Summary
immagini dal vivo confocale offre biologi con un potente strumento per studiare lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia confocale in diretta di sviluppare Arabidopsis fiori.
Abstract
Lo studio della crescita e dello sviluppo pianta è a lungo invocato tecniche sperimentali che utilizzano morti, tessuti fissati e prive di adeguata risoluzione cellulare. I recenti progressi nella microscopia confocale, in combinazione con lo sviluppo di numerosi fluorofori, hanno superato questi problemi e ha aperto la possibilità di studiare l'espressione di diversi geni contemporaneamente, con una buona risoluzione cellulare, in campioni dal vivo. vivo imaging confocale fornisce biologi vegetali con un potente strumento per studiare lo sviluppo, ed è stato ampiamente utilizzato per studiare la crescita delle radici e la formazione di organi laterali sui fianchi del meristema apicale. Tuttavia, non è stato ampiamente applicato allo studio dello sviluppo del fiore, in parte a causa di problemi che sono specifici per l'imaging fiori, come i sepali che crescono nel meristema fiore, e filtrare la fluorescenza da tessuti sottostanti. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per eseguire l'imaging confocale in diretta su Live, sviluppo araboidopsis boccioli, utilizzando sia un montante o un microscopio invertito.
Introduction
La maggior parte del corpo pianta forma post-embrionalmente da gruppi di cellule staminali situate in corrispondenza o in prossimità della punta - o meristemi apicali - dei germogli e le radici. Tutte le strutture fuori terra della pianta adulta derivano dal meristema apicale (SAM), che produce continuamente organi laterali sui fianchi: foglie durante la fase vegetativa, e meristemi fiori (FM) dopo esso transizioni di fase riproduttiva. FM a loro volta sviluppano in fiori. Mentre l'Arabidopsis SAM produce organi laterali uno alla volta, in una, modello a spirale iterativo, FM producono quattro tipi di organi floreali all'interno quattro spirali, in modo parzialmente sincrono, con più programmi di sviluppo dipanando simultaneamente. Le reti genetici alla base della specifica l'identità dei diversi organi fiorali sono stati parzialmente decifrato (per le recensioni, vedi riferimenti 1, 2), ma molti aspetti del fiore SVILUPPOnt, come il posizionamento degli organi fiorali e la definizione dei confini tra spire, rimangono poco compreso.
I primi studi genetici molecolari di sviluppo delle piante si affida tecniche come l'ibridazione in situ e reporter GUS per analizzare l'espressione genica. Mentre questi metodi hanno fornito una ricchezza di informazioni e notevolmente contribuito alla nostra comprensione della crescita delle piante e lo sviluppo del fiore, ci sono delle limitazioni importanti: mancano di buona risoluzione cellulare, non consentono la facile osservazione del pattern di espressione di geni multipli nello stesso campioni, e soprattutto, possono essere applicati solo a tessuti morti, fissi. I recenti progressi nella microscopia confocale hanno superato questi limiti, e di fornire biologi dello sviluppo con un potente strumento per indagare i processi sottostanti morfogenesi impianto. In particolare, la microscopia confocale permette l'osservazione dei tessuti vivi ed organi durante la loro formazione, che è critical per comprendere appieno un processo tipicamente dinamico come sviluppo.
Vivo imaging confocale è stato ampiamente utilizzato per analizzare la crescita aerea delle piante e la produzione di organi laterali dal SAM (ad esempio fa riferimento 3, 4, 5, 6), ma con l'eccezione di alcuni rapporti (es riferimenti 7, 8, 9, 10), esso non è stato ampiamente applicato allo studio dello sviluppo del fiore. Protocolli per l'imaging confocale in diretta del SAM sono disponibili (ad esempio, fa riferimento 11, 12), e forniscono una buona base per come rappresentare il via di sviluppo boccioli di fiori che circondano la SAM. Tuttavia, boccioli di fiori di imaging presenta sfide specifiche: per esempio,boccioli diventano rapidamente più grande della SAM, e allo stadio 4, sepali iniziano coprendo le fasi FM (come descritto nel riferimento 13), e regolazione della fluorescenza da tessuti sottostanti (Figura 2A). Qui, forniamo un protocollo dettagliato che spiega come eseguire l'imaging confocale in diretta sullo sviluppo di boccioli di fiori di Arabidopsis utilizzando un montante o un microscopio invertito e una lente d'acqua-immersione. Abbiamo precedentemente pubblicato questo protocollo di riferimento 14.
Protocol
1. Media e preparazione piatti
- Preparare dissezione piatti riempiendo scatole rotondo plastica (larghezza di circa 6 cm, 2 cm di profondità) a 0,5 cm con 2% agarosio.
- Preparare l'imaging piatti.
- Per un microscopio confocale verticale, riempire plastica rettangolare incernierato scatole (lunga circa 7 cm, largo 4,5 cm, 3 cm di profondità) a 0,5 cm con mezzo di imaging (vedere la sezione 1.3, "medio Imaging"; Figura 1F).
- Per un microscopio confocale invertito: riempire piccola scatola di Petri (largo circa 3,5 cm, 1 cm di profondità) esattamente fino all'orlo di mezzo di imaging (vedere la sezione 1.3, "medio Imaging"; la figura 1G).
- Preparare mezzo di imaging.
- Per l'imaging singolo punto, utilizzare 1% agarosio.
- Per gli esperimenti time-lapse, utilizzare mezzo di crescita apice (0,5x Murashige e Skoog miscela di sali basale senza vitamina, 1% saccarosio, 0,8% agarosio, pH 5,8 con idrossido di potassioe soluzione, integrata con vitamina [0,01% myo-inositolo, acido nicotinico 0,0001%, 0,0001% piridossina cloridrato, 0,001% cloridrato di tiamina, 0,0002% glicina] e citochinine [500 nM N6-benziladenina]) 15.
2. crescita delle piante
- Seminare sterilizzati su lastre MS (0,5 o miscela di sali basale 1x Murashige e Skoog senza vitamina, 0,8% agar, pH 5,8 con soluzione di idrossido di potassio) con selezione appropriata. piastre posto a giorno lungo (16 ore di luce) o il giorno continuo, 16-22 ° C Condizioni per due settimane.
- piantine trapianto nel suolo con spaziatura sufficiente per consentire lo sviluppo robusto. piante luogo a giorno corto, 16-22 ° C Condizioni per tre settimane.
NOTA: coltivazione di piante in giornata o in condizioni di giorno in continuo direttamente dopo il trapianto risultati in fioritura precoce e infiorescenze che sono meno vigorosi, e molto più difficile da sezionare. Allo stesso modo, lasciando piante in breve Condit giornoioni per più di tre settimane si traduce in giorno la fioritura di lunghezza indipendente e infiorescenze che sono meno vigorosi. - piante Trasferire giorno lungo (16 ore di luce) o il giorno continuo, 16-22 ° C Condizioni fino a quando non fiore. apici dei germogli sono più facili da sezionare quando l'infiorescenza è lungo 2-10 cm.
3. La dissezione della Ripresa Apex
- Opzionale: Usando una bella pietra affilatura e una goccia di olio leggero, affinare pinze con lo stereomicroscopio per renderli a lama, non puntiforme.
- Rimuovere silique, boccioli anziani e infiorescenze secondari dalla infiorescenza primaria spingendo la base dei peduncoli con la pinza fino alla rottura. Rimuovere il maggior numero possibile di fiori senza ingrandimento (Figura 1, confrontare A e B).
- Utilizzando pinze, perforare un foro verticale nel agarosio di un piatto dissezione, tagliare gli ultimi 0,5 cm delle infiorescenze e bastone verticalmente nel agarosio. Il restoboccioli devono essere al di sopra della superficie agarosio.
- Riempire il piatto di imaging con acqua sterile deionizzata in modo che l'apice ripresa è completamente immerso. Posizionare il piatto dissezione con lo stereomicroscopio, ed eliminare l'aria intrappolata attorno all'apice ripresa creando getti d'acqua con una pipetta 1000 microlitri (Figura 1, confronta C e D).
- Con lo stereomicroscopio, utilizzare le pinze per rimuovere boccioli che non sono per essere ripreso premendo sulla base del peduncolo o all'inizio della germoglio fino alla rottura peduncolo (Figura 1E). È importante che i peduncoli rompono nettamente all'incrocio con lo stelo, come peduncoli avanzi ostacolano la rimozione dei giovani boccioli.
- Se solo immagini boccioli fase 5 e minore (figura 2a), rimuovere l'acqua prima di sezionare fase 6-8 boccioli. Se boccioli di fiori di imaging fase 5 e più anziani, procedere alla ablazione sepalo (vedere paragrafo 5.1). In caso contrario, proCEED al punto 3.7.
- Utilizzando pinze, perforare un foro verticale nel mezzo di un piatto di imaging, e bastone all'apice montante sezionato nel mezzo, in modo che solo il germoglio apicale meristema e circostanti boccioli sono al di sopra della superficie del terreno. A seconda del germoglio di fiore (s) sono da acquisire, potrebbe essere necessario inclinare leggermente il campione, come boccioli non sono necessariamente orientati esattamente come lo stelo (Figura 2A).
- Procedere alla colorazione del campione, se necessario. In caso contrario la colorazione e / o il campione di imaging subito, aggiungere l'acqua e chiudere il piatto di imaging per prevenire la disidratazione. Se si utilizza un microscopio invertito, posizionare il piatto di imaging in una scatola di plastica trasparente e chiuderlo.
Figura 1: Preparazione dei apici dei germogli per l'imaging confocale vivo. (A - E) dissezione di unsparare apice per l'imaging. Infiorescenza prima (A) e dopo (B) rimozione di silique e fiori anziani. (C - D) sparare apice immersa in acqua nel piatto dissezione, con una bolla d'aria intrappolata sulla punta (C) e dopo la rimozione della bolla d'aria (D). (E) sparare apice nel piatto dissezione, dopo la dissezione di boccioli più vecchi di fase 5. (F - G) Veduta di apici dei germogli nel piatto di imaging, sulla scena di un montante (F) e invertita (G) microscopio confocale . A (F), una lente acqua immersione 40X è posizionata sopra uno degli apici, con la punta della lente immerso in acqua. A (G), l'apice ripresa viene posizionato capovolto sopra dell'obiettivo acqua-immersione 40X, con una colonna d'acqua che collega il mezzo di imaging alla punta della lente. Il pannello più piccolo (F) mostra un higla vista ingrandimento dell'area nel rettangolo rosso, con un apice ripresa inserito nel mezzo di imaging; linee rosse e blu indicano la superficie del terreno e dell'acqua, rispettivamente. (H - I) Esempi di dispositivi su misura che permettono di aggiungere più acqua alla punta della lente acqua immersione: un manicotto di gomma siliconica fatto da un raccordo candela (H), ed un manicotto di fortuna fatta dal dito di un guanto in lattice senza polvere (G). Barre di scala = 0,5 cm in (A) e (B), 0,1 cm di (C) e (D), e 100 um (E). Questa figura è stato pubblicato inizialmente riferimento 14. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
4. colorazione
NOTA: Le pareti cellulari o membrane plasmatiche possono essere colorate con ioduro di propidio o FM4-64, rispettivamente, per ottenere la risoluzione cellularedurante l'imaging. In alternativa, le linee giornalista con proteine fluorescenti tag alla membrana plasmatica possono essere utilizzati 6, 16.
- Rimuovere l'acqua dal piatto di imaging, e garantire la superficie del terreno è asciutto per evitare di diluire il colorante.
- Con lo stereomicroscopio, applicare 20 a 30 microlitri di 1 mg / mL soluzione ioduro di propidio, o 80 mg / ml soluzione FM4-64 all'apice sezionato con una pipetta 10 microlitri. Assicurarsi che tutto il campione è coperto in colorante per garantire una colorazione omogenea.
- Macchia per 2 minuti se si utilizza ioduro di propidio, o 20 minuti se si utilizza FM4-64.
- Risciacquare due volte con acqua sterile deionizzata.
5. Sepal Ablazione
NOTA: Nella fase 4, primordi sepal iniziano copre la FM. Man mano che crescono, filtrano la fluorescenza dal tessuto sottostante, e ostacolano il processo di imaging. Sepali possono sia essere rimossi manualmente mediante un perno metallico mounted su un perno-morsa, o impedito di crescere utilizzando ablazione laser emergente primordia sepalo. In alternativa, è possibile, in alcuni casi da usare mutanti come apetala1-1, in cui sepali sono mancanti o sostituiti da organi simili a foglie che non coprono l'FM mentre la parte centrale del fiore si sviluppa normalmente (Figura 2F) 17.
- Ablazione sepalo su boccioli fase 5 e più vecchio con uno spillo-morsa possesso di un ago metallico rettilineo (Figura 2, E1-E2)
- Posizionare il piatto dissezione con l'apice sezionato con lo stereomicroscopio, e impostare l'ingrandimento al massimo. Immergere l'apice riprese in acqua sterile, deionizzata, o in alternativa, una pipetta 1000 microlitri per applicare acqua fino all'apice ripresa regolarmente mentre sezionare sepali.
- Con il perno-morsa, posizionare il cursore sulla cima sepalo abaxial, tangenzialmente rispetto all'apice sparare. spingere delicatamente sepalo lontano dall'apice ripresa finché non si staccadal bocciolo.
- Procedere allo stesso modo con il sepal adaxial, ma spingere il sepal verso l'apice riprese.
- Procedere in maniera simile con sepali laterali, ma posizionare il perno radialmente rispetto all'apice riprese, e spingere i sepali di lato, lontano dal germoglio di fiore.
- Immergere l'apice riprese in acqua sterile deionizzata per pochi minuti per prevenire la disidratazione.
- Ablazione laser di primordi sepalo nella fase 3-4 (Figura 2, C5-D5)
- Porre la capsula di imaging con il macchiato, apice sezionato su palco microscopio confocale. Individuare e concentrarsi sul vertice come preparandosi all'immagine (vedere la sezione 6, "setup di imaging").
- Utilizzando il software di sistema di ablazione laser, definiscono la zona di ablazione, che corrisponde alla cresta e punta del primordi sepalo emergente prima di iniziare copre il meristema fiore (tipicamente, allo stadio 3 per sepali abaxial e adaxial, e in fase tardiva 3 / inizio fase 4 per se lateralePals).
- Regolare la potenza del laser e tempo di permanenza di parametri appropriati per l'ablazione abbastanza cellule senza infliggere troppi danni ai tessuti sottostanti. In genere, a seconda del sistema di ablazione laser utilizzato, parametri corretti inizialmente devono essere identificati attraverso un processo di tentativi ed errori per assicurare che abbastanza cellule vengono rimosse per evitare che le sepali a crescere in seguito sul FM, senza influenzare il resto del fiore germoglio. Utilizzando la potenza del laser troppo e dimora risultati in tempo di danni al centro del fiore, che ne alterino la crescita e / o la sopravvivenza. Una volta identificati i parametri corretti, possono essere riutilizzati per esperimenti successivi.
NOTA: Se l'ablazione iniziale risulta insufficiente, è possibile procedere ad una seconda ablazione nei giorni seguenti (figura 2, C4 e D2).
6. Imposta Imaging
- Utilizzare un microscopio verticale.
NOTA: Quando l'imaging con un microscopio verticale, diversi apici possono essere collocati nello stesso piatto di imaging. Tuttavia, se il processo di imaging dura più di un'ora, propidio ioduro tende ad essere diluito, e alcuni campioni potrebbe essere necessario ri-colorazione prima di imaging. - Porre la capsula di imaging sul palco microscopio (Figura 1F). Abbassare la lente acqua-immersione e sollevare la fase in modo che la punta della lente immerge in acqua. Procedere con cautela per non schiacciare apici sezionati o immergere la lente nel mezzo di imaging.
- Se una bolla d'aria è intrappolato sulla punta della lente, rendere getti d'acqua con una pipetta 1000 microlitri per rimuoverlo.
- Sotto illuminazione epifluorescenza, posizionare uno dei vertici sezionati nel campo lente utilizzando l'aria XYtroller. Guardare attraverso gli oculari e mettere a fuoco il campione utilizzando il controller Z. Procedere con cautela al fine di non schiacciare il campione.
- Utilizzando il software microscopio confocale, lo zoom sul fiore gemma da acquisire, e procedere di imaging vostro campione.
- Usando una pipetta microlitri 1000, mettere una goccia di sterili, acqua deionizzata sulla punta della lente.
- Tenere il piatto di imaging capovolto, e con una pipetta 1000 microlitri, aggiungere una goccia di acqua sterile deionizzata all'apice sezionato.
- Porre la capsula di imaging capovolta sul palco microscopio (Figura 1G). Procedere con cautela per non schiacciare il campione.
- Sotto illuminazione epifluorescenza, posizionare l'apice sezionato sulla punta della lente utilizzando il controller XY. Con il controller Z, attenzione abbassare la fase fino a che il campione raggiunge la goccia d'acqua sulla punta della lente. Una colonna d'acqua dovrebbe formare between la punta della lente e il mezzo.
- Se la colonna d'acqua non forma, aggiungere con cautela una goccia d'acqua al campione con una pipetta 1000 microlitri. Aggiungere maniche improvvisati alla lente al fine di aggiungere più acqua alla sua punta, che facilita la creazione e la manutenzione della colonna d'acqua (Figura 1H e 1I).
- Sotto illuminazione epifluorescenza, guardare attraverso gli oculari e mettere a fuoco il campione utilizzando il controller Z. Procedere con cautela per non schiacciare il campione.
- Utilizzando il software microscopio confocale, lo zoom sul fiore gemma da acquisire, e procedere alla imaging del campione.
NOTA: Mentre le cellule a sviping organi fiorali possono dividere più velocemente, le cellule in divisione meristema floreale una o due volte ogni due giorni, e linee cellulari sono facili da rintracciare, con punti di tempo ogni 24 h. Tuttavia, se necessario, è possibile l'immagine dei campioni ogni sei ore.
7. Considerazioni sui parametri di imaging
NOTA: Come impostare i parametri di imaging dipende molto dal sistema confocale utilizzato. Di seguito sono riportati i suggerimenti per alcuni di questi parametri che possono essere utilizzati con qualsiasi microscopio confocale. Per ulteriori considerazioni sui parametri di imaging, vedere la sezione di discussione e riferimento 14.
- Per la risoluzione XY: utilizzare 1.024 x 1.024 per una buona risoluzione cellulare. In alternativa, utilizzare 512 x 512 per ridurre il tempo di imaging, a scapito della risoluzione.
- Per la risoluzione Z: impostare il passo di integrazione a 0,5-1,5 um. Abbassando il passo dimensione aumenta la risoluzione Z, ma anche il tempo di imaging.
8. La visualizzazione di dati confocale
- Girare ancora immagini dei momenti di sviluppo del fiore in un film.
- Aprire le immagini fisse (in formato jpeg o tif) nel software (ad esempio, Figi).
- Vai a Immagine> Stack> Immagini Stack. Le immagini aperte vengono raggruppate in una pila.
- Se l'ordine delle immagini nello stack non corrisponde l'ordine cronologico, usare il plugin Stack Sorter (Plugin> Stack> Stack sorter) per riordinarli.
- Per attivare la pila in un film, andare su File> Salva con nome> AVI.
Representative Results
La figura 2 illustra varie viste confocale Z-pile di boccioli Arabidopsis fiori vivi esprimenti differenti geni reporter fluorescenti, e trattata con uno ioduro di propidio (Figura 2, A-C5 e G) o FM4-64 (figura 2, E1-F) fornire una chiara risoluzione cellulare. Molti sistemi confocali consentono l'imaging del due fluorofori con senza sovrapposizione spettri di emissione come GFP o YFP insieme sia con ioduro di propidio o FM4-64 (Figura 2A - 2F). I migliori sistemi confocali sono anche in grado di separare più fluorofori con gli spettri di emissione parzialmente sovrapposti negli stessi campioni, come GFP e YFP e DsRed e ioduro di propidio (figura 2G).
Tre esempi di esperimenti time-lapse sono presentati nella figura2 e mostrano boccioli svilupparsi normalmente dopo l'ablazione sepalo è stata eseguita sia con un sistema di ablazione laser (Figura 2, C1-C5 e D1-D5) o manualmente con un perno-morsa ed un perno metallico (Figura 2, E1-E2). Si noti che il germoglio di fiore mostrato nella Figura 2, E1-E2 è da una pianta mutante superman-1, che è il motivo primordia carpello non si osservano al centro del bocciolo nella fase 7. ablazione laser primordi sepal emergente del germoglio di fiore mostrato nella Figura 2, C1-C5 impedisce loro di coprire la FM, che può ancora essere ripreso nella fase 5 (Figura 2, C5). Al contrario, nel caso del germoglio di fiore mostrato nella Figura 2, D1-D5, ablazione laser soltanto ritardato crescita sepalo, ma sepali cresciuto fino a coprire la maggior parte della FM fase 5 (Figura 2, D5
Figura 2: Visualizzazione confocale Z-pile di boccioli vivi. A e B2 sono viste di trasparenza; B1 e B4-G sono proiezioni di massima intensità; B3 è una vista in sezione ortogonale. (A - E2) fiori che esprimono un reporter di Venere per il gene APETALA3 (verde); pareti cellulari sono state colorate con ioduro di propidio (rosso, eccetto B4, verde). (A) Infiorescenza; numeri indicano fasi floreali; sepali in fase 4 e 5 fiori filtrano la fluorescenza del reporter Venere, che normalmente forms un anello. Si noti che alcuni boccioli di fiori appaiono inclinate rispetto al infiorescenza. (B1 - B4) Quattro differenti viste dello stesso confocale Z-stack di un germoglio fase 5 fiore: proiezioni intensità massima (B1 e B4) con intensità di segnale Venere codificato con intensità di pixel nel colore verde (B1) o con il codice colore fuoco (B4; codice colore viene mostrato nella parte inferiore del pannello); guarda la trasparenza (B2) e vista slice ortogonale (B3, l'orientamento XY, XZ e YZ delle sezioni è indicato nel pannello). (C1 - C5) 4 giorni time-lapse di un germoglio di fiore individuo dal livello 3 al livello 5; ablazione laser (contrassegnate come caratteri bianchi) il giorno 1 e il giorno 3 erano sufficienti ad impedire sepali di coprire il centro del germoglio di fiore nella fase 5. (D1 - D5) 4 giorni time-lapse di un germoglio di fiore individuo da palcoscenico3 al livello 5; ablazione laser eseguite il giorno 1, 2 e 3 erano sufficienti per impedire sepali di coprire centro del germoglio di fiore. (E1 - E2) Individuale fiore gemma dopo rimozione manuale del abaxial e sepali adaxial (E1) e di ogni sepali (E2); frecce bianche indicano sepali rimanenti; asterischi bianche indicano cicatrici derivanti dalla rimozione dei sepali. (F) fase 7 fiore apetala1-1 esprimere un reporter DR5-3xVenusN7 18 (verde); membrane plasmatiche sono state colorate con FM4-64 (rosso); frecce blu indicano le strutture simili a foglie che sostituiscono sepali e non coprono il bocciolo. (G) Fase 4 germoglio di fiore esprimono un reporter GFP fluorescente per Dornroschen-SIMILE 7 (verde), un reporter Venus SUPERMAN (rosso) e un reporter DsRed per CLAVATA3 19 (ciano); cellulele pareti sono state colorate con ioduro di propidio (grigio). d: giorno; st: stage. Barre di scala = 25 um; scala è identica a B1, B2 e B4, in C1-C5 e D1-D5. Questo dato è stato modificato dal riferimento 14. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Qui, forniamo un protocollo per l'imaging, in via di sviluppo boccioli di fiori dal vivo di Arabidopsis con un microscopio confocale e una lente d'acqua-immersione. Anche se questo può essere fatto sia con un montante o un microscopio invertito, è più facile e più veloce da usare al primo. È anche interessante notare che diversi sistemi confocale variano notevolmente in termini di velocità, sensibilità e capacità di separare lunghezze d'onda. I migliori microscopi confocali consentono ora di immagine diversi canali (per esempio GFP, YFP, DsRed e propidio ioduro; figura 2G) nei medesimi campioni. Alcuni microscopi confocali sono dotati di un rivelatore spettrale, che consenta di raccogliere la fluorescenza da diversi fluorocromi contemporaneamente e separarli successivamente. Quando si utilizza un rilevatore normale, tuttavia, una serie di laser e filtri deve essere utilizzato per eccitare e separare la fluorescenza da differenti fluorofori. Alcuni fluorofori sono completamente distinti spettri di emissione (es PCP und YFP), e può essere ripreso contemporaneamente. Altri fluorofori hanno spettri di emissione parzialmente sovrapposti (es GFP e YFP), e di solito devono essere ripreso separatamente, il che aumenta il tempo di imaging. Imaging chiudi fluorofori anche spesso richiede limitare la quantità di spettro viene raccolto per ciascun canale per impedire fluorescenza da un fluoroforo fuoriuscita in un altro canale. Ciò provoca una perdita di intensità del segnale raccolta, che può essere compensata da un aumento della potenza del laser e guadagno. Tuttavia, il tempo di imaging prolungato e una maggiore potenza laser possono candeggina e / o danneggiare il campione. Aumento della potenza del laser e / o aumento può anche aumentare il rumore di fondo. Ottimizzazione di intensità del segnale, la risoluzione e il tempo di imaging per ogni campione avviene attraverso un processo di tentativi ed errori, e coinvolge compromessi permanenti.
Questo protocollo spiega come eseguire l'imaging confocale in diretta di gemme a fiore in via di sviluppo sui fianchi di un apice germoglio sezionato. essopuò essere sostenuto che il fatto che l'apice riprese non è collegata al resto della pianta e cresce in un mezzo contenente citochinine possono incidere SAM e sviluppo del fiore. Tuttavia, questo mezzo è stato progettato empiricamente attraverso un processo di tentativi ed errori per assicurare le riprese sezionato meristemi apicali produrre nuovi boccioli di fiori al plastochron normale, e che questi boccioli di fiori si sviluppano normalmente 15. Allo stesso modo, la dissezione sepalo non sembra influenzare pattern di espressione genica o lo sviluppo del resto del fiore. Altri protocolli dettaglio come eseguire confocale vivo della SAM ancora attaccate al resto dell'impianto (ad esempio riferimento 11). Tali protocolli potrebbero essere adattati a, e offrono una valida alternativa per l'imaging sviluppare fiori, soprattutto quando si studiano processi citochinine legati. Essi presentano tuttavia diversi inconvenienti: si allunga staminali e torsioni, e cambia l'orientamento dei boccioli; unnd mentre l'imaging di un apice germoglio attaccato al resto della pianta funziona bene con un microscopio verticale, è molto più complicata di farlo con un microscopio invertito.
Lenti immersione hanno una migliore apertura numerica (NA) di lenti "a secco" (cioè lenti che sono separate dal campione mediante aria), e quindi fornire una risoluzione più fine del campione, che è fondamentale quando si usa un microscopio confocale. Utilizzando un obiettivo acqua immersione fornisce quindi una migliore NA di un obiettivo asciutto, evitando l'apice sparare da disidratazione durante il processo di imaging. Mentre glicerina, lenti olio hanno una ancora maggiore NA di lenti d'acqua, che richiedono l'uso di un vetrino, che è molto poco pratico con un campione delle dimensioni di un apice germoglio, che mantiene anche crescere durante gli esperimenti time-lapse. Date le dimensioni dei campioni (a seconda delle fasi floreali, pile possono essere più di 150 micron di spessore), è anche importante utilizzare un obiettivo con una lunga distanza di lavoro. Usiamo tipicamente una lente 20 o 40X con una NA di 1 e una distanza di lavoro di 1.7-2.5 mm.
Software microscopio confocale offre diversi modi per visualizzare i dati confocale, tra ricostruzioni tridimensionali (Figura 2, B1, B2 e B4) e viste fetta (Figura 2, B3). Mentre i più comunemente usati viste tridimensionali sono proiezioni di massima intensità di Z-stack confocale (Figura 2, B1 e B4), alcuni software (es ZEN e Imaris) offrono anche una vista trasparenza che filtra il segnale dalle parti più profonde della il campione (Figura 2, B2), che può essere utile quando si esaminano i processi che avvengono, o geni espressi in, strato epidermico. Intensità del segnale può essere sia codificato con un singolo colore (Figura 2, B1), utilizzando pixel intensity, oppure utilizzando un codice colore (Figura 2, B4).
immagini dal vivo confocale offre non solo preziose intuizioni qualitativi in sviluppo del fiore, ma anche potenzialmente fornisce biologi dello sviluppo con una ricchezza di dati quantitativi. Diversi software (es Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permette di quantificare il numero o il volume di cellule che esprimono uno o più reporter, o il livello di espressione di un reporter in celle diverse. Tale software può essere utilizzato anche per eseguire la segmentazione delle cellule automatica, tracciare linee cellulari e quantificare la crescita. Questo software diverso offre strumenti simili, ma si differenzia anche in molti modi. MARS-ALT e MorphoGraphX stati progettati specificamente per piante 15, 20, 21, a differenza di un ImarisND Fiji. MorphoGraphX consente solo per la segmentazione e l'analisi dello strato epidermico, mentre Imaris e MARS-ALT consentono la segmentazione e l'analisi dell'intero campione. Tuttavia, MARS-ALT richiede la preventiva immagini dello stesso campione da tre diverse angolazioni 15, e Imaris richiede solo una singola pila. L'accesso a informazioni quantitative è fondamentale per la nostra comprensione dello sviluppo del fiore.
Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare.
Acknowledgments
L'autore desidera ringraziare il Prof. Elliot M. Meyerowitz per il suo sostegno, e commenti sul manoscritto, così come Ann Lavanway al Dartmouth College e il Dr. Andres Collazo alla struttura di imaging biologico al Caltech per il loro aiuto nella risoluzione di problemi tecnici con il confocale vivo. Il lavoro di Nathanaël Prunet è sostenuto dal National Institutes of Health di Grant attraverso R01 GM104244 a Elliot M. Meyerowitz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90X maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40X water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
References
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