Summary

Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

Published: January 24, 2017
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines therapeutischen Antikörpers in einem Säugetier-Expressionssystem. Die beschriebenen Verfahren umfassen Herstellung von Vektor-DNA, stabile Transfektion und Serum-freie Adaption eines menschlichen Linie embryonalen Nieren-293-Zelle, von großen Kulturen und Reinigung unter Verwendung von Affinitätschromatographie eingerichtet.

Abstract

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Introduction

Der Erfolg von therapeutischen Antikörpern weiterhin erhebliche Investitionen in die Antikörperentwicklung zu fahren, als eine Welle der nächsten Generation Therapeutika beginnt. Der Antikörper – Markt wird erwartet , dass durch Antikörperfragmente 1, Antikörper-Wirkstoff – Konjugate 2, bispezifische Antikörper 3 und manipulierte Antikörper mit günstigen Eigenschaften 4 neu gestaltet werden. Eine andere Klasse pharmazeutischem Interesse zu gewinnen sind Biosimilars. Biosimilar-Antikörper sind "sehr ähnlich" replizieren Produkte eines therapeutischen Antikörper, der bereits die Zulassung erhalten hat. Eine vorgeschlagene Biosimilar muss mit dem Absender Antikörper in Bezug auf seine Struktur, Funktion, Tier Toxizität, klinische Sicherheit und Wirksamkeit, Pharmakokinetik beim Menschen (PK), Pharmakodynamik (PD) und Immunogenität 5, 6 vergleichbar sein.

Die Zulassung rAtes von Biosimilar-Antikörper auf die endgültige Qualität des Produkts aufgrund der strengen Einschränkungen langsam. Die genauen Herstellungsverfahren, wie spezifische Zelllinien und Kulturbedingungen bis hin zu den letzten Verarbeitungsschritte können proprietäre bleiben. Was mehr ist, beinhaltet die Herstellung von Antikörpern inhärent einen Grad an Variabilität, die einen sehr ähnlichen Produkt zur Herstellung der Herausforderung hinzufügen. Eine umfassende physikalisch – chemischen und biophysikalischen Charakterisierung und Vergleich ist ziemlich schwierig, noch eine Reihe von Studien die Merkmale biosimilar Antikörper entstehen in der Literatur 7, 8, 9 demonstriert.

einen therapeutischen Antikörper zu erzeugen beginnt mit Transfektion von Säugerwirtszellen mit einem Vektor, der die Gene für die jeweiligen Antikörper trägt. Vector Design, Zelllinie und Kulturbedingungen sind wichtige Überlegungen für die Ex-Einrichtungpression System.

Die DNA-Sequenzen von Antikörpern aus Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) oder Research-Publikationen einschließlich Patente bezogen werden. Beispielsweise ist die Sequenz von Trastuzumab erhältlich durch Drug Bank (DB ID: DB00072). Die Aminosäuresequenz der variablen Regionen können Gen-Design und die Optimierung für die Synthese in die gewünschten Wirtsspezies unterziehen. Es ist wichtig, für eine biosimilar Antikörper, der keine Modifikation der Aminosäuresequenz vorgenommen wird. Einmal synthetisiert, können Antikörpergene subkloniert in den entsprechenden Vektor der Wahl werden.

Humane IgG-Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten. Eng regulierte Expression beider Ketten 10 für eine optimale Produktion von heterologen IgG – Protein in Säugerzellen wesentlich. Intra- als auch Inter-Ketten-Disulfidbindungen, so ausgebildet und eine Reihe von post-translationalen Modifikationen werden müssen, werden inwährend der Proteinbiosynthese eingeführt. Eine Reihe von Vektoren zur Verfügung, die speziell zum Ausdruck Antikörpergene (siehe Tabelle der Materialien) entwickelt wurden. Diese Antikörper-spezifischen Vektoren Express in der Regel die konstanten Regionen für die schweren und leichten Ketten, so dass nur die variablen Regionen jeder Kette Klonen erfordern.

Die Transfektion von Zellen mit zwei unabhängigen Konstrukte (Co-Transfektion) ist die am häufigsten verwendete Ansatz für die Bereitstellung von schweren und leichten Kette kodierenden Gene. Das heißt, jedes Gen mit seinem eigenen Promotor transkribiert und als getrennte Antikörperketten angetrieben, bevor sie in das endoplasmatische Retikulum montiert. Auf der anderen Seite haben Mehr cistronische Vektoren IRES (IRES) -Elemente eingebaut , das mit Übersetzung aus dem inneren Regionen der mRNA 11 erlaubt die Expression von mehreren Genen als eine einzelne mRNA – Transkripts zu ermöglichen. In diesem Fall werden die schwere und leichte Kette kodierenden Gene in einer arrang gekoppeltenement Coexpression beider Antikörperketten zu erreichen , 10, 12.

Während transient transfizierten Zellen ausreichend Protein ergeben eine begrenzte Anzahl von Versuchen durchzuführen, stabil transfizierten Zelllinien, die höhere Ausbeuten liefern Selektion für Genom-Integration unterzogen wurden. Höhere Proteinmengen ermöglichen Entwicklung Assay invitro – Charakterisierung im Zusammenhang und kann einen Hinweis auf Antikörper Qualität als Gegenleistung für Downstream – Anwendungen wie klonalen Zelllinie und Blei Kandidatenauswahl bieten.

Das Ziel dieses Artikels ist die stabile Expression und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers in einem Säugerexpressionssystem zu beschreiben. Tatsächlich kann dieses Verfahren auf die Expression eines Antikörpers biosimilar angewendet werden. Das Verfahren kann für die anfängliche Charakterisierung von Antikörpern vor dem Fortfahren auf den kritischen, wenn auch zeitraubend Ste verwendet werdenps eines gewünschten Klon für größere Fertigungs identifizieren. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet werden, um andere Proteine ​​zu exprimieren und nicht nur Antikörper.

Die folgende detaillierte Protokoll beschreibt die Expression therapeutischer Antikörper Trastuzumab. Diese besteht aus Zubereitung DNA des Vektors durch stabile Transfektion in HEK-293-Zelllinie und Reinigung von Antikörperprotein durch ein automatisiertes chromatographische Verfahren gefolgt.

Protocol

HINWEIS: Eine geeignete Säugetier-Expressionsvektor muss für dieses Protokoll verwendet werden. Hier wird ein einziges Konstrukt , das zwei Expressionskassetten verwendet wird (dh schweren und leichten Kette Ausdruck wird durch separate Promotoren gesteuert). Trastuzumab schweren und leichten Ketten wurden zuvor in den Vektor geklont. Dieser Vektor war ein Geschenk von Andrew Beavil, 13 durch eine nicht-for-Profit – Plasmid – Repository erhalten. 1. Wiederherstellung und Scale-up…

Representative Results

Stabile Produktion von Trastuzumab durch transfizierte HEK-293 – Zellen wurde unter Verwendung von bio-Schicht Interferometrie bestätigt (BLI) , wie in Abbildung 1 dargestellt. Eine IgG – Standardkurve wurde durch Messung der Bindungsrate zwischen einer IgG – Antikörper und Protein A – Standard Biosensor (1A) erzeugt wird . Der rohe Überstand – Probe wurde in ähnlicher Weise gemessen, dann seine Konzentration aus der Standardkurve (1B)</stron…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Transfektion eine stabile Expression und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers in HEK-293-Zellen. Eine stabile Expression von Antikörpergenen ist der erste Schritt eine Antikörper-produzierende Zelllinie für die Entwicklung und Herstellung eines therapeutischen Antikörpers bei der Erzeugung. Während Eizellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) die Expressionsplattform der Wahl für therapeutische Proteine ​​verbleiben, wird die HEK-293-Zelllinie Prominenz mit der Erkenn…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.

Materials

pFUSE vector series N/A InvivoGen Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series N/A ACYTE Biotech Pty Ltd. Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector N/A N/A Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series N/A Lonza Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
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pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ 61883 Addgene Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar fas-hg-s Jomar Life Research Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB fas-hg-l Jomar Life Research Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. 
Glycerol, BioXtra, ≥99% G6279 Sigma-Aldrich Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit G221020 Astral Scientific Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells R790-07 Life Technologies HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium 12338-018 Life Technologies Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188 K4894 Sigma-Aldrich Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC.
DMEM, high glucose  11995-065 Life Technologies
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum 10082-147 Life Technologies
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000  23966 Polysciences, Inc. Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80oC until use.
OptiPro SFM 12309-050 Life Technologies Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution ant-hg-1 Jomar Life Research
Dimethylsulphoxide (DMSO) AJA2225 Thermo Fisher Scientific
Tryptone (casein peptone) LP0042B Thermo Fisher Scientific Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. 
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml 09-2051-100 Astral Scientific
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column GE17-0403-01 Sigma-Aldrich
AKTApurifier 100 28406266 GE Healthcare Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl G2879 Sigma-Aldrich
Citric Acid, monohydrate BIOC2123 Astral Scientific
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate  BIOCB0035 Astral Scientific
1 M Tris-HCl solution pH 9.0 BIOSD8146 Astral Scientific
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) UFC803008/UFC903008 Merck Millipore Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit 23227 Thermo Fisher Scientific
BLItz System 45-5000 fortéBIO Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors 18-5010 fortéBIO
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution 786-502 Astral Scientific
Ammonium Persulfate (APS) AM0486 Astral Scientific
TEMED AM0761 Astral Scientific
Coomassie Brilliant Blue R-250 786-498 Astral Scientific
Precision Plus Dual-Color Protein Standard 1610374 Bio-Rad

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Cite This Article
Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (119), e55153, doi:10.3791/55153 (2017).

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