao longo de 120 segundos (cinzento) seguido por amostra de sobrenadante bruto de trastuzumab PEI-transfectadas (PEI-Tmab; preto). (B) Concentração de proteína de anticorpo no sobrenadante em bruto (círculo aberto preto) foi interpolada a partir da curva padrão (círculos pretos fechadas) através da representação gráfica de anticorpo IgG de concentração padrão em função da taxa de ligação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta f igura.
Figura 2: cromatogramas Purificação de eluição e de ligação experimentos de aferição de buffer. (A) Os passos de purificação são descritos de acordo com o sinal de UV280 (azul, verde ou linhas pretas); carregamento da amostra na coluna, seguida por coluna de lavagem para lavar as proteínas não ligadas, em seguida, a eluição da proteína ligada a partir da coluna. Medição do pH (linha vermelha), condutividade (linha marrom) ea pressão do sistema (linha cinza) é monitorado ao longo da corrida. Três tampões foram testados quanto à ligação de trastuzumab à coluna de lavagem para retirar e de a proteína não ligada para maximizar o rendimento de eluição óptima. (B) de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5-3,3) e ácido cítrico 0,1 M (pH 2,5-3,5) tampões foram testados para a eluição óptima de trastuzumab de proteína A coluna.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: cromatogramas purificação do trastuzumab (TmAb) lote crescer demais culturas cultivadas com nenhum suplemento ou suplementado com triptona. Células HEK-293 transfectadas estavelmente foram instalados em 2 x 10 5 células / ml e cultivadas durante 8 dias, quer un suplementado (120 ml; linha preta) ou suplementado com 0,5% de triptona (90 ml; linha verde). Após a colheita, os sobrenadantes foram purificadas usando PBS pH 7,4 (tampão de ligação) e glicina-HCl de pH (tampão de eluição), 2,7 a 0,1 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise de trastuzumab purificado por SDS-PAGE. Cerca de 2 ug de trastuzumab purificado a partir de un-complementado (-) (+) ou de culturas com suplemento de triptona foi amostrada por 10% de SDS-PAGE sob condições não-reduzidas ou reduzidas. O gel é corado com Coomassie R-250. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo detalha a transfecção, a expressão estável e a purificação de um anticorpo terapêutico em células HEK-293. A expressão estável de genes de anticorpo é o primeiro passo na geração de uma linha de células produtoras de anticorpo para o desenvolvimento e a fabricação de um anticorpo terapêutico. Enquanto ovário de hamster chinês (CHO) continuam a plataforma de escolha para proteínas terapêuticas expressão, a linha de células HEK-293 está a ganhar proeminência com a percepção de que as proteínas produzidas nestas células são uma correspondência próxima proteínas que ocorrem naturalmente humanos, em termos de pós modificações -translational e função 14, 15.
Linhas de células de mamífero, incluindo células CHO (por exemplo, CHO-DG44 e CHO-K1), bem como não-imunoglobulina que segregam linhas de células de murino B NS0 e SP2 / 0 são predominantemente utilizados na produção biofarmacêutica. Os sistemas de expressão à base de tais linhas de células são baseadas em Proc selecçãosos em que clones de alta produção são induzidos e selecionadas por meio de adição incremental de uma droga seletiva específica 16, 17. O processo de selecção de um clone estável pode, portanto, ser difícil e demorado. Em comparação com os métodos existentes, a linha de células HEK-293 robustamente transfects com alta eficiência. O processo de selecção é simplificada e muito facilmente se adapta à cultura em suspensão isenta de soro, tornando-se um sistema de expressão ideal para a produção à escala laboratorial de proteínas 18.
Uma limitação de transfecção estável é o tempo no qual uma quantidade prática de proteína podem ser produzidas e utilizadas em experiências. Para tentar superar isso, o protocolo atual descreve um passo de cultura que podem atingir quantidades substanciais de proteína dentro de 3-6 semanas de transfecção. O lote crescer demais culturas (produção em grande escala) oferecem a oportunidade de produzir quantidades substanciais deanticorpo para a configuração de experimentos in vitro de caracterização na liderança até a seleção de uma linha celular clonal e os candidatos de chumbo. Isto tem vantagens claras em relação a transfecção transiente, o que pode exigir maiores quantidades de ADN e reagentes. Além disso, a produção de proteína não é reprodutível de lote para lote vez que a expressão é apenas temporária e determinada pela eficiência de transfecção.
A adição de triptona neste protocolo proporcionado um maior rendimento na expressão da proteína. A adição de triptona de culturas de transfecção tem sido mostrado previamente para melhorar a síntese de proteína 19, 20. A cultura de triptona suplementado resultou em rendimentos melhorados de anticorpo trastuzumab de 40 mg / l versus a cultura não-suplementado de 14 mg / l (Figura 3). SDS-PAGE verificou-se que: (1) o anticorpo foi produzido a ser correctamente; e (2) a adição de triptona não alterou estrutura baseada em COMcomparação das bandas de anticorpo sob condições não redutoras e redutoras (Figura 4). A adição de triptona com as culturas é opcional e é utilizado especialmente para atingir rendimentos mais elevados de proteína. Outros suplementos têm sido considerados para melhorar a expressão da proteína, tais como o butirato de sódio e ácido valpróico 21, 22, 23.
O primeiro ponto de verificação do protocolo é a confirmação de que a proteína está a ser produzido pela linha de células transfectadas. Este passo pode ser realizado em qualquer momento após o período de duas semanas de pressão selectiva utilizado para seleccionar os transformantes estáveis. Um número de métodos pode ser usado para confirmar a produção de proteínas, incluindo interferometria-camada de bio (Figura 1) ou a abordagem semelhante de um ELISA de IgG. Alternativamente, um western blot pode ser realizada utilizando um anticorpo de detecção anti-IgG de anticorpo para identificar a proteína no sobrenadante em brutoou amostra purificada.
Outros investigadores demonstraram que a maior eficiência de transfecção é conseguida utilizando células aderentes em meio contendo soro 24. A presença de suplementos de origem animal é indesejável para a produção biofarmacêutica. Portanto, a adaptação sequencial para meios livres de soro é um passo crítico no protocolo requerendo paciência e monitorização cuidadosa da viabilidade celular. O período de rotação de 4 dias sugerido neste protocolo é um guia e portanto, se forem encontrados problemas numa determinada concentração sérica, é recomendado que as células serem subcultivadas 2-3 vezes na proporção anterior de para meio isento de soro contendo soro antes de continuar com a próxima relação. Antes da criação de culturas de lote e criopreservação de células, considere que a maioria das linhas de células são consideradas totalmente adaptado após três subculturas em meio isento de soro 100%.
Um dos passos mais importantes na fase de purificação é tele aferição de condições e tampões óptimos para garantir a ligação eficiente do anticorpo à coluna e, em seguida, completa eluição da coluna (Figura 2). O meio condicionado recolhido a cada subcultura é útil para este fim. Neste caso, o tampão de eluição de pH ácido cítrico 3,5 geralmente recomendada para a proteína A cromatografia de afinidade foi inadequada para eluição de trastuzumab a partir da coluna. O experimento de aferição utilizando dois tampões de eluição diferentes a vários pH mostrou claramente que, mesmo dentro do intervalo estreito de pH testados, o grau de eluição foi afectada (Figura 2B).
Em termos de processamento a jusante das fracções de anticorpo, depois da purificação, o anticorpo pode ser de tampão permutado, utilizando uma coluna de dessalinização, quer por operação manual ou automatizado. Alternativamente, a membrana de diálise pode também ser utilizada. concentração final de proteína pode ser determinada por outros métodos de quantificação de proteínas, incluindo mediçãodo sinal de absorvância a 280 nm com a concentração deduzida da lei de Beer Lambert com base no coeficiente de extinção do anticorpo.
Este protocolo produziu com sucesso da proteína de anticorpo trastuzumab por transfecção estável de células HEK-293. O anticorpo foi purificado e caracterizado para confirmar a integridade. Os passos descritos neste protocolo detalhando a preparação de DNA, transfecção estável seguido de adaptação isento de soro, a produção em grande escala e purificação automatizada pode ser transferido para a produção de outras proteínas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFUSE vector series | InvivoGen | N/A | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). | |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. | |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | Addgene | 61883 | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | Jomar Life Research | fas-hg-s | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | Jomar Life Research | fas-hg-l | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | Sigma-Aldrich | G6279 | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | Astral Scientific | G221020 | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | Life Technologies | R790-07 | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | Sigma-Aldrich | K4894 | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11995-065 | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082-147 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | Polysciences, Inc. | 23966 | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use. |
| OptiPro SFM | Life Technologies | 12309-050 | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | Jomar Life Research | ant-hg-1 | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | AJA2225 | |
| Tryptone (casein peptone) | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | Astral Scientific | 09-2051-100 | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | Sigma-Aldrich | GE17-0403-01 | |
| AKTApurifier 100 | GE Healthcare | 28406266 | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | Sigma-Aldrich | G2879 | |
| Citric Acid, monohydrate | Astral Scientific | BIOC2123 | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | Astral Scientific | BIOCB0035 | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | Astral Scientific | BIOSD8146 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | Merck Millipore | UFC803008/UFC903008 | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| BLItz System | fortéBIO | 45-5000 | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | fortéBIO | 18-5010 | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | Astral Scientific | 786-502 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Astral Scientific | AM0486 | |
| TEMED | Astral Scientific | AM0761 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Astral Scientific | 786-498 | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | Bio-Rad | 1610374 |
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