Summary

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Published: January 24, 2017
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft de productie van een therapeutisch antilichaam in een zoogdier expressiesysteem. De beschreven werkwijzen omvatten bereiding van vector-DNA, transfectie en stabiele serumvrije adaptatie van humane embryonische nier 293 cellijn opgezet van grootschalige kweken en zuiveren met behulp van affiniteitschromatografie.

Abstract

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Introduction

Het succes van therapeutische antilichamen nog aanzienlijke investeringen rijden in de ontwikkeling van antilichamen als een golf van de volgende generatie therapeutica begint. Het antilichaam markt zal worden hervormd door 1 antilichaamfragmenten, antilichaam-geneesmiddelconjugaten 2 bispecifieke antilichamen 3 en gemanipuleerde antilichamen met gunstige eigenschappen 4. Een andere klasse wint farmaceutische belang biosimilars. Biosimilar antilichamen zijn 'zeer vergelijkbaar' repliceren producten van een therapeutisch antilichaam dat al wettelijke goedkeuring heeft ontvangen. Een voorgestelde biosimilar moet vergelijkbaar zijn met de originator antilichaam met betrekking tot de structuur, functie, dierlijke toxiciteit klinische veiligheid en effectiviteit humane farmacokinetiek (PK), farmacodynamische (PD) en immunogeniciteit 5, 6 zijn.

De goedkeuring rAtes van biosimilar antilichamen zijn traag als gevolg van de strenge beperkingen op de uiteindelijke kwaliteit van het product. De precieze fabricageprocessen zoals specifieke cellijnen en kweekcondities tot de eindverwerking stappen bedrijfseigen zijn. Bovendien, de productie van antilichamen omvat inherent een zekere variabiliteit die aan de uitdaging van het produceren van een zeer soortgelijk product. Een uitgebreide fysiochemische en biofysische analyse en vergelijking is heel moeilijk, maar een aantal onderzoeken die de kenmerken van biosimilar antilichamen ontstaan in de literatuur 7, 8, 9.

Genereren van een therapeutisch antilichaam begint bij transfectie van zoogdierlijke gastheercellen met een vector die de genen voor de respectievelijke antilichaam. Vector ontwerp, cellijn en de kweekomstandigheden zijn belangrijke overwegingen voor het opzetten van de expression systeem.

De DNA-sequenties van antilichamen kunnen afkomstig zijn van Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) of onderzoekspublicaties met inbegrip van octrooien. Bijvoorbeeld, de volgorde van trastuzumab is beschikbaar via Drug Bank (DB ID: DB00072). De aminozuursequentie van de variabele gebieden genen kunnen ontwerpen en optimaliseren ondergaan synthese in de gewenste gastheer species. Het is belangrijk voor een biosimilaire antilichaam dat geen wijziging is aangebracht in de aminozuursequentie. Eenmaal gesynthetiseerd kunnen antilichaam genen worden gekloneerd in de geschikte vector van keuze.

Humane IgG antilichamen bestaan ​​uit twee identieke zware ketens en twee identieke lichte ketens. Strak gereguleerde expressie van beide ketens essentieel voor de optimale productie van heteroloog IgG eiwit in zoogdiercellen 10. Intra- en inter-keten disulfidebindingen te worden gevormd en een aantal post-translationele modificaties moeten introduced tijdens eiwit biosynthese. Een aantal vectoren zijn beschikbaar die speciaal ontworpen zijn om uit te drukken antilichaam genen (zie tabel of Materials). Deze antilichaam-specifieke expressie vectoren gewoonlijk de constante gebieden van zowel zware als lichte ketens zodat alleen de variabele gebieden van elke keten klonen vereisen.

Transfectie van cellen met twee onafhankelijke constructen (co-transfectie) is de meest gebruikte aanpak voor het leveren zware en lichte keten coderende genen. Dat wil zeggen dat elk gen aangedreven door zijn eigen promotor en getranscribeerd als afzonderlijke antilichaamketens alvorens te worden geassembleerd in het endoplasmatisch reticulum. Anderzijds, multi-cistronische vectoren interne ribosoom binnenkomstplaats (IRES) elementen opgenomen die expressie van meerdere genen als een enkel mRNA transcript met translatie toegelaten van inwendige gebieden van het mRNA 11 mogelijk. In dit geval worden de zware en lichte keten coderende genen gekoppeld per arrangement co-expressie van beide antilichaamketens 10, 12 bereiken.

Terwijl tijdelijk getransfecteerde cellen leveren voldoende eiwit om een ​​beperkt aantal experimenten, kan stabiel getransfecteerde cellijnen die selectie hebben ondergaan genoom integratie hogere opbrengsten leveren. Hogere eiwit hoeveelheden zorgen voor testontwikkeling met betrekking tot in vitro karakterisering en kan een indicatie van de kwaliteit antilichaam in aanmerking voor downstream-toepassingen zoals klonale cellijn en lead kandidaat selectie.

Het doel van dit artikel is om de stabiele expressie en zuivering van een therapeutisch antilichaam geproduceerd in een zoogdier expressiesysteem beschreven. Inderdaad, kan deze methode worden toegepast om de expressie van een biosimilar antilichaam. De werkwijze kan worden gebruikt voor de initiële karakterisering van antilichamen alvorens naar de kritische, zij tijdrovend steps voor het identificeren van een gewenste kloon voor grootschaliger productie. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om andere eiwitten en niet alleen antilichamen tot expressie.

De volgende gedetailleerde protocol beschrijft de expressie van therapeutische antilichaam trastuzumab. Deze bestaat uit de bereiding van vector DNA gevolgd door stabiele transfectie in HEK-293 cellijn en zuivering van antilichaam eiwit door een geautomatiseerde chromatografische methode.

Protocol

OPMERKING: Een geschikte zoogdierlijke expressievector worden gebruikt voor dit protocol. Hier is een enkel construct dat twee expressiecassettes gebruikt (bijvoorbeeld zware en lichte keten expressie wordt aangedreven door afzonderlijke promoters). Trastuzumab zware en lichte ketens zijn eerder gekloond in de vector. Deze vector was een geschenk van Andrew Beavil, verkregen door middel van een not-for-profit plasmide repository 13. 1. Herstel en opschaling van Vector DNA L…

Representative Results

Stabiele productie van trastuzumab in getransfecteerde HEK-293-cellen werd bevestigd met behulp biolaag interferometrie (BLI) zoals aangegeven in figuur 1. Een IgG standaardkromme werd gegenereerd door het meten van de binding snelheid tussen een IgG-antilichaam en Proteïne A standaard biosensor (Figuur 1A). Het ruwe supernatant monster werd op soortgelijke wijze gemeten, dan is de concentratie geïnterpoleerd uit de standaard curve (Figuur 1B)….

Discussion

Dit protocol geeft de transfectie stabiele expressie en zuivering van een therapeutisch antilichaam in HEK-293-cellen. Stabiele expressie van antilichaam genen is de eerste stap in het genereren van een antilichaam producerende cellijn voor de ontwikkeling en productie van een therapeutisch antilichaam. Terwijl de Chinese hamster ovarium (CHO) cellen blijven de expressie platform voor therapeutische eiwitten, is de HEK-293 cellijn verkrijgen van bekendheid met het besef dat eiwitten die in deze cellen beter overeenkomen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.

Materials

pFUSE vector series N/A InvivoGen Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series N/A ACYTE Biotech Pty Ltd. Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector N/A N/A Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series N/A Lonza Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ 61883 Addgene Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar fas-hg-s Jomar Life Research Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB fas-hg-l Jomar Life Research Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. 
Glycerol, BioXtra, ≥99% G6279 Sigma-Aldrich Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit G221020 Astral Scientific Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells R790-07 Life Technologies HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium 12338-018 Life Technologies Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188 K4894 Sigma-Aldrich Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC.
DMEM, high glucose  11995-065 Life Technologies
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum 10082-147 Life Technologies
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000  23966 Polysciences, Inc. Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80oC until use.
OptiPro SFM 12309-050 Life Technologies Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution ant-hg-1 Jomar Life Research
Dimethylsulphoxide (DMSO) AJA2225 Thermo Fisher Scientific
Tryptone (casein peptone) LP0042B Thermo Fisher Scientific Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. 
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml 09-2051-100 Astral Scientific
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column GE17-0403-01 Sigma-Aldrich
AKTApurifier 100 28406266 GE Healthcare Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl G2879 Sigma-Aldrich
Citric Acid, monohydrate BIOC2123 Astral Scientific
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate  BIOCB0035 Astral Scientific
1 M Tris-HCl solution pH 9.0 BIOSD8146 Astral Scientific
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) UFC803008/UFC903008 Merck Millipore Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit 23227 Thermo Fisher Scientific
BLItz System 45-5000 fortéBIO Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors 18-5010 fortéBIO
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution 786-502 Astral Scientific
Ammonium Persulfate (APS) AM0486 Astral Scientific
TEMED AM0761 Astral Scientific
Coomassie Brilliant Blue R-250 786-498 Astral Scientific
Precision Plus Dual-Color Protein Standard 1610374 Bio-Rad

References

  1. Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
  2. Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
  3. Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
  4. Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
  5. . . Food and Drug Administration. 22, (2015).
  6. . . European Medicines Agency. 13, (2014).
  7. Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
  8. Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
  9. Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
  10. Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
  11. Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
  12. Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
  13. Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
  14. Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
  15. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
  16. Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
  17. Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
  18. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  19. Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
  20. Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
  21. Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
  22. Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
  23. Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
  24. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).

Play Video

Cite This Article
Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (119), e55153, doi:10.3791/55153 (2017).

View Video