Summary

Síntesis de 1,2-Azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima T4 Mutantes

Published: March 25, 2017
doi:

Summary

A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.

Abstract

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.

Introduction

El boro-heterociclos que contienen nitrógeno (es decir, 1,2-azaborines) recientemente han llamado la atención significativa como isosteras de arenos. Este isosterism puede conducir a la diversificación de los motivos estructurales existentes para ampliar el espacio químico 2, 3, 4. Azaborines tienen utilidad potencial para la aplicación en la investigación biomédica 5, 6, 7, 8, especialmente en el área de la química médica en la que los químicos llevar a cabo la síntesis de bibliotecas de moléculas estructuralmente y funcionalmente relevantes. Significativamente, sin embargo, si bien hay numerosas rutas sintéticas bien desarrollados a moléculas que contienen areno-disponibles, se han reportado sólo un número limitado de métodos para la síntesis de azaborines 9, 10, </shasta> 11, 12, 13. Esto se debe principalmente a un número limitado de opciones para la fuente de boro y el aire y la naturaleza sensible a la humedad de la molécula en la fase inicial de la secuencia sintética.

En la primera parte de este artículo, describiremos una síntesis escala multi-gramo de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) usando técnicas sin aire estándar. Este compuesto sirve como un intermedio versátil que puede ser además funcionalizado para estructuralmente más complejas moléculas 14, 15. A partir de 3, se describirán la síntesis y purificación de N -H- B etil-1,2-azaborine (5) para su uso en estudios de unión a proteínas. Debido a la volatilidad de 5, su aislamiento eficiente requiere un control preciso de la temperatura de reacción, tiempo, y distillation condiciones.

En la segunda parte, los protocolos para la expresión de proteínas y el aislamiento de mutantes T4 lisozima (L99A y L99A / M102Q) 17, 18, 19, se presentarán 20, seguido de la cristalización de proteínas y la preparación de los complejos de cristal de proteína-ligando. Mutantes de lisozima T4 L99A y L99A / M102Q fueron elegidos como modelo de los sistemas biológicos para examinar la capacidad de enlace de hidrógeno de las moléculas que contienen NH azaborine 17. El uso de un protocolo de biología molecular estándar, la proteína se expresa en la cepa Escherichia coli RR1 y indujo con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Purificación de proteínas se lleva a cabo usando cromatografía en columna de intercambio iónico. cristalización de proteínas se lleva a cabo con una solución altamente concentrada y purificada de proteínas (> 95% de pureza por electroforesis en gel) usando el colgantedeje caer método de difusión de vapor. Debido a la sensibilidad de los ligandos de este estudio para el oxígeno, los complejos proteína-ligando se preparan en condiciones libre de aire.

Protocol

NOTA: Todas las manipulaciones de oxígeno y sensibles a la humedad se llevaron a cabo bajo una atmósfera inerte (N2), utilizando cualquiera de las técnicas sin aire estándar o una caja de guantes. THF (tetrahidrofurano), Et 2 O (éter dietílico), CH 2 Cl 2 (diclorometano), tolueno, y pentano se purificaron pasando a través de una columna de alúmina neutra en atmósfera de argón. El acetonitrilo se secó sobre CaH 2 (hidruro de calcio) y se destiló bajo atm?…

Representative Results

La vía de síntesis esquemático para 1,2-azaborines se muestra en la Figura 1. Este protocolo se aplica a la síntesis de cinco moléculas de nitrógeno que contiene boro diferentes. La Figura 2 representa los espectros de 11 B NMR medida durante el curso de la etapa 1.3 para monitorizar la formación del producto deseado (3). Purificación de proteínas se realizó mediante el uso de sistema de cromatografía de baja presi?…

Discussion

En la primera parte de este protocolo, se describe una síntesis modificada de 1,2-azaborines basadas en métodos reportados previamente 12, 13. Triallylborane 22 fue utilizado como un sustituto de las rutas usando allyltriphenyl estaño o de potasio allyltrifluoroborate para preparar N -allyl- N -TBS- B alil aducto de cloruro de (1). Este método permite un enfoque más átomos-económica y res…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by the National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) and Boston College.

Materials

Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% Sigma Aldrich 34865
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free Sigma Aldrich 309966
Methylene chloride  (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) Fisher D37-20
Toluene Fisher T290-4
Pentane, HPLC Fisher P399-4
Acetonitrile Fisher A21-4
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% Sigma Aldrich 208027 Pyrophoric
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd Strem 46-1900
1.0 M Boron trichloride solution in hexane Sigma Aldrich 211249 Highly toxic/ Pyrophoric
Triethylamine, ≥99.5% Sigma Aldrich 471283
Grubbs 1st generation catalyst  materia C823
Acetamide Sigma Aldrich A0500
n-Butanol, anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 281549
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane Sigma Aldrich 561452 Highly toxic/ Pyrophoric
HCl solution, 2.0 M in Et2O Sigma Aldrich 455180
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% Sigma Aldrich 277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) ATCC 31343
T4 lysozyme WT* (L99A) Addgene 18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) Addgene 18477
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Invitrogen AM9464
Sodium phosphate monobasic  anhydrous Fisher BP329
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher BP332
Sodium chloride Fisher S642212 
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BP118
Magnesium chloride Sigma Aldrich M4880 Corrosive
Thermo scientific pierce DNaseI Fisher PI-90083
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media Fisher 45-002-931
Tris-base Fisher BP152-500 
Sodium azide TCI S0489 Highly toxic
2-Mercaptoethanol Fisher ICN806443 
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators Fisher 14-558-501
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
2-Hydroxyethyl disulfide Sigma Aldrich 380474
N-paratone  Hampton Research HR2-643
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO  Fisher 08-667E
 CryoLoop Hampton Research cryogenic tubing shaped into a loop
CryoTong Thermo Fisher cryogenic tong
Coot Electron density images are generated from the software

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Cite This Article
Lee, H., Liu, S. Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants. J. Vis. Exp. (121), e55154, doi:10.3791/55154 (2017).

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