Summary
लाइव कोंफोकल इमेजिंग विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के साथ जीव प्रदान करता है। यहाँ, हम Arabidopsis फूल विकसित करने की लाइव कोंफोकल इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
पौधों की वृद्धि और विकास के अध्ययन में लंबे समय मृत, तय ऊतकों का उपयोग कर और उचित सेलुलर संकल्प की कमी प्रयोगात्मक तकनीक पर भरोसा किया गया है। कोंफोकल माइक्रोस्कोपी में हाल के अग्रिमों, कई fluorophores के विकास के साथ संयुक्त, इन मुद्दों पर काबू पाने और संभावना, एक अच्छा सेलुलर संकल्प के साथ, लाइव नमूनों में एक साथ कई जीनों की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के खोल लिया है। लाइव कोंफोकल इमेजिंग विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के साथ संयंत्र जीव प्रदान करता है, और बड़े पैमाने पर जड़ के विकास और शूटिंग के शीर्षस्थ विभज्योतक के किनारों पर पार्श्व अंगों के गठन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, यह व्यापक रूप से फूल के विकास के अध्ययन के लिए, चुनौतियों है कि इस तरह बाह्यदल कि फूल विभज्योतक के साथ बढ़ती के रूप में फूल, इमेजिंग, और अंतर्निहित ऊतकों से प्रतिदीप्ति को फ़िल्टर करने के लिए विशिष्ट हैं के कारण लागू हिस्से में नहीं किया गया है। यहाँ, हम लाइव पर लाइव कोंफोकल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, अरब के विकास में एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेशidopsis फूलों की कलियों, या तो एक ईमानदार या उलटे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर।
Introduction
या शिखर मेरिस्टेमों - - गोली मारता है और जड़ों के संयंत्र शरीर के अधिकांश स्टेम पर या टिप के पास स्थित कोशिकाओं के समूहों से रूपों के बाद embryonically। फूल मेरिस्टेमों (एफएमएस) के बाद यह प्रजनन चरण के लिए संक्रमण वनस्पति चरण के दौरान छोड़ देता है, और: सभी वयस्क संयंत्र की जमीन के ऊपर संरचनाओं गोली मार शीर्षस्थ विभज्योतक (एसएएम), जो लगातार अपने किनारों पर पार्श्व अंगों का उत्पादन से निकाले जाते हैं। बदले में एफएमएस फूल के रूप में विकसित। जबकि Arabidopsis सैम एक समय में पार्श्व अंगों एक पैदा करता है, एक सतत, सर्पिल पैटर्न में, एफएमएस चार whorls भीतर पुष्प अंगों के चार प्रकार, उत्पादन, एक आंशिक रूप से तुल्यकालिक ढंग से कई विकासात्मक कार्यक्रमों को एक साथ उजागर साथ। विभिन्न पुष्प अंगों की पहचान के विनिर्देश अंतर्निहित आनुवंशिक नेटवर्क आंशिक रूप से सही मतलब निकाला गया है, लेकिन कई पहलुओं फूल विकास सेमिनारों की (समीक्षा के लिए, संदर्भ 1, 2 देखें)NT, इस तरह के फुलीय अंग स्थिति और whorls के बीच की सीमाओं की परिभाषा के रूप में, खराब समझ रहते हैं।
संयंत्र के विकास के प्रारंभिक आणविक आनुवंशिक अध्ययन का ज्यादातर उपयोग, स्वस्थानी संकरण और गस संवाददाताओं से जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने में के रूप में तकनीक पर भरोसा किया। एक ही में कई जीनों की अभिव्यक्ति पैटर्न की आसान अवलोकन के लिए अनुमति नहीं देते वे अच्छे सेलुलर संकल्प की कमी है,: इन तरीकों जानकारी का खजाना प्रदान की है और बहुत पौधों की वृद्धि और फूल विकास की हमारी समझ के लिए योगदान दिया है, वहीं महत्वपूर्ण सीमाएं हैं नमूने, और महत्वपूर्ण बात, केवल मृत, तय ऊतकों को लागू किया जा सकता। कोंफोकल माइक्रोस्कोपी में हाल के अग्रिमों इन सीमाओं को पार, और प्रक्रियाओं अंतर्निहित संयंत्र morphogenesis की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के साथ विकासात्मक जीव प्रदान किया है। विशेष रूप से, कोंफोकल माइक्रोस्कोपी लाइव ऊतकों और अंगों उनके निर्माण के दौरान के अवलोकन, जो सी है के लिए अनुमति देतापूरी तरह से इस तरह के विकास के रूप में एक सर्वोत्कृष्ट गतिशील प्रक्रिया को समझने में ritical।
लाइव कोंफोकल इमेजिंग बड़े पैमाने पर, (उदाहरण के लिए संदर्भ 7, 8 (जैसे 3 का संदर्भ है, 4, 5, 6), लेकिन कुछ रिपोर्टों के अपवाद के साथ सैम द्वारा पौधों की हवाई विकास और पार्श्व अंगों के उत्पादन विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 9, 10), यह व्यापक रूप फूल के विकास के अध्ययन के लिए लागू नहीं किया गया है। सैम की लाइव कोंफोकल इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए 11 का संदर्भ है, 12), और कैसे छवि के लिए विकासशील फूलों की कलियों कि सैम के चारों ओर के लिए एक अच्छा आधार प्रदान करते हैं। हालांकि, इमेजिंग फूलों की कलियों विशिष्ट चुनौतियों प्रस्तुत करता है: उदाहरण के लिए,फूलों की कलियों जल्दी से सैम से भी बड़ा हो गया है, और चरण 4 में, बाह्यदल (संदर्भ 13 में वर्णित के रूप चरणों) एफएम को कवर, और ऊतकों (चित्रा 2A) अंतर्निहित से प्रतिदीप्ति मंद शुरू करते हैं। यहाँ, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल बताया गया हो कि या तो एक ईमानदार या उलटे माइक्रोस्कोप और एक पानी में डुबकी लेंस का उपयोग Arabidopsis फूलों की कलियों के विकास पर लाइव कोंफोकल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए प्रदान करते हैं। हम पहले से संदर्भ 14 में इस प्रोटोकॉल को प्रकाशित किया।
Protocol
1. मीडिया और व्यंजन तैयार करना
- 2% agarose के साथ 0.5 सेमी करने के लिए (लगभग 6 सेमी चौड़ा, 2 सेमी गहरी) दौर प्लास्टिक बक्से भरकर व्यंजन चीर-फाड़ तैयार करें।
- इमेजिंग व्यंजन तैयार करें।
- एक ईमानदार confocal खुर्दबीन के लिए, को भरने के आयताकार प्लास्टिक hinged बॉक्स (लगभग 7 सेमी लंबा, 4.5 सेमी चौड़ा, 3 सेमी गहरी) इमेजिंग माध्यम के साथ 0.5 सेमी करने के लिए (खंड 1.3 देखते हैं, "इमेजिंग मध्यम", चित्रा 1F)।
- उलटे कोंफोकल माइक्रोस्कोप के लिए: (लगभग 3.5 सेमी, विस्तृत 1 सेमी गहरी) वास्तव में इमेजिंग माध्यम के साथ किनारा करने के लिए छोटे पेट्री डिश को भरने (खंड 1.3 देखते हैं, "इमेजिंग मध्यम", चित्रा 1G)।
- इमेजिंग मध्यम तैयार करें।
- एकल बिंदु इमेजिंग के लिए, 1% agarose का उपयोग करें।
- समय-अंतराल प्रयोगों के लिए, पोटेशियम hydroxid साथ सुप्रीम विकास का माध्यम (0.5x Murashige और Skoog विटामिन के बिना बेसल नमक मिश्रण, 1% सुक्रोज, 0.8% agarose, पीएच 5.8 का उपयोगई समाधान, विटामिन [0.01% myo-इनोसिटोल, 0.0001% निकोटिनिक एसिड, 0.0001% ख़तम हाइड्रोक्लोराइड, 0.001% thiamine हाइड्रोक्लोराइड, 0.0002% ग्लाइसिन] और साइटोकिनिन [500 एनएम N6-benzyladenine]) 15 के साथ पूरक।
2. संयंत्र विकास
- उचित चयन के साथ एमएस प्लेट (0.5 या 1x Murashige और Skoog बेसल नमक मिश्रण विटामिन के बिना, 0.8% अगर, पोटेशियम हीड्राकसीड समाधान के साथ पीएच 5.8) पर निष्फल बीज बोना। लंबे दिन के (16 ज प्रकाश) या लगातार दिन में रखें प्लेटें, 16-22 ° दो सप्ताह के लिए सी की स्थिति।
- पर्याप्त अंतर के साथ मिट्टी पर प्रत्यारोपण अंकुर मजबूत विकास की अनुमति के लिए। कम दिन में रखें पौधों, 16-22 ° तीन सप्ताह के लिए सी की स्थिति।
नोट: लंबे दिन के या लगातार दिन की स्थिति में पौधे उगाने सीधे समय से पहले फूल और पुष्पक्रम कि कम जोरदार, और बहुत कठिन टुकड़े करना हैं में परिणाम रोपाई के बाद। इसी तरह, छोटी दिन condit के तहत पौधों छोड़नेदिन की लंबाई स्वतंत्र फूल में तीन सप्ताह से अधिक परिणाम और पुष्पक्रम कि कम जोरदार रहे हैं के लिए आयनों। - लंबे दिन के (16 ज प्रकाश) या लगातार दिन के लिए स्थानांतरण पौधों, 16-22 डिग्री सेल्सियस वे फूल जब तक की स्थिति। शूट apices टुकड़े करना सबसे आसान है जब पुष्पक्रम 2-10 सेमी लंबा है।
3. शूट एपेक्स के विच्छेदन
- वैकल्पिक: एक ठीक शार्पनिंग पत्थर और प्रकाश तेल की एक बूंद का उपयोग करना, stereomicroscope के तहत संदंश पैनापन बात की तरह नहीं उन्हें ब्लेड की तरह बनाने के लिए,।
- संदंश के साथ peduncles के आधार धक्का जब तक वे तोड़ने से प्राथमिक पुष्पक्रम से siliques, बड़े फूलों की कलियों और माध्यमिक पुष्पक्रम निकालें। आवर्धन के बिना संभव के रूप में कई फूलों निकालें (चित्रा 1, ए और बी की तुलना में)।
- संदंश, पियर्स एक विदारक पकवान की agarose में एक ऊर्ध्वाधर छेद का उपयोग करना, पुष्पक्रम के अंतिम 0.5 सेमी काट और agarose में खड़ी यह चिपके रहते हैं। बचा हुआफूलों की कलियों agarose सतह से ऊपर होना चाहिए।
- बाँझ, de-आयनित पानी के साथ इमेजिंग पकवान भरें ताकि शूट एपेक्स पूरी तरह से डूब जाता है। Stereomicroscope के तहत चीर-फाड़ पकवान रखें, और एक 1000 μL विंदुक के साथ पानी के जेट बनाने के द्वारा हवा शूट एपेक्स के आसपास फंस हटाने (चित्रा 1, सी और डी की तुलना में)।
- Stereomicroscope के तहत, फूलों की कलियों कि डंठल के आधार या डंठल टूट जाता है (चित्रा 1E) जब तक कली की चोटी पर जोर दे ने उतारी जा करने के लिए नहीं कर रहे हैं दूर करने के लिए संदंश का उपयोग करें। यह महत्वपूर्ण है कि peduncles स्टेम साथ जंक्शन पर सफाई से तोड़ने, बचे हुए peduncles युवा फूलों की कलियों को हटाने में बाधा के रूप में।
- इमेजिंग केवल फूलों की कलियों चरण 5 और युवा (चित्रा 2 ए), चरण 6-8 फूलों की कलियों चीर-फाड़ से पहले पानी को निकाल देते हैं। इमेजिंग फूलों की कलियों चरण 5 और पुराने, बाह्यदल पृथक करने के लिए आगे बढ़ते हैं (अनुभाग 5.1 देखें)। अन्यथा, समर्थककदम 3.7 Ceed।
- संदंश का प्रयोग, एक इमेजिंग पकवान के माध्यम में एक ऊर्ध्वाधर छेद बेध, और मध्यम में विच्छेदित सुप्रीम ईमानदार रहना, ताकि केवल शूट शीर्षस्थ विभज्योतक और आसपास के फूलों की कलियों मध्यम की सतह से ऊपर हैं। जो कली (रों) imaged किया जाना कर रहे हैं पर निर्भर करता है, यह थोड़ा, नमूना झुकाने के लिए के रूप में फूलों की कलियों जरूरी वास्तव में स्टेम (चित्रा 2A) की तरह उन्मुख नहीं कर रहे हैं आवश्यक हो सकता है।
- नमूना धुंधला अगर जरूरत के लिए आगे बढ़ें। तो धुंधला हो जाना नहीं है और / या नमूना इमेजिंग तुरंत, पानी जोड़ने के लिए और निर्जलीकरण को रोकने के लिए इमेजिंग पकवान बंद कर दें। उलटे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं, तो एक पारदर्शी प्लास्टिक बॉक्स में इमेजिंग पकवान जगह है और उसे बंद करें।
चित्र 1: लाइव कोंफोकल इमेजिंग के लिए शूटिंग apices तैयार करना। (ए - ई) एक के विच्छेदनइमेजिंग के लिए सुप्रीम गोली मार। पुष्पक्रम (ए) पहले और बाद में (बी) siliques और पुराने फूलों को हटाने। (सी - डी) शूट एपेक्स चीर-फाड़ डिश में पानी में डूबे, एक हवाई टिप (सी) में फंस बुलबुला के साथ और हवा बुलबुला (डी) को हटाने के बाद। , इमेजिंग डिश में गोली मार apices का दृश्य एक ईमानदार (एफ) और उल्टे (G) कोंफोकल खुर्दबीन के मंच पर - (ई) सुप्रीम चीर-फाड़ डिश में, गोली चरण 5. (जी एफ) से अधिक उम्र फूलों की कलियों के विच्छेदन के बाद । (एफ) में, एक 40x पानी डुबकी लेंस लेंस पानी में डूब की नोक से apices में से एक ऊपर तैनात किया गया है। (G) में, शूट एपेक्स लेंस की नोक इमेजिंग मध्यम कनेक्ट करने में कोई पानी स्तंभ के साथ उल्टा 40X पानी डुबकी लेंस ऊपर तैनात किया गया है। (एफ) में छोटे पैनल एक hig से पता चलतालाल आयत में क्षेत्र, एक शूट एपेक्स इमेजिंग मध्यम में डाला के साथ की उसके आवर्धन होने से दृश्य; लाल और नीले रंग लाइनों, मध्यम और पानी की सतह से संकेत मिलता है क्रमशः। (एच - मैं) कस्टम निर्मित उपकरणों कि पानी डुबकी लेंस की नोक पर अधिक पानी जोड़ने की अनुमति के उदाहरण: किसी की उंगली से बनाया गया एक सिलिकॉन रबर आस्तीन एक स्पार्क प्लग बूट (एच) से बना है, और एक अस्थायी आस्तीन powderless लेटेक्स दस्ताने (G)। स्केल सलाखों = में (ए) 0.5 सेमी और (बी), में (सी) 0.1 सेमी और (डी), और में 100 सुक्ष्ममापी (ई)। शुरू में यह आंकड़ा संदर्भ 14 में प्रकाशित हुआ था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
4. धुंधला
नोट: सेल दीवारों या प्लाज्मा झिल्ली propidium आयोडाइड या FM4-64 के साथ दाग किया जा सकता है, क्रमशः, सेलुलर संकल्प को प्राप्त करने केइमेजिंग के दौरान। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली के लिए टैग प्रोटीन के साथ संवाददाता लाइनों, 16 6 इस्तेमाल किया जा सकता।
- इमेजिंग पकवान से पानी निकालें, और सतह सुनिश्चित की मध्यम डाई कमजोर से बचने के लिए सूखी है।
- stereomicroscope के तहत, 20 से 30 या तो 1 मिलीग्राम / एमएल propidium आयोडाइड समाधान, या 80 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल FM4-64 विच्छेदित सुप्रीम करने के लिए एक 10 μL विंदुक के साथ समाधान के μL करने के लिए लागू होते हैं। यकीन है कि पूरे नमूना डाई में शामिल है एक सजातीय धुंधला सुनिश्चित करने के लिए सुनिश्चित करें।
- 2 मिनट के लिए दाग अगर propidium आयोडाइड, या 20 मिनट का उपयोग कर यदि FM4-64 का उपयोग कर।
- बाँझ, विआयनीकृत पानी के साथ दो बार कुल्ला।
5. बाह्यदल एबलेशन
ध्यान दें: चरण 4 में, बाह्यदल primordia एफएम को कवर शुरू करते हैं। के रूप में वे होते हैं, वे अंतर्निहित ऊतक से प्रतिदीप्ति को फ़िल्टर, और इमेजिंग प्रक्रिया में बाधा। बाह्यदल या तो स्वयं एक धातु पिन mounte का उपयोग कर हटाया जा सकता हैएक पिन शिकंजा पर घ, या बाह्यदल primordia उभरते पर लेजर पृथक का उपयोग कर विकसित करने के लिए रोका। वैकल्पिक रूप से, यह कुछ मामलों में इस तरह के रूप में apetala1-1 उत्परिवर्ती, जिसमें बाह्यदल याद कर रहे हैं या पत्ती की तरह अंगों कि एफएम को कवर नहीं करती, जबकि फूल के मध्य भाग सामान्य रूप से विकसित (चित्रा 2F) 17 द्वारा प्रतिस्थापित उपयोग करना संभव है।
- फूलों की कलियों चरण 5 और पुराने एक पिन शिकंजा एक सीधे धातु सुई पकड़े प्रयोग पर बाह्यदल पृथक (चित्रा 2, ई 1-E2)
- stereomicroscope के तहत विच्छेदित सुप्रीम साथ चीर-फाड़ पकवान रखें, और अधिकतम करने के लिए आवर्धन निर्धारित किया है। बाँझ, विआयनीकृत पानी में शूट एपेक्स विसर्जित कर, या वैकल्पिक रूप, बाह्यदल चीर-फाड़ जबकि नियमित रूप से शूट एपेक्स के लिए पानी लागू करने के लिए एक 1000 μL पिपेट का उपयोग करें।
- पिन शिकंजा के साथ, abaxial बाह्यदल की चोटी पर पिन, स्पर्शरेखीय शूट एपेक्स के सापेक्ष स्थिति। धीरे शूट एपेक्स से दूर बाह्यदल धक्का जब तक यह दूर टूट जाता हैकली से।
- adaxial बाह्यदल साथ इसी तरह आगे बढ़ें, लेकिन शूट एपेक्स की ओर बाह्यदल धक्का।
- पार्श्व बाह्यदल साथ इसी तरह आगे बढ़ें, लेकिन पिन त्रिज्यात शूट एपेक्स के सापेक्ष स्थिति, और फूल कली से पक्ष बाह्यदल धक्का, दूर।
- निर्जलीकरण को रोकने के लिए कुछ मिनट के लिए बाँझ, विआयनीकृत जल में शूट एपेक्स को डुबो दें।
- चरण 3-4 में बाह्यदल primordia के लेजर पृथक (चित्रा 2, सी 5-D5)
- कोंफोकल खुर्दबीन मंच पर रंगीन, विच्छेदित सुप्रीम साथ इमेजिंग पकवान रखें। पता लगाएँ और सुप्रीम पर ध्यान केंद्रित करने के रूप में अगर यह छवि (धारा 6, "इमेजिंग सेटअप" देखें) की तैयारी कर रहा।
- लेजर पृथक सिस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, पृथक क्षेत्र है, जो abaxial और adaxial बाह्यदल के लिए चरण 3 में शिखा और उभरते बाह्यदल primordia की नोक से पहले वे फूल विभज्योतक (आमतौर पर कवर शुरू करने के लिए मेल खाती है, को परिभाषित है, और अंतिम चरण 3 / जल्दी में पार्श्व से के लिए मंच 4दोस्त)।
- लेजर शक्ति और उचित मानकों के निवास समय सेट अंतर्निहित ऊतकों के लिए बहुत अधिक क्षति पहुंचाई बिना पर्याप्त कोशिकाओं काटकर अलग करना है। आमतौर पर, लेजर पृथक इस्तेमाल किया सिस्टम के आधार पर, उचित मानकों शुरू में एक परीक्षण और त्रुटि प्रक्रिया के माध्यम से पहचाना जा करने के लिए कि पर्याप्त कोशिकाओं सुनिश्चित करने के लिए निकाल दिए जाते हैं फूल के बाकी को प्रभावित किए बिना, बाह्यदल बाद में एफएम से अधिक विकसित करने के लिए रोकने के लिए की जरूरत है कली। बहुत ज्यादा लेजर शक्ति का उपयोग करते हुए और फूल के केंद्र के लिए नुकसान में समय परिणामों में रहने वाली, इसके विकास और / या अस्तित्व को प्रभावित करने वाले। एक बार जब उचित मानकों पहचान की गई है, वे बाद के प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है।
नोट: प्रारंभिक पृथक अपर्याप्त साबित होता है, तो यह बाद के दिनों पर एक दूसरे पृथक (चित्रा 2, सी 4 और डी 2) करने के लिए आगे बढ़ने के लिए संभव है।
6. इमेजिंग सेटअप
- एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
नोट: जब एक ईमानदार खुर्दबीन के साथ इमेजिंग, कई apices एक ही इमेजिंग डिश में रखा जा सकता है। हालांकि, अगर इमेजिंग प्रक्रिया एक घंटे से अधिक समय तक रहता है, propidium आयोडाइड पतला हो जाता है, और कुछ नमूने फिर से धुंधला इमेजिंग से पहले की आवश्यकता हो सकती। - खुर्दबीन मंच (चित्रा 1F) पर इमेजिंग पकवान रखें। पानी डुबकी लेंस लोअर और इतना है कि लेंस की नोक पानी में डिप चरण बढ़ा। सावधानी से आगे बढ़ें तो के रूप में विच्छेदित apices कुचलने या इमेजिंग माध्यम में लेंस डुबकी के लिए नहीं।
- एक हवा बुलबुला लेंस की नोक पर फंस गया है, तो इसे हटाने के लिए एक 1000 μL विंदुक के साथ पानी के जेट बनाते हैं।
- epifluorescence रोशनी, स्थिति के तहत लेंस क्षेत्र में विच्छेदित apices में से एक XY चोर का उपयोग करट्रोलर। आईपीस माध्यम से देखो और नमूना जेड नियंत्रक का उपयोग पर ध्यान केंद्रित। आदेश नमूना को कुचलने के लिए नहीं में सावधानी से आगे बढ़ें।
- कोंफोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, यह कली पर ज़ूम imaged किया जाना है, और अपने नमूना इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें।
- एक 1000 μL विंदुक का प्रयोग, लेंस की नोक पर बाँझ, विआयनीकृत पानी की एक बूंद डाल दिया।
- इमेजिंग पकवान उलटा पकड़ो, और एक 1000 μL विंदुक के साथ, विच्छेदित सुप्रीम करने के लिए बाँझ, विआयनीकृत पानी की एक बूंद जोड़ें।
- खुर्दबीन मंच (चित्रा 1G) पर इमेजिंग पकवान उलटा रखें। सावधानी से आगे बढ़ें तो के रूप में नमूना को कुचलने के लिए नहीं।
- epifluorescence रोशनी के तहत, लेंस XY नियंत्रक का उपयोग की नोक से अधिक विच्छेदित सुप्रीम स्थिति। जेड नियंत्रक के साथ, ध्यान से मंच को कम जब तक नमूना लेंस की नोक पर पानी की बूंद तक पहुँचता है। एक पानी स्तंभ betw फार्म चाहिएलेंस और मध्यम की नोक een।
- यदि पानी के स्तंभ के रूप में नहीं है, ध्यान से एक 1000 μL विंदुक के साथ नमूना करने के लिए पानी की एक बूंद जोड़ें। इसकी टिप है, जो स्थापना और पानी के स्तंभ (चित्रा 1H और 1 मैं) के रखरखाव की सुविधा में और अधिक पानी जोड़ने के लिए लेंस को अस्थायी आस्तीन जोड़ें।
- epifluorescence रोशनी के तहत, आईपीस के माध्यम से देखने के लिए और नमूना जेड नियंत्रक का उपयोग पर ध्यान केंद्रित। सावधानी से आगे बढ़ें तो के रूप में नमूना को कुचलने के लिए नहीं।
- कोंफोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, यह कली पर ज़ूम imaged किया जाना है, और नमूना इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें।
नोट: एक ओर जहां विकास में कोशिकाओंपिंग पुष्प अंगों में तेजी, कोशिकाओं पुष्प विभज्योतक विभाजन में एक या दो बार हर दूसरे दिन विभाजित कर सकते हैं, और कोशिका वंश समय अंक हर 24 घंटे के साथ ट्रैक करने के लिए आसान है। हालांकि, अगर जरूरत हो, यह संभव छवि के लिए नमूने हर छह घंटे है।
7. इमेजिंग पैरामीटर पर विचार
नोट: कैसे इमेजिंग मानकों की स्थापना के लिए कोंफोकल इस्तेमाल किया प्रणाली पर बहुत कुछ निर्भर करता है। नीचे इन मानकों है कि किसी भी कोंफोकल सूक्ष्मदर्शी के साथ इस्तेमाल किया जा सकता से कुछ के लिए सुझाव दिए गए हैं। इमेजिंग मानकों के बारे में अधिक विचार के लिए, चर्चा अनुभाग देखें और संदर्भ 14।
- XY संकल्प के लिए: एक अच्छा सेलुलर संकल्प के लिए 1024 x 1024 का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, 512 x 512 का उपयोग इमेजिंग समय को कम करने, संकल्प की कीमत पर।
- जेड संकल्प के लिए: 0.5-1.5 सुक्ष्ममापी करने के लिए कदम आकार सेट। सौतेली आकार कम करने जेड संकल्प लेकिन यह भी इमेजिंग समय बढ़ जाती है।
8. Confocal डाटा का विजुअलाइजेशन
- अभी भी एक फिल्म में फूल विकास के समय अंक की छवियों कर दें।
- सॉफ्टवेयर (जैसे, फिजी) में अब भी छवियों (jpeg या TIF स्वरूप में) खोलें।
- स्टैक करने के लिए छवि> ढेर> चित्र जाओ। खुला छवियों एक ढेर में समूहीकृत हो जाएंगी।
- ढेर में छवियों के आदेश कालानुक्रमिक क्रम के अनुरूप नहीं है, तो उन्हें पुन: व्यवस्थित करने के लिए ढेर सॉर्टर प्लगइन (प्लगइन्स> ढेर> ढेर सॉर्टर) का उपयोग करें।
- एक फिल्म में ढेर करने के लिए, फ़ाइल> इस रूप में सहेजें> AVI जाना।
Representative Results
चित्र 2 लाइव Arabidopsis फूल अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त कलियों के कोंफोकल जेड के ढेर के विभिन्न दृश्य प्रस्तुत करता है, और या तो propidium आयोडाइड (चित्रा 2, ए सी 5 और जी) या FM4-64 (चित्रा 2, ई 1-एफ) के साथ दाग एक स्पष्ट सेलुलर संकल्प प्रदान करते हैं। अधिकांश कोंफोकल सिस्टम ऐसे GFP या YFP के रूप में उत्सर्जन स्पेक्ट्रा गैर-अतिव्यापी या तो propidium आयोडाइड या FM4-64 (- 2F चित्रा 2 ए) के साथ एक साथ के साथ दो fluorophores की इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं। सबसे अच्छा कोंफोकल प्रणालियों भी ऐसे GFP और YFP, और dsRed और propidium आयोडाइड (चित्रा 2 जी) के रूप में ही नमूनों में आंशिक रूप से अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, के साथ कई fluorophores अलग करने के लिए सक्षम हैं।
समय-अंतराल प्रयोगों के तीन उदाहरण चित्रा में प्रस्तुत कर रहे हैं2 और दिखाने के फूलों की कलियों सामान्य रूप से विकसित करने के बाद बाह्यदल पृथक या तो एक लेजर पृथक प्रणाली के साथ प्रदर्शन किया गया था (चित्रा 2, सी 1-सी 5 और डी 1-D5) या एक पिन शिकंजा और एक धातु पिन के साथ मैन्युअल रूप से (चित्रा 2, ई 1-E2)। ध्यान दें कि फूल चित्र 2 में दिखाया कली, ई 1-E2 एक सुपरमैन-1 उत्परिवर्ती संयंत्र, जिसके कारण अंडप primordia कली के उभरते बाह्यदल primordia के मंच 7. लेजर पृथक पर कली के केंद्र में मनाया नहीं कर रहे हैं से है चित्रा 2 में दिखाया गया, सी 1-सी 5 एफएम, जो अभी भी चरण 5 (चित्रा 2, सी 5) पर imaged किया जा सकता है को कवर से उन्हें रोकता है। इसके विपरीत, चित्रा 2 में दिखाया गया कली के मामले में, डी 1-D5, लेजर पृथक केवल बाह्यदल विकास में देरी है, लेकिन बाह्यदल अंत में मंच 5 (चित्रा 2, D5 द्वारा एफएम के सबसे को कवर करने के बढ़ी
चित्र 2: लाइव फूलों की कलियों का कोंफोकल जेड के ढेर का विजुअलाइजेशन। ए और बी 2 पारदर्शिता विचार हैं; बी 1 और बी 4-जी अधिकतम तीव्रता अनुमानों कर रहे हैं; बी 3 एक ओर्थोगोनल टुकड़ा दृश्य है। (ए - E2) APETALA3 जीन (हरा) के लिए एक वीनस संवाददाता व्यक्त फूल; सेल दीवारों (, लाल, बी 4 के अलावा हरा) propidium आयोडाइड के साथ दाग रहे थे। (ए) पुष्पक्रम; संख्या पुष्प चरणों से संकेत मिलता है; चरण 4 में बाह्यदल और 5 फूल वीनस रिपोर्टर की प्रतिदीप्ति, जो आम तौर एफओ को फ़िल्टरएक अंगूठी आरएमएस। ध्यान दें कि कुछ फूलों की कलियों पुष्पक्रम की तुलना में झुका हुआ दिखाई देते हैं। (बी 1 - बी 4) एक चरण 5 कली का एक ही कोंफोकल जेड ढेर के चार अलग-अलग दृश्य: अधिकतम तीव्रता अनुमानों वीनस संकेत तीव्रता हरे रंग (बी 1) में पिक्सेल तीव्रता के साथ कोडित के साथ (बी 1 और बी 4) या आग रंग कोड के साथ (बी 4, रंग कोड पैनल के नीचे दिखाया गया है); पारदर्शिता दृश्य (बी 2) और orthogonal टुकड़ा दृश्य (बी 3, स्लाइस की XY, XZ और YZ उन्मुखीकरण पैनल में इंगित किया गया है)। (C1 - सी 5) 4 दिन मंच से 5 चरण 3 से एक व्यक्ति कली की समय-अंतराल; लेजर ablations (सफेद लक्षण के रूप में चिह्नित) दिन 1 पर प्रदर्शन किया और दिन 3 चरण 5. (डी 1 - D5) पर कली के केंद्र को कवर से बाह्यदल को रोकने के लिए पर्याप्त थे से एक व्यक्ति कली के 4 दिन समय-अंतराल मंचचरण 3 से 5; लेजर दिन 1, 2 और 3 पर प्रदर्शन ablations कली के केंद्र को कवर से बाह्यदल को रोकने के लिए पर्याप्त नहीं था। (ई 1 - E2) abaxial और adaxial बाह्यदल (ई 1) के मैनुअल हटाने के बाद अलग-अलग कली, और सभी बाह्यदल की (E2); सफेद तीर शेष बाह्यदल से संकेत मिलता है; सफेद तारक बाह्यदल को हटाने से उत्पन्न निशान से संकेत मिलता है। (एफ) चरण 7 apetala1-1 फूल एक DR5-3xVenusN7 संवाददाता व्यक्त 18 (हरा); प्लाज्मा झिल्ली FM4-64 (लाल) के साथ दाग रहे थे; नीले तीर पत्ती जैसी संरचनाएं कि बाह्यदल की जगह और फूल कली को कवर नहीं संकेत मिलता है। (G) Dornröschen की तरह 7 (हरा), सुपरमैन (लाल) के लिए एक वीनस रिपोर्टर के लिए एक फ्लोरोसेंट GFP संवाददाता व्यक्त स्टेज 4 कली और CLAVATA3 19 (सियान) के लिए एक dsRed संवाददाता; कोशिकाओंदीवारों propidium आयोडाइड (ग्रे) के साथ दाग रहे थे। घ: दिन; सेंट: चरण। स्केल सलाखों = 25 सुक्ष्ममापी; पैमाने सी 1 सी 5 में और डी 1-D5 में B1, B2 और बी 4 में समान है। यह आंकड़ा संदर्भ 14 से संशोधित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
यहाँ, हम एक कोंफोकल माइक्रोस्कोप और एक पानी में डुबकी लेंस के साथ लाइव, विकासशील Arabidopsis फूलों की कलियों की इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह या तो एक ईमानदार या उलटे माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है, यह आसान और तेज पूर्व उपयोग करने के लिए है। यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि विभिन्न कोंफोकल सिस्टम गति, संवेदनशीलता, और क्षमता अलग तरंग दैर्ध्य के लिए के मामले में काफी भिन्नता है लायक है। एक ही नमूनों में, सबसे अच्छा कोंफोकल सूक्ष्मदर्शी अब छवि कई अलग अलग चैनलों (चित्रा 2 जी जैसे GFP, YFP, dsRed और propidium आयोडाइड) करने के लिए अनुमति देते हैं। कुछ कोंफोकल सूक्ष्मदर्शी एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर, जो एक साथ कई fluorophores से प्रतिदीप्ति इकट्ठा करने और उन्हें बाद में अलग कर सकते हैं के साथ सुसज्जित हैं। एक नियमित रूप से डिटेक्टर का उपयोग करते समय, तथापि, लेज़रों और फिल्टर का एक सेट को उत्तेजित और विभिन्न fluorophores से प्रतिदीप्ति अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। कुछ fluorophores पूरी तरह से अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है (उदाहरण के लिए सीएफपी एकघ YFP), और साथ ही साथ imaged किया जा सकता है। अन्य fluorophores आंशिक रूप से अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (जैसे GFP और YFP) है, और आमतौर पर जो इमेजिंग समय बढ़ जाती है अलग से imaged किया जाना है, जरूरत है। करीब fluorophores इमेजिंग भी अक्सर सीमित प्रत्येक चैनल एक और चैनल में लीक से एक फ्लोरोफोरे से प्रतिदीप्ति को रोकने के लिए के लिए एकत्र किया जाता है कैसे स्पेक्ट्रम की बहुत आवश्यकता है। यह एकत्र संकेत है, जो लेजर शक्ति और लाभ में वृद्धि से मुआवजा दिया जा सकता है की तीव्रता का एक नुकसान का कारण बनता। हालांकि, लंबे समय तक इमेजिंग समय और वृद्धि की लेजर शक्ति ब्लीच और / या नमूना नुकसान हो सकता है। बढ़ी हुई लेजर शक्ति और / या लाभ भी पृष्ठभूमि शोर बढ़ सकता है। संकेत तीव्रता, संकल्प और प्रत्येक नमूने के लिए इमेजिंग समय का अनुकूलन एक परीक्षण और त्रुटि प्रक्रिया के माध्यम से किया, और स्थायी व्यापार गत शामिल है।
यह प्रोटोकॉल कैसे एक विच्छेदित शूट एपेक्स के किनारों पर विकसित फूलों की कलियों का लाइव कोंफोकल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए बताते हैं। यहतर्क दिया जा सकता है कि तथ्य यह है कि शूट एपेक्स संयंत्र के बाकी हिस्सों से जुड़ा नहीं है और एक मध्यम cytokinins सैम और फूल विकास को प्रभावित कर सकता युक्त में होती है। हालांकि, इस माध्यम विच्छेदित शूटिंग सुनिश्चित करने के लिए शिखर मेरिस्टेमों सामान्य plastochron पर नए फूलों की कलियों का उत्पादन है, और है कि इन फूलों की कलियों सामान्य रूप से 15 का विकास एक परीक्षण और त्रुटि प्रक्रिया के माध्यम से अनुभव डिजाइन किया गया था। इसी तरह, बाह्यदल विच्छेदन जीन अभिव्यक्ति पैटर्न या फूल के बाकी के विकास को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता। अन्य प्रोटोकॉल विस्तार सैम की लाइव कोंफोकल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए अभी भी संयंत्र के बाकी के साथ संलग्न (जैसे संदर्भ 11)। ऐसे प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और फूलों के विकास, खासकर जब साइटोकिनिन से संबंधित प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की इमेजिंग के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान करते हैं। वे कई नुकसान पेश तथापि: स्टेम elongates और ट्विस्ट, और फूलों की कलियों के उन्मुखीकरण परिवर्तन, एnd जबकि इमेजिंग एक शूट एपेक्स संयंत्र के बाकी से जुड़ी एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ अच्छी तरह से काम करता है, यह एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ ऐसा करने के लिए और अधिक जटिल है।
विसर्जन लेंस एक बेहतर संख्यात्मक एपर्चर (एनए) की तुलना में "सूखी" लेंस (यानी लेंस है कि हवा से नमूना से अलग होती है), और इसलिए नमूना है, जो महत्वपूर्ण है जब एक कोंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने का एक बेहतर संकल्प प्रदान करते हैं। एक पानी में डुबकी लेंस का प्रयोग इस प्रकार, जबकि इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान निर्जलित प्रक्रिया से शूट एपेक्स को रोकने, एक सूखी लेंस की तुलना में काफी बेहतर एनए प्रदान करता है। जबकि ग्लिसरीन और तेल लेंस पानी लेंस की तुलना में भी अधिक एनए है, वे एक coverslip, जो एक नमूना एक शूट एपेक्स, जो भी समय-अंतराल प्रयोगों के दौरान बढ़ रही रखता है के आकार के साथ बहुत अव्यावहारिक है के उपयोग की आवश्यकता। नमूनों की आकार को देखते हुए (पुष्प चरणों के आधार पर, ढेर के ऊपर 150 सुक्ष्ममापी मोटी हो सकता है), यह भी महत्वपूर्ण है कि एक लंबे समय तक काम दूरी के साथ एक लेंस का उपयोग करने के। हम आम तौर पर 1 के एक एनए और 1.7-2.5 मिमी काम कर रहे दूरी के साथ एक 20 या 40X लेंस का उपयोग करें।
कोंफोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर कोंफोकल डेटा कल्पना करने के लिए कई तरीके, तीन आयामी पुनर्निर्माण (चित्रा 2, बी 1, बी 2 और बी 4) और टुकड़ा देखा गया (चित्रा 2, बी 3) सहित प्रदान करता है। जबकि सबसे अधिक इस्तेमाल किया तीन आयामी विचारों कोंफोकल जेड के ढेर (चित्रा 2, बी 1 और बी 4), कुछ सॉफ्टवेयर की अधिकतम तीव्रता अनुमानों हैं (उदाहरण के लिए ज़ेन और Imaris) भी पारदर्शिता दृश्य पेश करते हैं कि के गहरे भागों से संकेत बाहर फिल्टर नमूना (चित्रा 2, बी 2) है, जो उपयोगी है जब जगह लेने की प्रक्रिया, या जीन में, एपिडर्मल परत व्यक्त को देखकर हो सकता है। संकेत तीव्रता या तो, एक ही रंग (चित्रा 2, बी 1) के साथ कोडित किया जा सकता है पिक्सेल बौद्धिक अत्याधुनिक का उपयोग करnsity, या एक रंग कोड (चित्रा 2, बी 4) का उपयोग कर।
लाइव कोंफोकल इमेजिंग न केवल फूल विकास में बहुमूल्य गुणात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, यह भी संभावित विकास जीव मात्रात्मक डेटा का खजाना के साथ प्रदान करता है। विभिन्न सॉफ्टवेयर (जैसे Imaris, फिजी, मंगल ग्रह एएलटी, MorphographX 15, 20, 21) नंबर या एक या कई पत्रकारों, या विभिन्न कोशिकाओं में एक पत्रकार की अभिव्यक्ति के स्तर व्यक्त कोशिकाओं की मात्रा का परिमाणन लिए अनुमति देता है। ऐसे सॉफ्टवेयर भी, स्वत: सेल विभाजन प्रदर्शन कोशिका वंश पर नज़र रखने और विकास यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह विभिन्न सॉफ्टवेयर समान उपकरण प्रदान करता है, लेकिन यह भी कई मायनों में अलग है। मंगल ग्रह एएलटी और MorphoGraphX Imaris एक के विपरीत, पौधों 15, 20, 21 के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए थेnd फिजी। MorphoGraphX केवल, विभाजन और एपिडर्मल परत के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जबकि Imaris और मंगल-एएलटी विभाजन और पूरे नमूना के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, मंगल ग्रह एएलटी तीन विभिन्न कोणों 15 से ही नमूना की पूर्व इमेजिंग की आवश्यकता होती है, और Imaris केवल एक ही ढेर की आवश्यकता है। मात्रात्मक जानकारी तक पहुंच फूल विकास की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है।
Disclosures
लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखक अपने समर्थन के लिए प्रो इलिअट M मेयेरोविट्ज़ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और के साथ तकनीकी मुद्दों को सुलझाने में उनकी मदद के लिए कैलटेक में जैविक इमेजिंग सुविधा में पांडुलिपि पर टिप्पणी है, साथ ही डार्टमाउथ कॉलेज और डॉ एंड्रेस कोलाजो पर ऐन लावनवे लाइव कोंफोकल इमेजिंग। नाथानीअल प्रूनेट के काम अमेरिका के राष्ट्रीय इलिअट M मेयेरोविट्ज़ को अनुदान R01 GM104244 के माध्यम से स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90X maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40X water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
References
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