Summary
הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.
Abstract
המחקר של גידול צמחים ופיתוח הסתמך ארוך על טכניקות ניסוי באמצעות מתות, רקמות קבועות וחסרות ברזולוציה הסלולר נכונה. התקדמות מיקרוסקופיה confocal, בשילוב עם הפיתוח של fluorophores הרב, יש להתגבר על בעיות אלה ופתחה את האפשרות ללמוד את הביטוי של גנים אחדים בעת ובעונה אחת, עם רזולוצית הסלולר טובה, בדגימות לחיות. הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים צמח עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח, וכן נעשה שימוש נרחב ללמוד צמיחה שורש היווצרות של איברים לרוחב על צלעותיה של meristem לירות הפסגה. עם זאת, זה לא יושם באופן נרחב לחקר התפתחות פרח, בין שאר בשל לאתגרים ייחודיים הדמית פרחים, כמו עליי גביע גדלים מעל meristem פרח, ולסנן את הקרינה מן הרקמות בסיסיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה confocal לחיות על חיים, פיתוח הערביניצני פרחי idopsis, או באמצעות זקופה או מיקרוסקופ הפוכה.
Introduction
רוב בגוף הצמח יוצר פוסט-בעוברים מקבוצות של תאי גזע הנמצאים ליד או הקצה - או meristems פסגה - היורה והשורשים. כל המבנים מעל פני הקרקע של המפעל המבוגר נובעות meristem הפסגה לירות (SAM), אשר מייצרת איברים לרוחב ברציפות על צלעותיו: משאירה בשלב צומח meristems פרח (FMS) לאחר מעבר שלב הרבייה. FMS בתורו להתפתח פרחים. בעוד ארבידופסיס SAM מייצרת איברים לרוחב אחד בכל פעם, כמו בדגם איטרטיבי, ספירלה, FMS לייצר ארבעה סוגים של איברים פרחוניים בתוך ארבעה דורות, באופן סינכרוני חלקית, עם תוכניות התפתחותיים מרובות נפרמות זמנית. הרשתות הגנטיות שבבסיס המפרט של זהות האורגנים הפרחוניים השונים פוענחו חלקית (לביקורות, לראות אזכור 1, 2), אך היבטים רבים של developme פרחNT, כגון מיצוב פרחוני איברים בהגדרת גבולות בין דורות, להישאר ממעטים להבין.
מחקרים גנטיים מולקולריים מוקדם של התפתחות צמח הסתמכו בעיקר על טכניקות כגון כלאה באתרו וכתבים גאס לנתח ביטוי גנים. בעוד שיטות אלה סיפקו שפע של מידע ותרם רבות להבנתנו של גידול צמחים ופיתוח פרח, יש מגבלות חשובות: הם חסרים ברזולוציה הסלולר טוב, לא מאפשרים התבוננות קלה של דפוס הביטוי של גנים מרובים באותו דגימות, וחשוב, יכולות להיות מיושמות רק רקמות מתות, קבועות. התקדמות מיקרוסקופיה confocal יש להתגבר על המגבלות האלה, ולספק ביולוגים התפתחותיים עם כלי רב עצמה כדי לחקור את התהליכים morphogenesis צמח בסיסי. בפרט, מיקרוסקופיה confocal מאפשרת תצפית של חיות רקמות ואיברים ברחבי היווצרותם, המהווה גritical כדי להבין תהליך דינמי מובהק כגון פיתוח.
הדמית confocal לחיות נעשתה שימוש נרחב כדי לנתח את הגידול האווירי של צמחים ובעלי לייצור איברים לרוחב ידי SAM (למשל שמייחס 3, 4, 5, 6), אך למעט כמה דיווחים (אזכור למשל 7, 8, 9, 10), זה לא יושם נרחב לחקר התפתחות הפרח. פרוטוקולים עבור הדמית confocal לחיות של SAM זמינים (למשל שמייחס 11, 12), ולספק בסיס טוב איך תמונת ניצני פרחים בפיתוח המקיפים את SAM. עם זאת, ניצני פרחי הדמיה מציב אתגרים ספציפיים: למשל,ניצני פרחים במהירות להיות גדול יותר SAM, ובשלב 4, עלי גביע להתחיל כיסוי FM (שלבים כמתואר התייחסות 13), ואת עמעום הקרינה מן היסוד רקמות (איור 2 א). כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המסביר כיצד לבצע הדמית confocal לחיות בפיתוח ניצני פרחים ארבידופסיס או באמצעות זקופה או מיקרוסקופ הפוך עדשת מי טבילה. אנחנו קודם לכן פרסמנו פרוטוקול זה ביחס 14.
Protocol
1. מדיה ומנות כנות
- הכן לנתח מנות ידי מילוי עגול קופסאות פלסטיק (כ רחב 6 ס"מ, 2 ס"מ עמוק) כדי 0.5 ס"מ עם 2% agarose.
- כן הדמית מנות.
- עבור מיקרוסקופ confocal זקוף, למלא פלסטיק מלבנית צירים תיבות (כ ארוך 7 ס"מ, 4.5 ס"מ רוחב, 3 ס"מ עומק) כדי 0.5 ס"מ עם המדיום הדמיה (ראה סעיף 1.3, "המדיום הדמיה"; איור 1F).
- עבור מיקרוסקופ confocal הפוכה: למלא צלחת פטרי קטנה (כ 3.5 ס"מ רוחב, 1 ס"מ עמוק) בדיוק עד אפס מקום עם המדיום הדמיה (ראה סעיף 1.3, "המדיום הדמיה"; איור 1G).
- כן בינוני הדמיה.
- עבור הדמיה נקודה אחת, להשתמש agarose 1%.
- בניסויים זמן לשגות, להשתמש במדיום הגידול איפקס (0.5x Murashige ו Skoog תערובת מלח הבסיס ללא ויטמין, 1% סוכרוז, 0.8% agarose, pH 5.8 עם אשלגן hydroxidפתרון e, בתוספת ויטמין [0.01% מיו-אינוזיטול, חומצה ניקוטינית 0.0001%, הידרוכלוריד פירידוקסין 0.0001%, הידרוכלוריד 0.001% תיאמין, 0.0002% גליצין] ו לציטוקינין [500 ננומטר N6-benzyladenine]) 15.
2. גדילת צמחים
- לזרוע זרעים מעוקר על צלחות MS (0.5 או 1x Murashige ו Skoog תערובת מלח הבסיס ללא ויטמין, 0.8% אגר, pH 5.8 עם תמיסת אשלגן הידרוקסיד) עם הבחירה המתאימה. מקום צלחות יום ארוך (16 אור h) או יום רצוף, 16-22 ° C תנאים במשך שבועות.
- שתילי השתלות על אדמת עם ריווח מספיק כדי לאפשר פיתוח חזק. מקום צמחי יום קצר, 16-22 ° C תנאים למשך שלושה שבועות.
הערה: גידול צמחים בתוך יום ארוך או תנאי יום רצופים ישירות לאחר השתלת תוצאות פורחות מוקדמת תפרחות כי הם פחות נמרצים, ועוד הרבה יותר קשים לנתח. באופן דומה, עוזב צמחים תחת קונדיט יום קצריונים במשך יותר משלושה שבועות תוצאות פורחי אורך-עצמאי יום תפרחות כי הם פחות נמרצים. - העברת מפעלים אל יום ארוך (16 אור h) או יום רצוף, 16-22 ° C תנאים עד שהם פרחים. apices יירה הם הכי קלים לנתח כאשר התפרחת ארוכה 2-10 סנטימטר.
3. Dissection של הצילומים איפקס
- אופציונלי: שימוש אבן השחזה בסדר טיפת שמן אור, לחדד מלקחיים תחת סטראו כדי להפוך אותם להב דמוי, לא להצביע דמוי.
- הסר siliques, ניצני פרחים מבוגרים תפרחות משניות מן התפרחת העיקרית על ידי לחיצה על הבסיס של peduncles עם המלקחיים עד שהם נשברים. הסר כמה שיותר פרחים ככל האפשר ללא גדלה (איור 1, להשוות A ו- B).
- בעזרת מלקחיים, פירס חור אנכי ב agarose של צלחת לנתח, לנתק את 0.5 ס"מ האחרון של תפרחת ולתקוע אותו במאונך ב agarose. השארניצני פרחים חייבים להיות מעל פני שטח agarose.
- מלאו את המנה הדמיה עם מים סטריליים, דה מיונן כך איפקס לירות שקוע לחלוטין. מניחים את צלחת לנתח תחת סטראו, ולהסיר את האוויר שנלכד סביב הקודקוד לירות ידי יצירת סילוני מים עם טפטפת 1000 μL (איור 1, להשוות C ו- D).
- תחת סטראו, להשתמש במלקחיים כדי להסיר ניצני פרחים שאינם להיות צילמו על ידי לחיצה על בסיס של peduncle או העליון של ניצן עד הפסקות peduncle (איור 1E). חשוב כי peduncles לשבור למשעי בצומת עם הגבעול, כמו peduncles שאריות לעכב את הסרת ניצני פרחים צעירים.
- אם פרח הדמיה רק ניצנים שלב 5 ומטה (איור 2 א), להסיר את המים לפני לנתח בשלב 6-8 ניצני פרחים. אם ניצני פרחי הדמית שלב 5 ומעלה, המשיכו אבלציה עָלֶה גָבִיעַ (ראה סעיף 5.1). אחרת, פרוCEED לשלב 3.7.
- בעזרת מלקחיים, לנקב חור אנך המדיום של צלחת הדמיה, ולדבוק זקוף איפקס גזור במדיום, כך שרק meristem הפסגה לירות וסביבת ניצני פרחים הם מעל פני השטח של המדיום. בהתאם ניצן פרח אשר (ים) להיות צלמו, זה עשוי להיות נחוץ כדי להטות את המדגם מעט, כמו ניצני פרחים הם לא בהכרח מכוונים בדיוק כמו הגזע (איור 2 א).
- המשך מכתים המדגם במידת הצורך. אם לא מכתים ו / או הדמיה המדגם מיד, להוסיף מים ולסגור את המנה הדמיה כדי למנוע התייבשות. אם באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, במקום צלחת הדמיה בקופסת פלסטיק שקופה וסגור אותו.
איור 1: הכנת הצילומים apices עבור הדמיה confocal לחיות. (A - E) Dissection שללירות איפקס עבור הדמיה. תפרחת לפני (א) ואחרי (B) הסרת siliques ופרחים מבוגרים. (C - D) לירות איפקס שקוע במים צלחת לנתח, עם בועת אוויר לכוד בקצה (C) ואחרי הסרת בועות אוויר (D). (E) לירות איפקס בצלחת לנתח, לאחר דיסקציה של ניצני פרחים מבוגרים שלב 5. (F - G) צפה של apices לירות בצלחת ההדמיה, על הבמה של מיקרוסקופ confocal זקוף (F) ו הפוך (G) . בשנת (F), עדשת מים טבילה 40X ממוקמת מעל אחד apices, עם קצה העדשה שקוע במים. בשינה (G), איפקס לירות ממוקם במהופך מעל עדשת מי טבילת 40X, עם עמודת מים המחברת את מדיום ההדמיה אל קצה העדשה. הפאנל קטן (F) מראה בפוההגדלה לדעתה של האזור בתוך המלבן האדום, עם איפקס לירות מוכנס במדיום הדמיה; קווים אדומים וכחולים לציין את השטח של המדיום ומים, בהתאמה. (H - I) דוגמאות למכשירי מחוייטת המאפשרות הוספת מים יותר בקצה של העדשה-טבילה במים: שרוול גומי סיליקון עשוי אתחול מצת (H), ו שרוול מאולתר מן האצבע של כפפת לטקס powderless (G). ברים סולם = 0.5 ס"מ (א) ו- (ב), 0.1 ס"מ (ג) ו- (ד), ו- 100 מיקרומטר (E). דמות זו פורסמה בתחילה ביחס 14. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4. מכתים
הערה: קירות התא או ממברנות הפלזמה ניתן מוכתמים propidium יודיד או FM4-64, בהתאמה, כדי להשיג רזולוציה הסלולרבמהלך ההדמיה. לחלופין, קווי כתב עם חלבוני ניאון מתויגים קרום הפלזמה יכולים לשמש 6, 16.
- סר מי מצלחת ההדמיה, ולהבטיח את פני השטח של המדיום הוא יבש כדי למנוע דילול הצבע.
- תחת סטראו, להחיל 20 עד 30 μL של פתרון או יודיד 1 מ"ג / מ"ל יודיד, או 80 מיקרוגרם / מ"ל FM4-64 פתרון איפקס גזור עם טפטפת 10 μL. ודא המדגם כולו מכוסה צבע כדי להבטיח מכתים הומוגנית.
- כתם במשך 2 דקות אם באמצעות יודיד propidium, או 20 דקות אם באמצעות FM4-64.
- יש לשטוף פעמיים עם מים סטריליים, deionized.
5. אבלציה עָלֶה גָבִיעַ
הערה: בשלב 4, primordia עָלֶה גָבִיעַ להתחיל כיסוי FM. ככל שהם גדלים, הם לסנן את הקרינה מן הרקמה הבסיסית, וכן לעכב את תהליך ההדמיה. עלי גביע ניתן להסיר באופן ידני באמצעות סיכת מתכת mounteד על א-מלחציים סיכה, או מנע לצמוח באמצעות אבלציה לייזר על המתעוררים primordia עָלֶה גָבִיעַ. לחלופין, אפשר במקרים מסוימים להשתמש מוטציות כגון apetala1-1, שבו עלי גביע חסרים או מוחלפים איברים עלה דמוי כי אינם מכסים את FM ואילו החלק המרכזי של הפרח מתפתח באופן נורמלי (איור 2F) 17.
- אבלציה עָלֶה גָבִיעַ על ניצני פרחים בשלב 5 ומעלה באמצעות-מלחציים פין מחזיקים מחט מתכת ישרה (איור 2, E1-E2)
- מניח את הצלחת לנתח עם איפקס גזור תחת סטראו, ולהגדיר את ההגדלה למקסימום. לטבול את הקודקוד לירות במים סטריליים, deionized, או לחילופין, להשתמש פיפטה 1000 μL ליישם מים איפקס לירות באופן קבוע תוך ביתור עלי גביע.
- עם-מלחציים סיכה, למקם את הסיכה על גבי עָלֶה גָבִיעַ abaxial, בעקיפין ביחס לשיא לירות. דחף בעדינות את עָלֶה גָבִיעַ מן הקודקוד לירות עד שהוא פורץ משםמן ניצן הפרח.
- Proceed דומה עם עָלֶה גָבִיעַ adaxial, אבל לדחוף את עָלֶה גָבִיעַ לכיוון הקודקוד לירות.
- Proceed דומה עם עלי גביע לרוחב, אבל למקם את הסיכה רדיאלית ביחס לשיא לירות, ודחוף את עלי גביע בצד, הרחק ניצן הפרח.
- לטבול את הקודקוד לירות במים סטריליים, ללא יונים במשך כמה דקות על מנת למנוע התייבשות.
- אבלציה לייזר של primordia עָלֶה גָבִיעַ בשלב 3-4 (איור 2, C5-D5)
- מניחים את צלחת הדמיה עם איפקס צבעונית, גזור על הבמה מיקרוסקופ confocal. אתר ולהתמקד איפקס כמתכונן תמונה זה (ראה סעיף 6, "התקנת הדמיה").
- באמצעות תוכנת מערכת אבלציה לייזר, להגדיר את אזור אבלציה, אשר תואמת את הפסגה קצה primordia עָלֶה גָבִיעַ מתעוררים לפני שהם מתחילים כיסוי meristem פרח (בדרך כלל, בשלב 3 עבור גביע abaxial ו adaxial, ובשלב מאוחר 3 / מוקדם שלב 4 עבור לרוחב seחברים).
- כוח לייזר הגדר שוכני הזמן הפרמטרים המתאימים לקטוע מספיק תאים ללא גרימת נזק רב מדי הרקמות הבסיסית. בדרך כלל, בהתאם למערכת אבלציה לייזר המשמש, פרמטרים נכונה צריך בהתחלה להיות מזוהה באמצעות ניסוי וטעייה התהליך כדי להבטיח כי תאי מספיק מוסרים כדי למנוע את עלי גביע ובהמשך לגדול מעל FM, מבלי להשפיע על שאר הפרח לְהַנֵץ. באמצעות כוח לייזר רב מדי מגורים תוצאות בזמן נזק לציבור במרכז הפרח, המשפיעים על צמיחה ו / או הישרדות שלה. לאחר הפרמטרים הראויים זוהו, הם יכולים לעשות בה שימוש חוזר עבור ניסויים מאוחרים.
הערה: אם אבלציה הראשונית מוכיחה מספיק, אפשר להמשיך אל אבלציה שני בימים הבאים (איור 2, C4 ו- D2).
6. הגדרת הדמיה
- שימוש במיקרוסקופ זקוף.
הערה: כאשר הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף, מספר apices ניתן להציב באותה צלחת הדמיה. עם זאת, אם תהליך ההדמיה נמשך יותר משעה, יודיד propidium נוטה להיות מדולל, וכמה דוגמאות עשויות להזדקק מחדש מכתימות לפני ההדמיה. - מניחים את צלחת הדמיה על הבמה מיקרוסקופ (איור 1F). מנמיך את עדשת טבילה במים ולהעלות את הבמה כך קצה העדשה טובל במים. להתקדם בזהירות כדי לא לרסק את apices הגזור או לטבול את העדשה לתוך מדיום ההדמיה.
- אם בועת אוויר לכוד בקצה של העדשה, לגרום סילוני מים עם טפטפת 1000 μL כדי להסירו.
- תחת תאורה epifluorescence, עמדה אחת apices גזור לתחום העדשה באמצעות con XYטרולר. להסתכל דרך העיניים ולהתמקד מדגם שימוש בבקר Z. להתקדם בזהירות כדי לא לרסק את המדגם.
- באמצעות תוכנת מיקרוסקופ confocal, זום על ניצן הפרח להיות צלם, והמשיך הדמית המדגם שלך.
- בעזרת פיפטה 1000 μL, לשים טיפה של מים סטריליים, ללא יונים על קצה העדשה.
- החזק את מנת הדמיה הפוכה, ועם טפטפתי 1000 μL, להוסיף טיפה של מים סטריליים, ללא יונים איפקס הגזור.
- מניחים את צלחת הדמיה-במהופך על הבמה מיקרוסקופ (1G איור). להתקדם בזהירות כדי לא לרסק המדגם.
- תחת תאורה epifluorescence, למקם את איפקס גזור על קצה העדשה בעזרת הג'ויסטיק XY. עם בקר Z, להנמיך את הבמה בזהירות עד המדגם מגיע טיפת המים בקצה של העדשה. עמוד מים צריך להוות between קצה העדשה ואת המדיום.
- אם עמודת המים אינה מהווה, בזהירות להוסיף טיפת מים כדי המדגם עם פיפטה 1000 μL. להוסיף שרוולים מאולתרים אל העדשה כדי להוסיף עוד מים בקצו, מתירה הקמה ותחזוקה של עמודת המים (האיור 1H ו ט 1).
- תחת תאורת epifluorescence, להסתכל דרך העיניים ולהתמקד מדגם שימוש בבקר Z. להתקדם בזהירות כדי לא לרסק המדגם.
- באמצעות תוכנת מיקרוסקופ confocal, זום על ניצן פרח להיות צילמו, והמשך הדמיה המדגם.
הערה: בעוד תאי develoאברים פרחוניים פינג יכולים לחלק מהר, תאי פער meristem הפרחוני פעם או פעמים בכל יום שני, ו שושלות תאים קלות לעקוב עם נקודות זמן כל 24 h. עם זאת, אם יהיה בכך צורך, אפשר תמונה דגימות כל שש שעות.
7. שיקולים על פרמטרי ההדמיה
הערה: כיצד להגדיר את הפרמטרים הדמיה תלוי הרבה על מערכת confocal בשימוש. להלן הצעות כמה פרמטרים אלה שיכולים לשמש עם כל מיקרוסקופ confocal. לקבלת שיקולים נוספים על הפרמטרים הדמיה, בפרק הדיון וציין 14.
- לקבלת ההחלטה XY: להשתמש 1024 x 1024 עבור רזולוציה הסלולר טובה. לחלופין, להשתמש 512 x 512 כדי לקצר את זמן הדמיה, על חשבון הרזולוציה.
- לקבלת ההחלטה Z: להגדיר את הצעד בגודל עד 0.5-1.5 מיקרומטר. הורדת צעד בגודל מגדיל את הרזולוציה Z אבל גם הפעם הדמיה.
ויזואליזציה 8. של נתוני Confocal
- הפעל תמונות סטילס של נקודות זמן של התפתחות פרח לסרט.
- פתח את התמונות עדיין (ב jpeg או TIF) בתוכנה (למשל, פיג'י).
- עבור אל Image> סטאקס> תמונות לערום. התמונות הפתוחות תקובצנה ערימה.
- אם את סדר התמונות בערימה לא מתאים הסדר הכרונולוגי, השתמש תוסף סדרן Stack (Plugins> סטאקס> סדרן Stack) כדי לסדר אותן מחדש.
- כדי להפעיל את הערימה לתוך סרט, ללכת קובץ> שמירה בשם> AVI.
Representative Results
איור 2 מציג תצוגות שונות של ערימות-Z confocal של ניצני פרחי ארבידופסיס חיו לבטא גני כתב ניאון שונים, מוכתם או יודיד propidium (איור 2, A-C5 ו- G) או FM4-64 (איור 2, E1-F) כדי לספק רזולוצית הסלולר ברורה. רוב מערכות confocal לאפשר הדמיה של שני fluorophores עם ספקטרום פליטה שאינן חופפות כגון GFP או YFP יחד עם או יודיד יודיד או FM4-64 (איור 2 א - 2F). מערכות confocal הטובות ביותר הן גם מסוגלות להפריד fluorophores המרובה עם ספקטרום פליטה חופף חלקית באותו דגימות, כגון GFP ו YFP, ו dsRed ו יודיד propidium (איור 2G).
שלוש דוגמאות של ניסויי הזמן לשגות מוצגות באיור2 ולהראות ניצני פרחים מתפתח בצורה תקינה לאחר אבלציה עָלֶה גָבִיעַ בוצע גם עם מערכת אבלציה לייזר (איור 2, C1-C5 ו- D1-D5) או באופן ידני עם במלחציים פינים ופין מתכת (איור 2, E1-E2). שים לב ניצן הפרח שמוצג באיור 2, E1-E2 הוא מצמח סופרמן-1 מוטציה, וזו הסיבה primordia carpel לא נצפתה במרכז של ניצן ב אבלציה לייזר הבמה 7. primordia עָלֶה גָבִיעַ המתעוררים של ניצן הפרח 2 שמוצג באיור, C1-C5 מונעת מהם מכסה את FM, אשר עדיין ניתן הדמיה בשלב 5 (איור 2, C5). לעומת זאת, במקרה של ניצן הפרח שמוצג באיור 2, D1-D5, אבלציה לייזר רק מתעכב צמיחה עָלֶה גָבִיעַ, אבל עלי גביע הזמן למדה לכסות את רוב FM ידי שלב 5 (איור 2, D5
איור 2: ויזואליזציה של ערימות-Z confocal של ניצני פרחים חיים. A ו- B2 הם נופי שקיפות; B1 ו- B4-G הן תחזיות בעוצמה מקסימלית; B3 הוא נוף פרוס מאונך. (A - E2) פרחים להביע כתבת ונוס עבור גן APETALA3 (הירוק); קירות התא היו מוכתמים propidium יודיד (אדום, למעט B4, ירוק). (א) תפרחת; מספרים מצביעים בשלבים פרחוניים; עליי גביע בשלב 4 ו 5 פרחים לסנן את הקרינה של כתב ונוס, אשר בדרך כלל FORMS טבעת. שים לב כמה ניצני פרחים להופיע מוטה לעומת התפרחת. (B1 - B4) ארבע תצוגות שונות של Z-ערימת confocal הזהה של ניצן פרח שלב 5: תחזיות בעצמה מקסימלית (B1 ו- B4) עם עוצמת אות ונוס מקודדת עם עוצמת פיקסל בצבע הירוק (B1) או עם קוד צבע אש (B4; קוד צבע מוצג בתחתית הפאנל); שקיפות נוף (B2) ולהציג פרוסת אורתוגונלי (B3, את XY, נטיית XZ ו YZ של הפרוסות מצוינות בלוח). (C1 - C5) 4 ימים זמן לשגות של ניצן הפרח היחיד משלב 3 לשלב 5; כריתת ליזר (מסומן כתכונות לבנות) שבוצעה ביום 1 והיום 3 היו מספיק כדי למנוע את עלי הגביע מלסקר במרכז ניצן הפרח בשלב 5. (D1 - D5) 4 ימים זמן לשגות של ניצן פרח בודד שלב3 עד שלב 5; כריתת ליזר שבוצעה ביום 1, 2 ו 3 היו מספיקה כדי למנוע את עלי הגביע מלסקר במרכז ניצן הפרח. (E1 - E2) ניצן פרח פרט לאחר הסרה ידנית של abaxial ואת עליי גביע adaxial (E1), ושל כל עלי הגביע (E2); ראשי חץ לבן מציינים עלי גביע הנותרים; כוכביות לבנות מצביעות צלקות כתוצאה מההסרה עליי הגביע. (F) שלב 7 פרח apetala1-1 להביע כתבת DR5-3xVenusN7 18 (ירוק); ממברנות פלזמה הוכתמו FM4-64 (אדום); ראשי חץ כחול מצביעים על מבנים דמויי עלים שמחליפים עלי הגביע אינם מכסים את ניצן הפרח. (G) ניצן פרח שלב 4 להביע כתב GFP ניאון עבור DORNROSCHEN דמוי 7 (ירוק), כתב ונוס לסופרמן (אדום) ו כתב dsRed עבור 19 CLAVATA3 (ציאן); תאיםהקירות היו מוכתמים propidium יודיד (אפור). ד: יום; רח: במה. ברים בקנה מידה = 25 מיקרומטר; בקנה מידה זהה ב B1, B2 ו- B4, ב C1-C5 ו ב D1-D5. דמות זו שונתה מהתייחסות 14. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול עבור ההדמיה של חיה, ניצני פרחים ארבידופסיס מתפתחים עם מיקרוסקופ confocal עדשה-טבילה במים. אמנם זה יכול להיעשות גם עם זקופה או מיקרוסקופ הפוכה, זה קל ומהיר להשתמש לשעבר. כמו כן ראוי לציין כי מערכות confocal שונות להשתנות באופן משמעותי במונחים של מהירות, רגישות, ואת היכולת להפריד אורכי גל. מיקרוסקופי confocal הטובים כעת לאפשר לערוצים שונים תמונה מספר (למשל GFP, YFP, dsRed ו יודיד propidium; 2G האיור) באותו דגימות. מיקרוסקופים confocal חלקם מצוידים בגלאי רפאים, אשר יכולים לאסוף את הקרינה מכמה fluorophores זמנית ולהפריד אותם לאחר מכן. בעת שימוש בגלאי רגיל, לעומת זאת, קבוצה של לייזרים ומסננים יש להשתמש כדי להלהיב ולהפריד את הקרינה מן fluorophores השונה. Fluorophores לחלקם יש ספקטרום פליטה ברור לחלוטין (בלתי CFP למשלד YFP), ויכול להיות צלם בו זמנית. Fluorophores האחר יש ספקטרום פליטה חופף חלקית (GFP למשל ו YFP), ובדרך כלל צריך להיות צלם בנפרד, אשר מגדיל את זמן הדמיה. הדמית fluorophores הקרובה גם לעתים קרובות דורשת הגבלה כמה הקשת נאספת עבור כל ערוץ למנוע קרינה מן fluorophore אחד מ דולף לתוך ערוץ אחר. זו גורמת לאובדן של עוצמת האות שנאספו, אשר יכול להיות מפוצה על ידי עלייה כוח לייזר ורווח. עם זאת, זמן הדמיה ממושכת וכוח לייזר מוגבר עלול להלבין ו / או נזק המדגם. כוח הליזר מוגבר ו / או רווח עשוי גם להגביר את רעשי רקע. אופטימיזציה של עוצמת אות, רזולוציה וזמן הדמיה עבור כל דגימה נעשתה באמצעות תהליך של ניסוי וטעייה, והיא כרוכה בפשרות קבעו.
פרוטוקול זה מסביר כיצד לבצע הדמיה confocal לחיות ניצני פרחים לפתח על צלעותיה של איפקס לירות גזור. זהניתן לטעון כי העובדה איפקס לירות אינה מחוברת לשאר הצמח גדלה במצע המכיל Cytokinins עלול להשפיע SAM ופיתוח פרח. עם זאת, המדיום הזה תוכנן באופן אמפירי באמצעות תהליך של ניסוי וטעייה כדי להבטיח צילומים הגזורים meristems הפסגה לייצר ניצני פרחים חדשים על פלסטוכרון הנורמלי, וכי ניצני פרחים אלה להתפתח בצורה תקינה 15. באופן דומה, דיסקציה עָלֶה גָבִיעַ אינה מופיעה להשפיע דפוסי ביטוי גנים או ההתפתחות של שאר הפרחים. פרוטוקולים אחרים בפירוט כיצד לבצע הדמיה confocal לחיות של SAM עדיין מחוברת לשאר הצמח (למשל הפניה 11). פרוטוקולים כזה יכול להתאים, ולהציע אלטרנטיבה שימושית עבור ההדמיה של פיתוח פרחים, במיוחד כאשר לומד תהליכים הקשורים לציטוקינין. הם מציגים כמה חסרונות עם זאת: מתארך הגבעול ומסובב, ומשנה את הכיוון של ניצני פרחים; אnd תוך הדמיה איפקס לירות מצורפת לשאר המפעל עובד היטב עם מיקרוסקופ זקוף, זה הרבה יותר מסובך לעשות זאת עם מיקרוסקופ הפוכה.
עדשות Immersion יש צמצם מספרי טוב (NA) מאשר עדשות "יבשות" (עדשות כלומר המופרדים מן המדגם על ידי אוויר), ולכן מספקות רזולוציה עדינה של המדגם, שהוא קריטי כאשר באמצעות מיקרוסקופ confocal. באמצעות עדשת מי טבילה ובכך מספק NA הרבה יותר טוב מאשר עדשה יבשה, תוך מניעת איפקס לירות מן להתייבשות במהלך תהליך ההדמיה. בעוד גליצרין ועדשות שמן יש NA אפילו גבוה יותר מאשר עדשות מים, הם דורשים את השימוש coverslip, וזה מאוד חסר מעשיות עם מדגם בגודל של איפקס לירות, אשר גם ממשיך לגדול במהלך ניסויים זמן לשגות. בהתחשב בגודל של הדגימות (תלוי בשלבים הפרחוניים, ערימות יכולות להיות מעל 150 מיקרומטר עבה), חשוב גם להשתמש בעדשה עם מרחק עבודה ארוך. אנחנו בדרך כלל להשתמש בעדשה 20 או 40X עם NA של 1 ו מרחק עבודה של 1.7-2.5 מ"מ.
תוכנת מיקרוסקופ Confocal מציעה מספר דרכים כדי להמחיש נתונים confocal, כולל שחזורים תלת-ממדיים (איור 2, B1, B2 ו- B4) ונוף פרוסה (איור 2, B3). בעוד תצוגות תלת מימדי הנפוץ ביותר הן תחזיות בעוצמה מקסימלית של Z- ערימות confocal (איור 2, B1 ו- B4), תוכנה כלשהי (למשל זן Imaris) מציעים גם נוף שקיפות שמסננת את האות מ בחלקים עמוקים יותר של המדגם (איור 2, B2), אשר יכול להיות שימושי כאשר מסתכלים תהליכים המתרחשים, או הגנים מתבטאת, שכבת אפידרמיס. עוצמת האות יכול להיות מקודד או עם צבע אחד (איור 2, B1), באמצעות פיקסל intensity, או באמצעות קוד צבע (איור 2, B4).
הדמית confocal לחיות לא רק מציעה תובנה איכותיות רבות ערך על פיתוח פרח, זה גם מספק לביולוגים התפתחותי פוטנציאלי עם שפע של נתונים כמותיים. תוכנות שונות (למשל Imaris, פיג'י, MARS-ALT, 15 MorphographX, 20, 21) מאפשרת כימות של מספר או נפח של תאים המבטאים אחד או כמה עיתונאים, או את רמת הביטוי של עיתונאי בתאים שונים. תוכנה כזו יכולה לשמש גם כדי לבצע פילוח תא אוטומטי, לעקוב אחר שושלות תאים ולכמת צמיחה. תוכנות שונות זו מציעות כלים דומים, אך גם שונות במובנים רבים. MARS-ALT ו- MorphoGraphX תוכננו במיוחד עבור צמחים 15, 20, 21, שבניגוד Imarisnd בפיג'י. MorphoGraphX מאפשר רק עבור פילוח וניתוח של שכבת אפידרמיס, בעוד Imaris ומאדים-ALT לאפשר פילוח וניתוח של המדגם כולו. עם זאת, MARS-ALT דורש הדמיה לפני מאותו מדגם משלוש זוויות שונות 15, ו Imaris רק דורש בערימה אחת. גישה למידע כמותי הוא קריטי כדי לקדם את ההבנה של התפתחות הפרח שלנו.
Disclosures
המחבר יש מה למסור.
Acknowledgments
המחבר מבקש להודות לפרופ 'אליוט מ Meyerowitz על תמיכתו, ואת הערות על כתב היד, וכן באן Lavanway ב Dartmouth College וד"ר אנדרס קולזו במתקן הדמיה ביולוגית בקלטק עזרתם בפתרון בעיות טכניות עם הדמית confocal לחיות. עבודתו של נתנאל Prunet נתמך על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות באמצעות גרנט R01 GM104244 כדי אליוט מ Meyerowitz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90X maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40X water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
References
- Prunet, N., Jack, T. P. Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs. Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).
- Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development. FEBS J. , (2016).
- Heisler, M. G., et al. Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).
- Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex. Science. 310 (5748), 663-667 (2005).
- Yadav, R. K., et al. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex. Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).
- Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima. Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).
- Urbanus, S. L., et al. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 9, (2009).
- Hong, L., et al. Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging. Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).
- Roeder, A. H., et al. Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem. Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Dev. Biol. , (2016).
- Fernandez, R., et al. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. , (2010).
- Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).
- Irish, V. F., Sussex, I. M. Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development. Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).
- Vernoux, T., et al. The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex. Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX. Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).
