共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

Summary

ライブ共焦点イメージングは​​、開発を研究するための強力なツールと生物学者を提供します。ここでは、 シロイヌナズナの花の開発のライブ共焦点イメージングのための詳細なプロトコルを提示します。

Abstract

植物の成長と発展の研究は長い間死んで、固定組織を使用して、適切な細胞解像度を欠く実験技術に頼っています。数多くの蛍光体の開発と組み合わせた共焦点顕微鏡の最近の進歩は、これらの問題を克服し、ライブのサンプルで、良い細胞の解像度で、同時にいくつかの遺伝子の発現を研究する可能性を開きました。ライブ共焦点イメージングは​​、開発を研究するための強力なツールで植物生物学者を提供し、広く根の成長と茎頂分裂組織の側面に横方向の臓器の形成を研究するために使用されてきました。しかし、それは広くにより、このような花の分裂組織と共に成長がく片などの花を、イメージングに固有の課題に一部、花の開発の研究に適用され、そして下の組織からの蛍光をフィルタリングされていません。ここでは、アラブの開発、ライブでライブ共焦点イメージングを実行するための詳細なプロトコルを提示します直立または倒立顕微鏡のいずれかを使用して、花芽をidopsis。

Introduction

または、頂端分裂組織 - - 芽や根の植物体の大部分は、ステム・チップで、または近くに位置する細胞のグループからポスト胎生形成しています。大人の植物のすべての地上構造物は、継続的にその側面に横方向の臓器を作り出す茎頂分裂組織（SAM）、から派生：栄養段階の間、葉、花の分裂組織（FMS）、それは生殖相に遷移した後。順番にFMSが花へと発展します。シロイヌナズナSAMは、一度に横臓器いずれかを生成しながら、繰り返し、螺旋パターンで、FMSが同時に解明複数発達プログラムと、部分的に同期して4つの渦巻き内の花器官の4種類の生成します。異なった花器官のアイデンティティの仕様の基礎となる遺伝子ネットワークは、部分的に花のdevelopmeのが、多くの側面（レビューのために、参考文献^1、2を参照）が解読されていますNT、花器官の位置と渦巻きの間の境界の定義など、よくわかっていないまま。

植物の開発の初期の分子遺伝学的研究は、主に遺伝子発現を解析するために、このようなin situハイブリダイゼーションおよびGUSの記者のように 、技術に依存していました。これらのメソッドは、豊富な情報を提供し、大幅に植物の成長と花の開発の我々の理解に貢献してきたが、重要な制限があります：彼らは良い携帯解像度が不足している、同じ内の複数の遺伝子の発現パターンを簡単に観察することができません。サンプルは、そして重要なのは、唯一の死者、固定組織に適用することができます。共焦点顕微鏡の最近の進歩は、これらの制限を克服し、植物の形態形成の基礎をなす過程を調査するための強力なツールと発達生物学者を提供しています。具体的には、共焦点顕微鏡は、Cであり、それらの形成、全体生組織および器官の観察を可能にします完全な開発などの典型動的なプロセスを理解することがritical。

ライブ共焦点イメージングは広く^、（ 例えば参考文献^7、8（ 例えば ^、3参照^4、5、6）が、いくつかの報告を除き、SAMによる植物の空中成長と横方向の臓器の生産を分析するために使用されてきました^9、10）、それが広く花の開発の研究に適用されていません。 SAMのライブ共焦点イメージングのためのプロトコルは^{（11、12を}参照するなど ）が利用可能であり、どのようにイメージSAMを囲む開発花芽をするための優れた基盤を提供します。しかし、イメージング花芽具体的な課題を提示します。例えば、花芽を迅速SAMよりも大きくなり、ステージ4で、萼片は、（参照¹³に記載のように段階）FMを覆う起動し、下にある組織（ 図2A）からの蛍光を調光。ここでは、直立または倒立顕微鏡と水浸漬レンズのいずれかを使用して、シロイヌナズナの花のつぼみの開発にライブ共焦点イメージングを実行する方法を説明する詳細なプロトコルを提供します。我々は以前、参照¹⁴で、このプロトコルを発表しました。

Protocol

1.メディアと料理の準備

1. 2％アガロース0.5センチメートル（深さ2cm、約6センチ幅）丸いプラスチック製の箱を充填して解剖皿を準備します。
2. イメージングの料理を準備します。
   1. 直立共焦点顕微鏡のために、長方形のプラスチックは、イメージング媒体0.5センチメートル（3センチメートル深い4.5センチ幅、約7センチ）ボックスヒンジ埋める（セクション1.3を参照して、「イメージング媒体」; 図1F）。
   2. 倒立共焦点顕微鏡用：（セクション1.3、「イメージング媒体」を参照; 図1G）イメージング媒体と鍔に正確に（1センチメートル深い、約3.5センチ幅）小さなペトリ皿を埋めます。
3. イメージング媒体を準備します。
   1. シングルポイントイメージングのために、1％アガロースを使用します。
   2. 時間経過実験のために、ビタミンなし（0.5Xムラシゲ及びスクーグ基礎塩混合頂点増殖培地を使用して、1％スクロース、0.8％アガロース、カリウムhydroxidでpH 5.8ビタミンを補充したE溶液[0.01％ミオ-イノシトール、0.0001％ニコチン酸、0.0001％の塩酸ピリドキシン、0.001％チアミン塩酸塩、0.0002％グリシン]とサイトカイニン[500nMのN6-ベンジル^]）15。

2.植物の成長

1. 適切な選択とMSプレート（ビタミン無し0.5または1xムラシゲ・スクーグ基礎塩混合物を、0.8％寒天、水酸化カリウム溶液でpH 5.8）で滅菌した種子をまきます。長い一日（16時間光）または連続日に場所プレート、2週間16〜22℃の条件。
2. 堅牢な開発を可能にするのに十分な間隔で土壌への移植苗。短日に入れ工場、3週間16-22°Cの条件。
   注：直接、早期開花とあまり活発、および解剖がはるかに困難です花序で結果を移植した後、長い一日または連続日の条件で植物を育てます。同様に、短日コンディットの下で植物を残します3週間以上のためのイオンは一日の長さに依存しない開花とあまり活発です花序になります。
3. 長い一日（16時間光）または連続日に転送する植物、それらの花まで16-22℃の条件。花序2-10センチのとき茎頂を解剖するのが最も簡単です。

茎頂の3解剖

1. オプション：細かい研ぎ石と軽油のドロップを使用して、点状ではない、彼らはブレード状にするために実体顕微鏡下に鉗子を研ぎます。
2. 彼らは壊れるまで、ピンセットで花柄のベースを押すことで、主花序からの長角果、古い花のつぼみと二次花序を削除します。倍率ことなく、できるだけ多くの花を削除する（ 図1、AとBを比較）。
3. 鉗子、解剖皿のアガロースでピアス縦穴を使用して、花序の最後の0.5cmに切断し、アガロースに垂直に固執。残り花芽は、アガロース表面上でなければなりません。
4. 茎頂が完全に浸漬されるように、滅菌脱イオン水で撮像皿を埋めます。 （CとDを比較し 、 図1）実体顕微鏡下で解剖皿を置き、1,000μLピペットで水ジェットを作成することによって、茎頂の周りに閉じ込められた空気を除去します。
5. 実体顕微鏡下で、柄の切断（ 図1E）まで、柄の基部又は芽の上に押すことによって結像されるべきではなく、花の芽を除去するために鉗子を使用します。残り花柄が若い花芽の除去を妨げるよう花梗は、ステムとの接合部できれいに破ることが重要です。
6. 撮像のみ花芽ステージ5と若い（ 図2A）は 、ステージ6~8の花蕾を切開する前に水を除去した場合。イメージング花芽ステージ5と古いが、がく片の切除に進んでいる場合（セクション5.1を参照してください）。それ以外の場合は、プロ3.7段階にCeedで。
7. 鉗子を用いて、撮像皿の中に垂直穴を貫通し、培地中の解剖頂点直立スティックのみシュート頂端分裂組織ように花芽を取り囲む媒体の表面上にあります。花芽は必ずしも正確幹（ 図2A）のように配向されていないとして結像されるべき花蕾（単数または複数）に応じて、わずかに試料を傾斜させる必要があるかもしれません。
8. 必要に応じてサンプルを染色に進みます。染色および/またはすぐにサンプルを撮影していない場合は、水を追加し、脱水症状を防ぐために、イメージング皿を閉じます。倒立顕微鏡を使用している場合、透明なプラスチックボックスに撮像皿を置き、それを閉じます。

図1：ライブ共焦点イメージングのための茎頂の調製。 （A - E）の解剖イメージングのための頂点を撃ちます。花序（A）の前と長角果や古い花の（B）を除去した後。 （C - D）茎頂は、先端部（C）に捕捉された気泡を有する、解剖皿に水に浸漬し、気泡（D）を除去した後。 （G）（F）直立および倒立共焦点顕微鏡のステージ上で、イメージング皿で茎頂のビュー- （E）はステージ5（G F）よりも古い花芽の解剖の後、解剖皿に頂点を撃ちます。 （F）において、40X水浸漬レンズを水に浸漬レンズの先端部と、頂点の上方に配置されています。 （G）において、茎頂がレンズの先端に画像形成媒体を接続水柱で、逆さま40X水浸漬レンズ上に配置されます。 （F）が小さいパネルは、HIGを示します画像形成媒体に挿入茎頂を持つ赤い長方形エリア、彼女の拡大図です。赤と青の線は、それぞれ、媒体及び水の表面を示します。 （H - I）水浸漬レンズの先端でより多くの水を添加可能カスタムメイドのデバイスの例：の指から製造されたスパークプラグブーツ（H）からなるシリコンゴムスリーブ、及び仮設スリーブpowderlessラテックス手袋（G）。スケールバー= 0.5（A）でCMと（B）、（C）および（D）0.1センチメートル、及び（E）で100μmです。この図は、最初の参照¹⁴に掲載されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

4.染色

注：細胞壁やプラズマ膜は、それぞれ、ヨウ化プロピジウムまたはFM4-64で染色することができ、細胞の解像度を達成するために撮影時。代替的に、原形質膜にタグ付けされた蛍光タンパク質とレポーター株は^6、16を使用することができます。

1. 撮像皿から水を除去し、媒体の表面に染料を希釈回避するために乾燥していることを確認します。
2. 実体顕微鏡下で、1mg / mlのヨウ化プロピジウム溶液、または10μLピペットで切開頂点80 / mlのFM4-64溶液のいずれかの20〜30μLを加えます。試料全体が均質な染色を確保するために染料で覆われていることを確認します。
3. FM4-64を使用する場合、ヨウ化プロピジウム、または20分を使用している場合は2分間染色します。
4. 滅菌、脱イオン水で2回洗浄します。

5.がく片アブレーション

注：ステージ4で、がく原基はFMをカバーし始めます。彼らが成長するにつれ、彼らは下にある組織からの蛍光をフィルタリング、およびイメージングプロセスを妨げます。萼片は、いずれかの金属ピンmounteを使用して手動で除去することができますピン万力上のD、または新興がく原基にレーザアブレーションを使用して成長することを防ぎます。あるいは、萼片が存在しないか、花の中央部は、通常、（ 図 ^2F）17を展開しながら、FMをカバーしていない葉状器官で置換された、例えばapetala1-1ような変異体を使用するいくつかの場合には可能です。

1. 花芽段階で萼片切除5及び古いストレート金属針保持ピン万力を使用して（図2、E1-E2）
   1. 実体顕微鏡下で解剖頂点と解剖皿を置き、そして最大倍率を設定します。滅菌、脱イオン水で茎頂を浸し、あるいは、がく片を解剖しながら、定期的に茎頂に水を適用するために千μLピペットを使用しています。
   2. ピン万力で、茎頂に対する接線方向、軸外がく片の上にピンを配置します。それは離れて破断するまで静かに離れて茎頂からの萼片を押します花芽から。
   3. 向軸萼片と同様に進みますが、茎頂に向けて萼片を押してください。
   4. 横がく片と同様に進みますが、茎頂に対して半径方向にピンを配置し、花のつぼみから離れて、側にがく片を押してください。
   5. 脱水症状を防ぐために、数分間滅菌、脱イオン水で茎頂を浸し。
2. 段階3-4でがく片原基のレーザアブレーション（図2、C5、D5）
   1. 共焦点顕微鏡のステージ上で染色し、解剖頂点と撮像皿を置き。 （第6章、「撮影設定」を参照）探して、画像にそれを準備するかのように頂部に焦点を当てます。
   2. レーザーアブレーションシステムソフトウェアを使用して、彼らは花の分裂組織を覆う開始する前に出現萼片原基の山と先端に対応する切除ゾーンを定義（典型的には、軸外及び向軸萼片のためのステージ3で、および後期段階で3 /早いです横SEのステージ4仲間）。
   3. 設定されたレーザパワーと適切なパラメータへの滞留時間は、基礎となる組織にあまりにも多くのダメージを与えることなく、十分な細胞を切除します。一般的に、使用したレーザーアブレーションシステムに応じて、適切なパラメータは最初の花の他の部分に影響を与えず、その後FMの上に成長させるためのがくを防ぐために除去されることに十分な細胞を確実にするために試行錯誤のプロセスを通じて識別される必要がつぼみ。あまりにも多くのレーザーパワーを使用し、花の中央に損害賠償時間の結果を住居、その成長および/または生存に影響を与えます。適切なパラメータが識別されると、彼らはその後の実験のために再利用することができます。
      注：最初の切除が不十分で判明した場合、それは次の日に第二のアブレーション（ 図2、C4及びD2）に進むことが可能です。

6.イメージングのセットアップ

1. 正立顕微鏡を使用してください。 媒体の表面が2.5〜5ミリメートル水（ 図1F）に覆われるように、滅菌脱イオン水で解剖頂点と撮像皿を埋めます。完全にサンプルを浸します。
   注：正立顕微鏡で撮像する場合、いくつかの頂点が同じ撮像皿に配置することができます。イメージングプロセスは時間以上続く場合は、ヨウ化プロピジウムを希釈する傾向があり、いくつかのサンプルは、撮像前に再染色を必要とするかもしれません。
2. 顕微鏡ステージ（ 図1F）上の撮像皿を置き。水浸漬レンズを低下させ、レンズの先端を水中に浸漬するように段階を上げます。解剖頂点を破砕またはイメージング媒体中にレンズを浸漬しないように慎重に進みます。
3. 気泡がレンズの先端に捕捉されている場合、それを除去するために千μLピペットで水ジェットを作ります。
4. 落射蛍光照明、XYコンを使用してレンズフィールドに位置解剖頂点の下トローラ。接眼レンズを通して見るとZのコントローラを用いて試料に焦点を当てます。サンプルを粉砕しないようにするために慎重に進んでください。
5. 画像化される、花芽のズームを共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して、あなたのサンプルを画像化に進んでください。

倒立顕微鏡を使用してください。

1. 千μLピペットを用いて、レンズの先端に、滅菌脱イオン水の液滴を置きます。
2. 撮像皿逆さまを持ち、1,000μLピペットで、解剖頂点に、滅菌脱イオン水の液滴を加えます。
3. 顕微鏡ステージ（ 図1G）に撮像皿逆さまに置きます。サンプルを粉砕しないように慎重に進んでください。
4. 落射蛍光照明下で、XYコントローラを使用してレンズの先端にわたって解剖頂点を位置付けます。試料は、レンズ先端の水滴に達するまでZコントローラと、慎重にステージを下げます。水柱はbetw形成すべきですレンズの先端と媒体EEN。
5. 水柱が形成されない場合は、慎重千μLピペットでサンプルに水滴を追加します。水柱（ 図1Hおよび1I）の確立および維持を容易にする、その先端に、より多くの水を追加するためにレンズに間に合わせのスリーブを加えます。
6. 落射蛍光照明下で、接眼レンズを通して見て、Zコントローラを用いて試料に焦点を当てます。サンプルを粉砕しないように慎重に進んでください。
7. 画像化される、花芽のズームを共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して、サンプルを画像化に進んでください。

経時実験を行う場合、撮像皿から水を注ぐと時点間での脱水を防止するために、それを閉じ。長い一日（16時間光）または連続日のサンプル、16〜22℃の条件で撮像皿を置き。各時点の前に再染色サンプル。
注：develoにいる間の細胞pingの花器官は、毎秒1日に1回または2回花の分裂組織の分裂で、より高速なセルを分割することができ、および細胞系統は、時点ごとに24時間を追跡するのは簡単です。必要であればしかし、それは6時間ごとにサンプルを画像化することが可能です。

撮像パラメータ7.留意事項

注：イメージングパラメータを設定する方法は、使用、共焦点システムに大きく依存します。下記のいずれかの共焦点顕微鏡を用いて使用することができ、これらのパラメータのいくつかのための提案です。撮像パラメータの詳細な考慮事項については、 議論のセクションを参照および^14を参照します。

1. XY解像度の場合：良い携帯解決のために1,024×1024を使用しています。代替的に、解像度を犠牲にし、撮像時間を短縮するために512×512を使用します。
2. Z分解能の場合：0.5〜1.5μmのステップサイズを設定します。ステップサイズを下げるとZ分解能も撮影時間を増加させます。

共焦点データの可視化8。

1. ムービーにはまだ花の開発の時点の画像をONにします。
   1. ソフトウェア（ 例えば 、フィジー）に（JPEGまたはTIF形式）の静止画像を開きます。
   2. スタックへの画像>スタック>画像に移動します。オープン画像はスタックにグループ化されます。
   3. スタック内の画像の順序は年代順に対応していない場合は、それらを並べ替えるためにスタックソータープラグイン（プラグイン>スタック>スタックソーター）を使用します。
   4. ムービーにスタックを有効にするには、>名前を付けて保存> AVIファイルに移動します。

Representative Results

図2は、異なる蛍光レポーター遺伝子を発現する生きたシロイヌナズナ花芽の共焦点Z-スタックの異なるビューを提示し、いずれかのヨウ化プロピジウム（ 図2、A-C5及びG）又はFM4-64（ 図2、E1-F）を用いて染色しました明確な細胞の解像度を提供しています。最も共焦点システムは、ヨウ化プロピジウムまたはFM4-64（ - 2F 図2A）のいずれかと一緒に、このようなGFPまたはYFPなどの非重複発光スペクトルを有する2つのフルオロフォアの画像化を可能にします。最良焦点システムも同じようなGFPおよびYFP、およびDsRedのような試料、およびヨウ化プロピジウム（ 図2G）に部分的に重複する発光スペクトルを有する複数のフルオロフォアを分離することができます。

タイムラプス実験の3つの例を図に示されています2及びがく片アブレーション、レーザアブレーションシステム（ 図2、C1-C5およびD1-D5）を用いて、または手動ピン万力と金属ピン（ 図2、E1-E2）のいずれかを行った後、通常の現像表示花芽。 図2に示されている花芽は、E1-E2が心皮原基は花芽の出現がく原基のステージ7レーザアブレーションで蕾の中心で観察されていない理由であるスーパーマン-1変異植物からのものであることに注意してください図2に示される、C1-C5はまだステージ5（ 図2、C5）で撮像することができるFMをカバーするのを防止します。逆に、 図2に示した花芽の場合には、D1-D5は 、レーザーアブレーションは、萼片の成長を遅らせたが、萼片は、最終的にステージ5（ 図2、D5によってFMの大部分を覆うように成長しました

図2：ライブ花芽の共焦点Z-スタックの可視化。 AとB2は、透明性の図です。 B1とB4-Gは、最大強度の投影です。 B3は直交スライス図です。 （A - E2）花APETALA3遺伝子 （緑色）のためのビーナスレポーターを発現します。細胞壁は、ヨウ化プロピジウム（B4以外の赤、緑）で染色しました。 （A）花序。数字は花の段階を示しています。段階における萼片4及び5花金星レポーターの蛍光をフィルタリング、通常FOリングを実効値。一部の花芽が花序に比べて傾いて見えることに注意してください。 （B1 - B4）ステージ5花芽の同じ共焦点Zスタックの4つの異なるビュー：緑色（B1）または火災のカラーコードの画素強度で符号化されたビーナス信号強度と最大強度投影（B1とB4） （B4;カラーコードは、パネルの下部に示されています）。透明ビュー（B2）と直交スライスビュー（B3;スライスのXY、XZおよびYZ方向のパネルに示されています）。 （C1 - C5）ステージ5の段階3からの個々の花芽の4日間の時間経過。 （白色の形質としてマークされた）アブレーションは、1日目と3日目に行わ（D1 - D5）段階5で花芽の中心を覆うから萼片を防止するのに十分であったから、個々の花芽の4日間の時間経過ステージステージ3~5; 1日目、2及び3上で実行アブレーションは、花芽の中心を覆うから萼片を防止するのに不十分でした。 （E1 - E2）背軸と向軸がく片（E1）を手動で除去した後の個々の花のつぼみ、およびすべてのがく片の（E2）;白い矢印は、残りの萼片を示します。白のアスタリスクは、がく片の除去から生じる傷跡を示しています。 DR5-3xVenusN7レポーター^18（緑色）を発現する（F）ステージ7 apetala1-1花 ;原形質膜は、FM4-64（赤）で染色しました。青い矢印は、がく片を交換し、花芽をカバーしていない葉のような構造を示しています。 （G）DORNROSCHEN-LIKE ^7（緑）、SUPERMAN（赤色）のために金星レポーターする蛍光GFPレポーターを発現する第4段階花芽及びCLAVATA3 ^19（シアン）用のDsRedレポーターを、細胞壁は、ヨウ化プロピジウム（灰色）で染色しました。 D：1日; ST：舞台。スケールバー=25μmの。スケールは、C1-C5およびD1-D5で、B1、B2及びB4に同一です。この図は、基準¹⁴から変更しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

ここでは、共焦点顕微鏡と水浸漬レンズをシロイヌナズナ花芽を開発し、ライブの画像化のためのプロトコルを提供します。これが直立または倒立顕微鏡のいずれかで行うことができますが、元を使用するように簡単かつ迅速です。異なる共焦点システムは、速度、感度、および波長を分離する能力の点で有意に異なることも注目に値します。同じサンプルで、最高の共焦点顕微鏡は現在、画像、いくつかの異なるチャネル（ 図2G 例えば GFP、YFP、DsRedのヨウ化プロピジウム）を可能にします。いくつかの共焦点顕微鏡は、同時に複数のフルオロフォアからの蛍光を収集し、その後それらを分離することができ、スペクトル検出器が装備されています。定期的な検出器を使用する場合は、しかし、レーザーやフィルタのセットが異なる蛍光体からの蛍光を励起し、分離するために使用する必要があります。いくつかのフルオロフォア（ 例えば 、CFP ANを完全に明確な発光スペクトルを有しますYFP）D、及び同時に画像化することができます。他のフルオロフォアは、部分的に重複する発光スペクトル（ 例えば、GFPおよびYFP）を有し、そして通常撮像時間を増加させる、別々に画像化される必要があります。近くに蛍光団を画像化することもしばしば他のチャンネルへの漏洩から1発蛍光団からの蛍光を防ぐために、各チャンネルのために収集され、どのくらいスペクトルの制限が必要です。これは、レーザパワーと利得の増加によって補償することができる収集された信号の強度の損失を引き起こします。しかし、長期の撮影時間と増加レーザパワーは漂白剤及び/又は試料に損傷を与えることができます。増加したレーザパワー及び/またはゲインもバックグラウンドノイズを増加させることができます。各サンプルの信号強度、解像度、撮像時間の最適化は、試行錯誤のプロセスを介して行われ、永久的なトレードオフを伴います。

このプロトコルは、解剖茎頂の側面で開発花芽のライブ共焦点イメージングを実行する方法について説明します。それ茎頂は、植物の残りの部分に接続されていないとサイトカイニンを含む培地中で成長しているという事実は、SAMと花の発達に影響を与える可能性があると主張することができます。しかし、この媒体は解剖茎頂分裂組織が正常なplastochronで新しい花芽を生成し、これらの花芽は、通常^15を開発することを保証するために、試行錯誤のプロセスを通じて経験的に設計されました。同様に、がく解剖は、遺伝子発現パターンや花の残りの発展に影響を与えるように表示されません。 SAMのライブ共焦点イメージングを実行するためにどのように他のプロトコルの詳細は、まだ植物（ 例えば 、参照^11）の残りの部分に取り付けられています。そのようなプロトコルはするように適合され、及び特にサイトカイニン関連のプロセスを研究するとき、花の開発のイメージングのために有用な選択肢を提供することができます。しかし彼らはいくつかの欠点が存在する：幹伸長やねじれをし、花芽の向きを変えます。 A植物の残りの部分に結合して茎頂を画像化することは正立顕微鏡でうまく動作しながら、ND、それは倒立顕微鏡でこれを行うにはるかに複雑です。

液浸レンズは、「乾燥」レンズ（空気によってサンプルから分離されている、すなわちレンズ）よりも良好な開口数（NA）を有し、したがって、共焦点顕微鏡を使用する場合に重要である試料のより微細な分解能を提供します。イメージングプロセスの間脱水から茎頂を防止しつつ、水浸漬レンズを使用すること、したがって、ドライレンズよりもはるかに良いNAを提供します。グリセリンと油レンズは水のレンズよりもさらに高いNAを持っているが、それらはサンプルもタイムラプス実験の間に成長し続けて茎頂、の大きさに非常に実用的でないカバースリップの使用を必要としています。サンプルの大きさを考えると、長い作動距離を有するレンズを使用することも重要である（花の段階に応じて、スタックが上150μmの厚さであることができます）。我々は、典型的には、1のNA及び1.7〜2.5ミリメートルの作動距離と20又は40Xレンズを使用します。

共焦点顕微鏡ソフトウェアは、三次元再構成（ 図2、B1、B2およびB4）とスライスビュー（ 図2、B3）を含む共焦点データを視覚化するためのいくつかの方法を、提供します。最も一般的に使用される三次元ビューは、共焦点のZスタックの最大強度投影（ 図2、B1及びB4）であるが、いくつかのソフトウェア（ 例えば ZENとIMARIS）ものより深い部分からの信号をフィルタリング透明度の景色を眺めることができ表皮層で発現起こるプロセス、又は遺伝子を見たときに有用であり得るサンプル（ 図2、B2）。信号強度は、いずれかの画素INTEを使用して、単一の色（ 図2、B1）で符号化することができますnsity、またはカラーコードを使用して（ 図2、B4）。

ライブ共焦点イメージングだけでなく、花の開発に貴重な定性的な洞察を提供しています、それはまた、潜在的に定量的なデータの豊富な発達生物学者を提供します。異なるソフトウェア（ 例えば IMARIS、フィジー、MARS-ALT、MorphographX ^{15、20、21）}の数、または1つまたはいくつかのレポーター、または異なる細胞におけるレポーターの発現レベルを発現する細胞の量の定量化を可能にします。そのようなソフトウェアはまた、自動細胞分割を行う細胞系統を追跡し、成長を定量化するために使用することができます。この別のソフトウェアには、同様のツールを提供していますが、また、多くの点で異なります。 MARS-ALTとMorphoGraphXはIMARISのAとは異なり、植物^15、20、21のために特別に設計されましたNDフィジー。 IMARISおよびMARS-ALTは、サンプル全体のセグメント化および分析を可能にしながらMorphoGraphXのみ、表皮層のセグメント化および分析を可能にします。ただし、MARS-ALTは、3つの異なる角度¹⁵からの同じサンプルの前イメージングを必要とし、IMARISは単一のスタックを必要とします。定量的な情報へのアクセスは、花の開発の我々の理解を促進することが重要です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72701-D	Dumont Style 5 Inox, for apex dissection
Pin Vise	Ted Pella, Inc.	13560	80 cm long, for sepal ablation
Straight Stainless Steel Needles	Ted Pella, Inc.	13561-50	0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation
Round plastic boxes	Electron Microscopy Sciences	64332	transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes
Rectangular hinged boxes	Durphy Packaging Co.	DG-0730	transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile	VWR	25382-064	transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope
P10 and P1000 pipettes			with corresponding filter tips
Stereomicroscope			with an 80-90X maximum magnification
Laser ablation system			for sepal ablation
Laser scanning confocal microscope system
20 or 40X water-dipping lens			with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm
Agarose
Sucrose
Murashige and Skoog basic salt mixture	Sigma-Aldrich	M5524	without vitamins
Myo-inositol	Sigma-Aldrich	I7508	vitamin
Nicotinic acid	Sigma-Aldrich	N0761	vitamin
Pyridoxine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6280	vitamin
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1270	vitamin
Glycine	Sigma-Aldrich	G8790	vitamin
N6-Benzyladenine	Sigma-Aldrich	B3408	BAP, a cytokinin
Propidium iodide solution	Sigma-Aldrich	P4864	1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
FM4-64	Invitrogen	F34653	dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes