Summary
Levende confocal bildebehandling gir biologer med et kraftig verktøy for å studere utvikling. Her presenterer vi en detaljert protokoll for live confocal bildebehandling for å utvikle Arabidopsis blomster.
Abstract
Studiet av plantevekst og utvikling har lenge vært avhengig av eksperimentelle teknikker ved bruk av døde, faste vev og uten tilstrekkelig cellulær oppløsning. Nylige fremskritt innen konfokal mikroskopi, kombinert med utviklingen av en rekke fluoroforer, har overvinne disse problemene og åpnet muligheten for å studere ekspresjonen av flere gener samtidig, med en god cellulær oppløsning, i levende prøver. Levende konfokal avbildning gir plante biologer med et kraftig verktøy for å studere utviklingen, og har vært mye brukt for å studere rotvekst og dannelsen av laterale organer på flankene av den shoot apikale meristem. Men det har ikke vært mye brukt til studiet av blomst utvikling, delvis på grunn av utfordringer som er spesifikke for bildebehandling blomster, for eksempel begerbladene som vokser over blomsten meristem, og filtrere ut fluorescens fra underliggende vev. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å opptre live confocal bildebehandling på live, utvikle Arabidopsis blomsterknopper, ved hjelp av enten en oppreist eller en invertert mikroskop.
Introduction
Mesteparten av plantekroppen danner etter embryonically fra grupper av stamceller som ligger ved eller nær tuppen - eller apikale meristem - av skuddene og røttene. Alle over bakken strukturer av voksen plante utlede fra de skyter apikale meristem (SAM), som kontinuerlig frembringer siderettede organer på sine flanker: blader under den vegetative fase, og blomster meristemer (FMS) etter at den overganger til den reproduktive fase. FMS i sin tur utvikle seg til blomster. Mens Arabidopsis SAM frembringer siderettede organer, ett om gangen, i en iterativ, spiralmønster, FMS produsere fire typer blomster organer i fire kranser, i en delvis synkron måte, med flere utviklingsmessige programmer rakne samtidig. De genetiske nettverk underliggende spesifikasjon av identiteten til de ulike blomster organer har blitt delvis påvist (for vurderinger, se referanser 1, 2), men mange aspekter av blomst utviklnt, slik som blomster organ posisjonering og definisjon av grensene mellom spinnehjul, fremdeles er lite forstått.
Tidlige molekylærgenetiske studier av planteutvikling for det meste avhengig av teknikker så som in situ hybridisering og GUS-pressen for å analysere genekspresjon. Selv om disse metodene har gitt et vell av informasjon og i stor grad bidratt til vår forståelse av plantevekst og blomst utvikling, det er viktige begrensninger: de mangler god mobil oppløsning, ikke tillate for enkel observasjon av uttrykket mønster av flere gener i samme prøver, og viktigere, kan bare brukes på døde, faste vev. Nylige fremskritt innen konfokalmikroskopi har overvinne disse begrensningene, og gi utviklings biologer med et kraftig verktøy for å undersøke prosessene underliggende anlegg morphogenesis. Særlig gjør konfokal mikroskopi for observasjon av levende vev og organer i hele deres dannelse, som er critical å forstå en typiske dynamisk prosess som utvikling.
Levende konfokalt avbildnings har vært mye brukt for å analysere antennen vekst av planter og produksjonen av sideorganene av SAM (f.eks refererer 3, 4, 5, 6), men med unntak av noen få rapporter (f.eks referanser 7, 8, 9, 10), har det ikke blitt mye brukt til studiet av blomst utvikling. Protokoller for live confocal avbildning av SAM er tilgjengelig (f.eks refererer 11, 12), og gir et godt utgangspunkt for hvordan til bilde utviklingsblomsterknopper som omgir SAM. Men bildeblomsterknopper presenterer konkrete utfordringer: for eksempel,blomsterknopper raskt bli større enn SAM, og i trinn 4, begerbladene begynner å dekke FM (trinn som beskrevet i referanse 13), og dimming fluorescensen fra underliggende vev (figur 2A). Her gir vi en detaljert protokoll som forklarer hvordan å opptre live confocal bildebehandling på å utvikle Arabidopsis blomsterknopper ved hjelp av enten en oppreist eller en omvendt mikroskop og en vann-dipping objektiv. Vi har tidligere publisert denne protokollen i referanse 14.
Protocol
1. Media og Retter Forberedelse
- Forbered dissekere retter ved å fylle rund plastkasser (ca. 6 cm bred og 2 cm dyp) til 0,5 cm med 2% agarose.
- Forbered bildebehandling retter.
- For en oppreist konfokalt mikroskop, fylle rektangulær plasthengslede bokser (ca. 7 cm lang, 4,5 cm bred, 3 cm dyp) til 0,5 cm med bildedannende medium (se avsnitt 1.3, "Imaging medium"; figur 1F).
- For en invertert konfokalt mikroskop: fyll liten petriskål (omtrent 3,5 cm bred og 1 cm dyp) nøyaktig til randen med bildedannende medium (se avsnitt 1.3, "Imaging medium"; figur 1G).
- Forbered bildedannende medium.
- For enkelt punkt avbildning bruke 1% agarose.
- For intervall eksperimenter ved å bruke apex vekstmedium (0,5x Murashige og Skoog basal saltblanding uten vitamin, 1% sukrose, 0,8% agarose, pH 5,8 med kalium-hydroxide løsning supplert med vitamin [0,01% myo-inositol, 0,0001% nikotinsyre, 0,0001% pyridoksinhydroklorid, 0,001% Tiamin-hydroklorid, 0,0002% glycin] og cytokinin [500 nM N6-benzyladenin]) 15.
2. Plantevekst
- Sow steriliserte frø på MS-plater (0,5 eller 1x Murashige og Skoog basal saltblanding uten vitamin, 0,8% agar, pH 5,8 med kalilut) med passende valg. Plasser plater i lang dag (16 timer lys) eller kontinuerlig dag, 16-22 ° C Forhold i to uker.
- Transplant frøplanter ut mot jord med tilstrekkelig mellomrom til at robust utvikling. Plasser plantene i kort dag, 16-22 ° C vilkår i tre uker.
MERK: Voksende planter i lang dag eller kontinuerlig døgnet forholdene rett etter transplantasjonen resultater i tidlig blomstring og blomsterstander som er mindre kraftig, og mye vanskeligere å dissekere. Tilsvarende forlater anlegg under kort dag Conditioner for mer enn tre uker resulterer i dag lengde-uavhengig blomstring og blomsterstander som er mindre kraftig. - Overfører anlegg til lang dag (16 timer lys) eller kontinuerlig dag, 16-22 ° C betingelser inntil de blomst. Shoot toppunktene er lettest å dissekere når blomsterstanden er 2-10 cm lang.
3. Disseksjon av skuddtoppen
- Valgfritt: Ved hjelp av en fin skarphet stein og en dråpe lett olje, skjerpe tang under stereo å gjøre dem blad-aktig, ikke peke-aktig.
- Fjern siliques, eldre blomsterknopper og videregående inflorescences fra hovedstanden ved å trykke på bunnen av peduncles med pinsett før de bryter. Fjern så mange blomster som mulig uten forstørrelse (figur 1, sammenlign A og B).
- Ved hjelp av tang, gjennomborer et vertikalt hull i agarosen av en dissekere rett, avskåret av de siste 0,5 cm av blomsterstanden og feste den vertikalt i agarose. Det gjenværendeblomsterknopper må være over den agarose overflate.
- Fyll avbildningsskål med sterilt, avionisert vann, slik at skuddtoppen er fullstendig neddykket i. Plasser dissekere fatet under stereomikroskopet, og fjerne luften som er fanget rundt skuddtoppen ved å lage vannstråler med en 1000 ul pipette (figur 1, sammenlign C og D).
- Under stereomikroskop, bruker pinsett for å fjerne blomsterknopper som ikke er som skal bli avbildet ved å skyve på undersiden av peduncle eller toppen av knoppen inntil peduncle pauser (figur 1E). Det er viktig at peduncles bryte rent i krysset med stammen, som left peduncles hindre fjerning av de unge blomsterknopper.
- Hvis avbildnings bare blomsterknopper trinnet 5 og yngre (figur 2A), fjerne vannet før dissekere trinn 6-8 blomsterknopper. Hvis bildeblomsterknopper stadium 5 og eldre, fortsett til sepal ablasjon (se punkt 5.1). Ellers prostige til trinn 3.7.
- Ved hjelp av tang, stikk et vertikalt hull i mediet av en avbildnings fatet, og stikke den dissekerte toppunktet loddrett i mediet, slik at bare de skyter apikale meristem og rundt blomsterknopper er over overflaten av mediet. Avhengig av hvilken blomsterknopp (e) som skal avbildes, kan det være nødvendig å vipper prøven, som blomsterknopper ikke nødvendigvis er orientert nøyaktig som stammen (figur 2A).
- Fortsett til farging prøven hvis nødvendig. Hvis ikke flekker og / eller bildebehandling prøven med en gang, tilsett vann og lukke bilde fatet for å unngå dehydrering. Ved anvendelse av et invertert mikroskop, sett avbildnings tallerken i en gjennomsiktig plast boks og lukke den.
Figur 1: Fremstilling av skudd toppunktene for live konfokal avbildning. (A - E) Disseksjon av enskuddtopp for avbildning. Blomsterstanden før (A) og etter (B) fjerning av siliques og eldre blomster. (C - D) skuddtopp neddykket i vann i dissekere fatet, med en luftboble fanget på spissen (C) og etter fjerning av luftbobler (D). (E) Skyt apex i dissekere fatet, etter disseksjon av blomsterknopper eldre enn scenen 5. (F - G) Utsikt skyte toppene i bilde fatet, på scenen av en oppreist (F) og invertert (G) konfokalmikroskop . I (F), er en 40X vann-dipping linse plassert over et av toppunktene, med spissen av linsen nedsenket i vann. I (G), er skuddtoppen plassert opp ned over 40X vann dyppe linse, med en vannsøyle som forbinder det bildedannende medium til spissen av linsen. Den mindre panel i (F) viser et highennes forstørrelse riss av området i rødt rektangel, med en skuddspiss inn i bildemateriale; røde og blå linjer angir overflaten av mediet og vann, henholdsvis. (H - I) Eksempler på skreddersydde enheter som tillater tilsetning av mer vann ved spissen av vann-dyppe linse: en silikongummihylse laget av en tennplugghetten (H), og en provisorisk hylse som er fremstilt fra fingeren av en Pulver lateks hanske (G). Skala streker = 0,5 cm i (A) og (B), 0,1 cm i (C) og (D), og 100 um i (E). Dette tallet ble opprinnelig publisert i referanse 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Farging
MERK: Celleveggene eller plasmamembraner kan farges med propidiumjodid eller FM4-64, henholdsvis, for å oppnå celleoppløsningunder avbildning. Alternativt kan reporterlinjer med fluorescerende proteiner merket til plasmamembranen benyttes til 6, 16.
- Fjerne vann fra avbildnings fatet, og sørge for at overflaten av mediet er tørr for å unngå fortynning av fargestoff.
- Under stereomikroskop, gjelder 20 til 30 ul av enten 1 mg / ml propidiumjodid løsning, eller 80 pg / mL løsning FM4-64 det dissekerte toppunkt med en 10 ul pipette. Sørg for at hele prøven er dekket i fargestoff for å sikre en homogen farging.
- Flekken i 2 minutter ved bruk av propidium-jodid, eller 20 minutter ved bruk av FM4-64.
- Skyll to ganger med sterilt, avionisert vann.
5. Sepal Ablation
MERK: Ved stadium 4, Sepal primordia starte dekker FM. Etter hvert som de vokser, de filtrerer ut fluorescens fra underliggende vev, og hindrer den billeddannende prosessen. Begerblader kan enten fjernes manuelt ved hjelp av en metallpinne det montertd på en tapp-skrustikke, eller forhindret til å vokse ved hjelp av laserablasjon på nye Sepal primordia. Alternativt er det mulig i noen tilfeller å bruke mutanter som apetala1-1, hvor beger mangler eller er erstattet med blad-lignende organer som ikke dekker det FM mens den sentrale delen av blomsten utvikler seg normalt (figur 2F) 17.
- Sepal ablasjon på blomsterknopper trinnet 5 og oppover ved hjelp av en tapp-skrustikke holding av en rett nål av metall (figur 2, E1-E2)
- Plasser dissekere fatet med dissekert apex under stereomikroskop, og angi forstørrelsen til maksimum. Dypp skuddtoppen i sterilt, deionisert vann, eller alternativt ved å bruke en 1000 ul pipette for å anvende vann for skuddtoppen regelmessig mens dissekere begerbladene.
- Med tapp-skrustikke, plassere nålen på toppen av abaxial sepal, tangentialt i forhold til skuddtoppen. Skyv sepal unna skuddtoppen før det bryter løsfra blomst knopp.
- Fortsett på samme måte med adaxial sepal, men skyver sepal mot skyte apex.
- Gjør det samme med de laterale begerbladene, men plassere tappen radialt i forhold til skuddtoppen, og skyver begerbladene til side, bort fra blomsterknopp.
- Dypp skuddtoppen i sterilt, avionisert vann i noen få minutter for å forhindre dehydrering.
- Laserfjerning av sepal primordia ved trinn 3-4 (figur 2, C5-D5)
- Plasser bilde fatet med farget, dissekert apex på konfokal mikroskop scenen. Finn og fokusere på spissen som om fremstilling av å avbilde det (se seksjon 6 "avbildning setup").
- Ved hjelp av laserablasjon systemprogramvare, definerer ablasjonsområde, som tilsvarer toppen og spissen av den nye sepal primordia før de begynner å dekke blomsten meristem (typisk, på et trinn 3 for abaxial og adaxial begerbladene, og ved slutten av trinn 3 / tidlig trinn 4 for sideveis og for segpals).
- Sett laser makt og bolig tid til riktige parametrene til ablate nok celler uten å påføre for mye skade på underliggende vev. Typisk, avhengig av laserablasjon system som benyttes, passende parametere i første omgang må identifiseres gjennom en prøve-og-feile-prosessen for å sikre at et tilstrekkelig celler fjernes for å hindre at beger for deretter å vokse over FM, uten å påvirke resten av blomsten knopp. Bruker for mye laser makt og bolig tid resulterer i skader på midten av blomsten, som påvirker vekst og / eller overlevelse. Når de riktige parametre er blitt identifisert, kan de brukes om igjen for etterfølgende eksperimenter.
MERK: Hvis det første ablasjon viser seg utilstrekkelig, er det mulig å gå videre til en annen ablasjon på følgende dager (figur 2, C4 og D2).
6. Imaging Setup
- Bruk en oppreist mikroskop.
MERK: Når bildebehandling med en oppreist mikroskop kan flere spisser plasseres i samme bilde parabolen. Imidlertid, hvis den billeddannende prosessen varer i mer enn en time, har en tendens propidiumjodid for å fortynnes, og noen prøver trenger re-farging før avbildning. - Plasser bilde fatet på mikroskopets objektbord (figur 1F). Senk vann-dipping linse og heve trinnet slik at spissen av linsen fall i vannet. Gå forsiktig for ikke å knuse den dissekerte toppunktene eller dypp linse i det bildedannende medium.
- Når en luftboble blir fanget på spissen av linsen, gjøre vannstråler med en 1,000 ul pipette for å fjerne den.
- Under epifluorescens belysning, stilling en av de dissekerte toppene inn i linsen feltet med XY-controller. Se gjennom okularene og fokus på prøven ved anvendelse av Z-kontrolleren. Gå forsiktig for ikke å knuse prøven.
- Bruke konfokalmikroskop programvare, zoome på blomsten knopp som skal avbildes, og gå videre til bildebehandling prøven.
- Ved hjelp av en 1000 ul pipette, sette en dråpe av sterilt, avionisert vann på spissen av linsen.
- Holder bilde fatet opp-ned, og med en 1000 ul pipette, tilsette en dråpe av sterilt, deionisert vann for å dissekert apex.
- Plasser bilde fatet opp-ned på mikroskopets objektbord (figur 1G). Gå forsiktig for ikke å knuse prøven.
- Under epifluorescens belysning, plasser dissekert toppunkt over spissen av linsen ved hjelp av XY-styreenheten. Med Z-kontrolleren, senk trinnet inntil prøven når den dråpe vann på spissen av linsen. En vannsøyle bør danne between tuppen av linsen og mediet.
- Hvis vannsøylen ikke danner, nøye legge en dråpe vann til prøven med en 1000 mL pipette. Legg provisorisk hylser til linsen for å legge til mer vann ved dens spiss, hvilket letter etablering og vedlikehold av vannsøylen (figur 1 H og 1I).
- Under epifluorescens belysning, se gjennom okularene og fokus på prøven ved anvendelse av Z-kontrolleren. Gå forsiktig for ikke å knuse prøven.
- Bruke konfokalmikroskop programvare, zoome på blomsten knopp som skal avbildes, og fortsett til bildebehandling prøven.
MERK: Selv om cellene i utvikledeping floral organer kan dele raskere, celler i blomster meristem skillet en eller to ganger hver andre dag, og cellelinjer er lett å spore med tidspunkter hver 24 time. Men hvis behovet være, er det mulig å avbilde prøvene hver sjette time.
7. hensyn på bildeparametrene
MERK: Hvordan sette opp bildeparametre avhenger mye på konfokal systemet som brukes. Nedenfor er forslag til noen av disse parametrene som kan brukes med alle konfokalmikroskop. For mer hensyn på bildeparametre, se Diskusjon seksjonen og referere 14.
- For XY vedtak: bruke 1024 x 1024 for en god mobil løsning. Alternativt kan bruke 512 x 512 for å redusere avbildning tid, på bekostning av oppløsning.
- For Z-oppløsning: innstilt trinnstørrelsen til 0,5-1,5 um. Senking av trinnstørrelsen øker Z oppløsning, men også avbildnings tid.
8. Visualisering av Confocal data
- Slå stillbilder av tidspunkter av blomsten utvikling i en film.
- Åpne stillbilder (i jpeg eller tif-format) i programvaren (f.eks, Fiji).
- Gå til Bilde> Stabler> Bilder å stable. De åpne bilder vil bli gruppert i en stabel.
- Hvis rekkefølgen av bildene i stabelen ikke samsvarer med den kronologisk rekkefølge, bruker Stack Sorterer plugin (Tillegg> Stabler> Stack sorter) for å endre rekkefølgen.
- Å snu bunken til en film, gå til Fil> Lagre som> AVI.
Representative Results
Figur 2 viser forskjellige visninger av konfokale Z-stabler av levende Arabidopsis blomsterknopper som uttrykker forskjellige fluorescerende reportergener, og farget med enten propidiumjodid (figur 2, A-C5 og G) eller FM4-64 (figur 2, E1-F) for å gi en klar mobil oppløsning. De fleste konfokale systemer tillater for avbilding av to fluoroforer med ikke-overlappende emisjonsspektra for eksempel GFP eller YFP sammen med enten propidiumjodid eller FM4-64 (Figur 2A - 2F). De beste konfokale systemer er også i stand til å skille flere fluoroforer med delvis overlappende emisjons- spektrene i de samme prøvene som GFP og YFP, og DsRed og propidiumjodid (figur 2G).
Tre eksempler på time-lapse eksperimenter er presentert i figur2 og viser blomsterknopper utvikler seg normalt etter sepal ablasjon ble utført enten med et laserablasjon system (figur 2, C1-C5 og D1-D5) eller manuelt med en tapp-skrustikke og en metallpinne (figur 2, E1-E2). Legg merke til at blomsterknopp er vist i figur 2, er E1-E2 fra en menneske-1 mutant anlegget, og det er derfor CARPEL primordia ikke observeres ved midten av knoppen i trinn 7. laserfjerning av voksende sepal primordia av blomsterknopp vist i figur 2, hindrer C1-C5 dem fra å dekke det FM, som fortsatt kan bli avbildet på et trinn 5 (figur 2, C5). Omvendt, i tilfelle av blomsterknopp er vist i figur 2, D1-D5, laserablasjon bare forsinket sepal vekst, men beger slutt vokste til å dekke det meste av FM ved trinnet 5 (figur 2, D5
Figur 2: Visualisering av confocal Z-stabler av levende blomsterknopper. A og B2 er åpenhet utsikt; B1 og B4-G er maksimal intensitet fremspring; B3 er en ortogonal skive utsikt. (A - E2) blomster som uttrykker et Venus reporter for APETALA3 genet (grønn); Celleveggene ble farget med propidiumjodid (rød, bortsett B4, grønn). (A) Inflorescence; Tallene angir floral stadier; begerblad i trinn 4 og 5 blomster filtrere ut fluorescensen av Venus reporter, som normalt forms en ring. Merk at noen blomsterknopper vises vippet i forhold til blomsterstanden. (B1 - B4) Fire forskjellige visninger av samme konfokale Z-stabel med en trinn 5 blomsterknopp: maksimal intensitet fremspring (B1 og B4) med Venus signalintensitet kodet med pikselintensiteten i den grønne farge (B1) eller med brann fargekode (B4; fargekode er vist ved bunnen av panelet); gjennomsiktighet vis (B2) og ortogonale skive vis (B3, XY, XZ og YZ orientering av skivene er vist i panel). (C1 - C5) 4-dagers tid-forløp av en individuell blomsterknopp fra trinn 3 tilbake til trinn 5; laser ablations (merket som hvite egenskaper) foretatt på dag 1 og dag 3 var tilstrekkelig til å hindre begerbladene fra å dekke senter av blomsterknopp ved trinn 5. (D1 - D5) 4-dagers tidsforsinkelse til et individ fra blomsterknopp scene3 tilbake til trinn 5; laser ablations utført på dag 1, 2 og 3 var tilstrekkelig til å hindre at begerbladene fra å dekke senter av blomsterknopp. (E1 - E2) Individuell blomst knopp etter manuell fjerning av abaxial og adaxial begerbladene (E1), og av alle begerblad (E2); hvite pilspisser angir gjenværende beger; hvite stjerne indikerer arr som resulterer fra fjerningen av begerbladene. (F) trinnet 7 apetala1-1 blomst som uttrykker et DR5-3xVenusN7 reporter 18 (grønn); plasmamembraner ble farget med FM4-64 (rød); blå pilspisser angir blad-lignende strukturer som erstatter begerbladene og ikke dekker blomst knopp. (G) Trinn 4 blomsterknopp uttrykker et fluorescerende GFP reporter for DORNROSCHEN LIGNENDE 7 (grønn), en Venus reporter for SUPERMAN (rød) og en DsRed reporter for CLAVATA3 19 (cyan); cellerVeggene ble farget med propidiumjodid (grå). d: dag; st: scenen. Skala Stolper = 25 um; skalaen er identisk i B1, B2 og B4, i C1-C5 og i D1-D5. Dette tallet ble modifisert fra referanse 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her gir vi en protokoll for avbildning av levende, utvikle Arabidopsis blomsterknopper med konfokal mikroskop og en vann-dipping objektiv. Selv om dette kan gjøres med enten stående eller en omvendt mikroskop, er det enklere og raskere å bruke det tidligere. Det er også verdt å merke seg at forskjellige konfokale systemer varierer betraktelig når det gjelder hastighet, følsomhet og evne til å skille bølgelengder. De beste konfokale mikroskop nå la det bilde flere ulike kanaler (f.eks GFP, YFP, DsRed og propidium-jodid; figur 2G) i de samme prøvene. Noen konfokale mikroskop er utstyrt med en spektral-detektor, som kan samle fluorescensen fra flere fluoroforer samtidig og skille dem etterpå. Ved bruk av en vanlig detektor, men et sett av lasere og filtre må brukes for å eksitere og skille fluorescens fra forskjellige fluoroforer. Noen fluoroforer ha fullt tydelig emisjonsspektra (f.eks CFP end YFP), og kan avbildes samtidig. Andre fluoroforer har delvis overlappende emisjonsspektra (f.eks GFP og YFP), og vanligvis må avbildes separat, noe som reduserer avbildnings tid. Imaging nære fluoroforer krever også ofte begrense hvor mye av den spektrum ble registrert for hver kanal for å hindre at fluorescensen fra en fluorofor fra å lekke inn i en annen kanal. Dette fører til et tap av intensiteten til det oppsamlede signal, noe som kan kompenseres ved en økning i lasereffekten og forsterkning. Imidlertid kan et forlenget avbildning tid og økt lasereffektblekemiddel og / eller skade på prøven. Økt lasereffekten og / eller forsterkning kan også øke bakgrunnsstøy. Optimalisering av signalintensitet, oppløsning og avbildning tid for hver prøve er gjort gjennom en prøve-og-feile-prosess, og involverer permanent avveininger.
Denne protokollen forklarer hvordan å opptre live confocal avbildning av blomsterknopper utviklings på flankene av en dissekert skyte apex. Denkan argumenteres for at det faktum at skuddtoppen ikke er koblet til resten av anlegget og vokser i et medium som inneholder cytokinins kan påvirke SAM og blomst utvikling. Men dette mediet er designet empirisk gjennom en prøve-og-feile-prosess for å sikre dissekert shoot apikale meristem produsere nye blomsterknopper på normal plastochron, og at disse blomsterknopper utvikle seg normalt 15. Tilsvarende betyr sepal disseksjon ikke ut til å påvirke genuttrykk mønstre eller utviklingen av resten av blomsten. Andre protokoller detalj hvordan man skal utføre direkte konfokal avbildning av SAM fremdeles er festet til resten av anlegget (f.eks referanse 11). Slike protokoller kan tilpasses til, og gi et nyttig alternativ for avbilding av utvikle blomster, særlig når man studerer cytokinin-relaterte prosesser. De presenterer derimot flere ulemper: spinde elongates og vendinger, og endrer orienteringen av blomsterknopper; ennd mens imaging en shoot apex festet til resten av anlegget fungerer godt med en oppreist mikroskop, er det mye mer komplisert å gjøre det med en invertert mikroskop.
Nedsenking linser har en bedre numeriske apertur (NA) enn "tørre" linser (dvs. linser som er adskilt fra prøven ved hjelp av luft), og derfor tilveiebringe en finere oppløsning av prøven, som er kritisk når det ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Ved hjelp av en vann-dipping linse således gir en mye bedre NA enn en tørr linse, samtidig som det hindrer skuddtoppen fra dehydrerende under avbildningsprosessen. Selv om glyserin og olje linser har en enda høyere NA enn vannglass, krever de anvendelse av et dekkglass, som er meget upraktisk med en prøve på størrelse med en skuddspiss, som også fortsetter å vokse i løpet av time-lapse eksperimenter. På grunn av størrelsen av prøvene (avhengig av blomster trinn, kan stabler være over 150 um tykk), er det også viktig å anvende en linse med en lang arbeidsavstand. Vi bruker vanligvis en 20 eller 40X objektiv med et NA av en og en arbeidsavstand på 1,7-2,5 mm.
Konfokalt mikroskop Programvaren har flere måter å visual konfokale data, inkludert tre-dimensjonale rekonstruksjoner (figur 2, B1, B2 og B4) og visninger stykke (figur 2, B3). Mens de mest brukte tre-dimensjonalt, er maksimumsintensitets projeksjoner av konfokale Z-stabler (figur 2, B1 og B4), noen programvare (f.eks zen og Imaris) har også utsikt transparens som filtrerer ut signalet fra de dypere deler av prøven (figur 2, B2) som kan være nyttig når man ser på prosesser som finner sted, eller gener uttrykt i, epidermal laget. Signalintensiteten kan enten være kodet med en enkelt farge (figur 2, B1), ved anvendelse av piksel intensity, eller ved hjelp av en fargekode (figur 2, B4).
Levende confocal bildebehandling tilbyr ikke bare verdifull kvalitative innsikt i blomst utvikling, det også potensielt gir utviklings biologer med et vell av kvantitative data. Forskjellige programvare (f.eks Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) gjør det mulig for kvantifisering av antallet eller volumet av celler som uttrykker en eller flere reportere, eller nivået av ekspresjon av et reportergen i forskjellige celler. Slik programvare kan også brukes til å utføre automatisk celle segmentering, spore cellelinjer og kvantifisere vekst. Dette annen programvare tilbyr lignende verktøy, men også skiller seg på mange måter. MARS-ALT og MorphoGraphX ble utviklet spesielt for planter 15, 20, 21, i motsetning til en Imarisnd Fiji. MorphoGraphX tillater bare for segmenteringen og analyse av den epidermale lag, mens Imaris og MARS-ALT tillate for segmentering og analyse av hele prøven. Imidlertid krever MARS-ALT den forutgående avbildning av den samme prøven fra tre forskjellige vinkler 15, og Imaris krever bare en enkelt stabel. Tilgang til kvantitativ informasjon er avgjørende for å videreutvikle vår forståelse av blomst utvikling.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatteren ønsker å takke professor Elliot M. Meyerowitz for hans støtte og kommentarer til manuskriptet, samt Ann Lavanway ved Dartmouth College og Dr. Andres Collazo ved Biologisk Imaging Facility ved Caltech for deres hjelp i å løse tekniske problemer med levende confocal bildebehandling. Nathanaël Prunet arbeid er støttet av det amerikanske National Institutes of Health gjennom Grant R01 GM104244 til Elliot M. Meyerowitz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90X maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40X water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
References
- Prunet, N., Jack, T. P. Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs. Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).
- Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development. FEBS J. , (2016).
- Heisler, M. G., et al. Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).
- Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex. Science. 310 (5748), 663-667 (2005).
- Yadav, R. K., et al. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex. Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).
- Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima. Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).
- Urbanus, S. L., et al. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 9, (2009).
- Hong, L., et al. Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging. Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).
- Roeder, A. H., et al. Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem. Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Dev. Biol. , (2016).
- Fernandez, R., et al. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. , (2010).
- Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).
- Irish, V. F., Sussex, I. M. Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development. Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).
- Vernoux, T., et al. The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex. Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX. Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).
