Live Confocal Imaging för att utveckla Arabidopsis blommor

Summary

Live konfokal avbildning ger biologer med ett kraftfullt verktyg för att studera utvecklingen. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för levande konfokal avbildning att utveckla Arabidopsis blommor.

Abstract

Studiet av växternas tillväxt och utveckling har länge förlitat sig på experimentella tekniker med döda, fasta vävnader och saknar ordentlig cellulär upplösning. Senaste framstegen inom konfokalmikroskopi, i kombination med utvecklingen av ett stort antal fluoroforer har övervinna dessa frågor och öppnade möjligheten att studera uttrycket av flera gener samtidigt med en god cellulär upplösning i levande prover. Live konfokal avbildning ger växtbiologer med ett kraftfullt verktyg för att studera utvecklingen, och har i stor utsträckning använts för att studera rottillväxt och bildandet av sido organ på flankerna av skott toppmeristem. Men det har inte varit i stor utsträckning för att studera blomma utveckling, delvis på grund av utmaningar som är specifika för avbildning blommor, såsom foderblad som växer över blomman meristem och filtrera bort fluorescens från underliggande vävnader. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att uppträda live konfokal avbildning på levande, utveckla Arabidopsis blomknoppar, med användning av antingen en upprätt eller ett inverterat mikroskop.

Introduction

De flesta av anläggningen kroppen bildar post-embryonal från grupper av stamceller belägna vid eller nära spetsen - eller apikala meristem - av skott och rötter. Alla ovan jord strukturer av den vuxna växten härrör från inspelningen apikala meristem (SAM), som kontinuerligt producerar laterala organ på sina flanker: lämnar under den vegetativa fasen, och blom meristem (FMS) efter att den övergår till det reproduktiva fasen. FMs i sin tur utvecklas till blommor. Medan Arabidopsis SAM producerar laterala organ en i taget, på ett iterativt, spiralmönster, FMs producerar fyra typer av floral organ inom fyra virvlar, i ett delvis synkront sätt, med flera utvecklingsprogram unraveling samtidigt. De genetiska nätverk som ligger bakom specifikation av identiteten på de olika blomster organ har delvis dechiffreras (omdömen, se referenserna ^{1, 2),} men många aspekter av blomma development, såsom blomorgan positionering och definitionen av gränserna mellan virvlar, dåligt förblir förstådd.

Tidiga molekylärgenetiska studier av växtutveckling förlitade sig främst på tekniker såsom in situ hybridisering och GUS reportrar för att analysera genuttryck. Även om dessa metoder har gett en mängd information och starkt bidragit till vår förståelse av växters tillväxt och blomma utveckling, det finns viktiga begränsningar: de saknar god cellulär upplösning, inte gör det möjligt att lätt observation av uttrycksmönstret av flera gener i samma prover, och viktigare, kan endast tillämpas på döda, fasta vävnader. Senaste framstegen inom konfokalmikroskopi har övervinna dessa begränsningar, och ge utvecklingsbiologer med ett kraftfullt verktyg för att undersöka processer som ligger bakom anläggningen morfogenes. I synnerhet tillåter konfokalmikroskopi för observation av levande vävnader och organ i hela sin formation, vilket är critical att till fullo förstå en genuint dynamisk process som utveckling.

Levande konfokal avbildning har i stor utsträckning använts för att analysera antenn tillväxt av växter och produktion av laterala organ genom SAM (t.ex. refererar ^{3, 4, 5, 6),} men med undantag för ett fåtal rapporter (t.ex. referenserna ^{7, 8, 9, 10),} det har inte varit i stor utsträckning för att studera blomma utveckling. Protokoll för levande konfokal avbildning av SAM finns (t.ex. referenser ^{11, 12),} och ger en bra bas för hur bilden utvecklingsblomknoppar som omger SAM. Men bildblomknoppar innebär särskilda utmaningar: till exempel,blomknoppar blir snabbt större än SAM, och i skede 4, foderblad börja täcker FM (stadier såsom beskrives i referens ^13), och ljusreglering fluorescensen från underliggande vävnader (Figur 2A). Här ger vi ett detaljerat protokoll som förklarar hur man uppträda live konfokal avbildning på att utveckla Arabidopsis blomknoppar med antingen en upprätt eller inverterat mikroskop och en vattendoppning lins. Vi har tidigare publicerat detta protokoll i ¹⁴ referens.

Protocol

1. Medier och fat Preparation

1. Förbereda dissekera rätter genom att fylla runda plastlådor (ca 6 cm bred, 2 cm djup) till 0,5 cm med 2% agaros.
2. Förbered avbildning rätter.
   1. För en upprätt konfokalmikroskop, fylla rektangulära plast ledade lådor (ca 7 cm lång, 4,5 cm bred, 3 cm djup) till 0,5 cm med bildalstringsmediumet (se avsnitt 1,3, "Imaging medium"; Figur 1F).
   2. För ett inverterat konfokalmikroskop: fyll liten petriskål (ca 3,5 cm bred, 1 cm djup) exakt till brädden med bildalstringsmediumet (se avsnitt 1,3, "Imaging medium"; Figur 1G).
3. Förbereda bildalstringsmediumet.
   1. För enskild punkt avbildning, använda en% agaros.
   2. För time-lapse experiment använda spetstillväxtmedium (0,5x Murashige och Skoog basala saltblandningen utan vitamin, en% sackaros, 0,8% agaros, pH 5,8 med kalium hydroxide-lösning, kompletterad med vitamin [0,01% myo-inositol, 0,0001% nikotinsyra, 0,0001% pyridoxinhydroklorid, 0,001% tiaminhydroklorid, 0,0002% glycin] och cytokinin [500 nM N6-bensyladenin]) ^15.

2. Plant Growth

1. Sugga steriliserade frön på MS-plattor (0,5 eller 1x Murashige och Skoog basala saltblandningen utan vitamin, 0,8% agar, pH 5,8 med kaliumhydroxid-lösning) med lämpligt val. Place plattor i lång dag (16 h ljus) eller kontinuerlig dag, 16-22 ° C Villkor för två veckor.
2. Transplant plantor på jorden med tillräckligt avstånd för att möjliggöra robust utveckling. Placera växter i kort dag, 16-22 ° C Villkor för tre veckor.
   OBS: Odling av växter i lång dag eller kontinuerliga dagens förhållanden direkt efter transplantation leder till ökat blomning och blomställningar som är mindre kraftfull och mycket svårare att dissekera. Likaså lämnar växter i kort dag conditjoner i mer än tre veckor resulterar i dagslängd oberoende blomning och blomställningar som är mindre kraftfull.
3. Överförings växter till lång dag (16 h ljus) eller kontinuerlig dag, 16-22 ° C förhållanden tills de blommar. Skjuta spetsarna är lättast att dissekera när blomställningen är 2-10 cm lång.

3. Dissekering av Shoot Apex

1. Valfritt: Med hjälp av en fin skärpa sten och en droppe lätt olja, skärpa pincett under stereo att göra dem bladliknande, inte peka-liknande.
2. Ta siliques, äldre blomknoppar och sekundära blomställningar från den primära blom genom att trycka basen av skaft med pincett tills de går sönder. Ta bort så många blommor som möjligt utan förstoring (Figur 1, jämför A och B).
3. Med användning av pincett, pierce ett vertikalt hål i agaros av en dissekera maträtt, avskurna de sista 0,5 cm av blomställningen och hålla fast den vertikalt i agaros. den återståendeblomknoppar måste vara över agarosen ytan.
4. Fyll bild skålen med steril, avjoniserat vatten så att skjuta spetsen är helt nedsänkt. Placera dissekera skålen under stereomikroskop, och avlägsna luften instängd runt shoot apex genom att skapa vattenstrålar med en 1000 mikroliter pipett (figur 1, jämför C och D).
5. Under stereomikroskop, använd pincett för avlägsnande av blomknoppar som inte skall avbildas genom att trycka på basen av skaftet eller den övre delen av knoppen tills Skägg pauser (figur 1E). Det är viktigt att de skaft bryta rent vid korsningen med stammen, som överblivna skaft hindrar avlägsnandet av de unga blomknoppar.
6. Om avbildnings endast blomknoppar stadium 5 och yngre (figur 2A), avlägsna vattnet före dissekera stadium 6-8 blomknoppar. Om bildblomknoppar etapp 5 och äldre, fortsätt till sepal ablation (se avsnitt 5.1). Annars proga till steg 3,7.
7. Med hjälp av pincett, genomborra ett vertikalt hål i mediet av en avbildande skålen, och hålla fast den dissekerade apex upprätt i mediet, så att endast skjuta apikala meristem och omgivande blomknoppar är ovanför ytan av mediet. Beroende på vilken blomknopp (er) skall avbildas, kan det vara nödvändigt att något luta provet, som blomknoppar inte nödvändigtvis orienterade precis som stammen (fig 2A).
8. Fortsätt till färgning av provet om det behövs. Om inte färgning och / eller avbildning av provet direkt, tillsätt vatten och stäng bild skålen för att förhindra uttorkning. Om användning av ett inverterat mikroskop, placera avbildnings skålen i en genomskinlig plastlåda och stänga den.

Figur 1: Framställning av skott spetsarna för levande konfokal avbildning. (A - E) Dissekering av enskjuta spetsen för avbildning. Blomställning före (A) och efter (B) avlägsnande av siliques och äldre blommor. (C - D) Shoot spets nedsänktes i vatten i dissekera skålen, med en luftbubbla instängd vid spetsen (C) och efter avlägsnande av luftbubblan (D). (E) skjuta apex i dissekera skålen, efter dissektion av blomknoppar äldre än stadium 5. (F - G) Vy över shoot spetsar i avbildnings skålen, på scenen av en upprättstående (F) och inverteras (G) konfokalmikroskop . I (F), är en 40X vattendopplins placerad ovanför en av topparna, med spetsen av linsen nedsänkt i vatten. I (G), är shoot apex placerad upp och ned ovanför 40X vatten-dopplins, med en vattenpelare som förbinder det bildgivande mediet till spetsen av linsen. Den mindre panel i (F) visar en highennes förstoring bild av området i den röda rektangeln, med en shoot apex insatt i bildalstringsmediumet; röda och blå linjer visar ytan av mediet och vatten, respektive. (H - I) Exempel på specialanpassade produkter som gör det möjligt att tillsätta mer vatten vid spetsen av den vattendopplins: ett kiselgummi hylsa tillverkad av ett tändstiftskontakten (H) och en undermåliga hylsa tillverkad av fingret av en puderlatexhandske (G). Skalstrecken = 0,5 cm i (A) och (B), 0,1 cm i (C) och (D), och 100 ^ m i (E). Denna siffra var ursprungligen publicerades i ¹⁴ referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Färgning

OBS: Cellväggar eller plasmamembran kan färgas med propidiumjodid eller FM4-64, respektive, för att uppnå cellupplösningunder avbildning. Alternativt kan reporter linjer med fluorescerande proteiner taggade till plasmamembranet användas ^{6, 16.}

1. Avlägsna vatten från avbildnings skålen, och se till ytan av mediet är torrt för att undvika utspädning av färgämnet.
2. Under stereomikroskop, applicera 20 till 30 mikroliter av antingen en mg / ml propidiumjodid-lösning, eller 80 | ig / ml FM4-64 lösning på den dissekerade spetsen med en 10 mikroliter pipett. Se till att hela provet är täckt av färg för att säkerställa en homogen färgning.
3. Färga för 2 min om användning propidiumjodid, eller 20 min om användning FM4-64.
4. Skölj två gånger med sterilt, avjoniserat vatten.

5. Sepal Ablation

OBS: I steg 4, Sepal primordia börjar täcker FM. När de växer, de filtrerar ut fluorescensen från underliggande vävnad, och hindrar avbildningsprocessen. Foderblad kan antingen tas bort manuellt med ett metallstift mounted på en tapp-skruvstycke, eller förhindras att växa med användning av laserablation om nya Sepal primordia. Alternativt är det möjligt i vissa fall att använda mutanter såsom apetala1-1, i vilka foderblad saknas eller ersättas med bladliknande organ som inte täcker FM medan den centrala delen av blomman utvecklas normalt (Figur 2F) ^17.

1. Sepal ablation på blomknoppar stadium 5 och äldre med hjälp av en tapp-skruvstycke som håller en rak metallnål (Figur 2, E1-E2)
   1. Placera dissekera skålen med dissekerade spetsen under stereo och ställ in förstoringen till maximum. Doppa shoot apex i sterilt, avjoniserat vatten, eller alternativt använda en 1000 mikroliter pipett för att applicera vatten till shoot apex regelbundet när dissekera foderblad.
   2. Med PIN-vise, placera stift ovanpå abaxial sepal, tangentiellt i förhållande till skjuta spetsen. Tryck försiktigt sepal ifrån skott apex tills det lossnarfrån blomknopp.
   3. Fortsätt på samma sätt med adaxial sepal, men skjut sepal mot skott apex.
   4. Fortsätt på liknande sätt med de laterala foderblad, men placera tappen radiellt i förhållande till skjuta spetsen, och pressa foderblad åt sidan, bort från blomknopp.
   5. Doppa shoot apex i sterilt, avjoniserat vatten i några minuter för att förhindra uttorkning.
2. Laserablation av sepal primordia vid steg 3-4 (fig 2, C5-D5)
   1. Placera bild skålen med färgade, dissekerade spets på konfokalmikroskop scenen. Leta upp och fokusera på toppen som om förbereder sig för att bilden (se avsnitt 6, "imaging setup").
   2. Med användning av laserablation systemprogramvaran, definiera ablation zon, som motsvarar krönet och dricks av den framväxande sepal primordia innan de börjar täcker blomman meristem (typiskt, i skede 3 för abaxial och adaxial foderblad, och vid sent skede 3 / tidig stadium 4 för sido sigpolare).
   3. Ställ lasereffekt och uppehållstiden till lämpliga parametrar för att avlägsna tillräckligt med celler utan att vålla alltför stor skada på de underliggande vävnaderna. Typiskt, beroende på laserablation systemet som används, lämpliga parametrar initialt behöver identifieras genom en trial-and-error process för att säkerställa att tillräckligt många celler avlägsnas för att förhindra att foderblad att därefter växa över FM, utan att påverka resten av blomman knopp. Att använda för mycket laser makt och uppehållstid resulterar i skador på mitten av blomman, som påverkar tillväxt och / eller överlevnad. När de rätta parametrarna har identifierats, kan de återanvändas för efterföljande experiment.
      OBS: Om den initiala ablation bevisar otillräcklig, är det möjligt att gå vidare till en andra ablation följande dagar (figur 2, C4 och D2).

6. Imaging Setup

1. Använd en upprätt mikroskop. Fylla avbildnings skålen med de dissekerade spetsarna med sterilt, avjoniserat vatten så att ytan av mediet är täckt av 2,5-5 mm vatten (figur 1F). Helt fördjupa proverna.
   OBS: När avbildning med en upprätt mikroskop kan flera toppar placeras i samma bild skålen. Emellertid, om avbildningsprocessen varar mer än en timme, tenderar propidiumjodid som skall spädas, och vissa prover kan behöva re-färgning före avbildning.
2. Placera avbildnings skålen på mikroskop scenen (figur 1F). Sänka vattendopplins och höja scenen så att spetsen av linsen doppar i vattnet. Gå försiktigt för att inte krossa de dissekerade spetsar eller doppa linsen i det bildgivande mediet.
3. Om en luftbubbla fångas vid spetsen av linsen, gör vattenstrålar med en 1000 mikroliter pipett för att ta bort den.
4. I epifluorescence belysning, läge en av de dissekerade spetsarna in i linsfältet med XY-concontroller. Titta genom okularen och fokusera på provet med hjälp av Z-controller. Gå försiktigt för att inte krossa provet.
5. Med hjälp av konfokalmikroskop programvara, zooma på blomknopp som ska avbildas, och fortsätt till avbildning ditt prov.

Använd ett inverterat mikroskop.

1. Med användning av en 1000 mikroliter pipett, sätta en droppe av sterilt, avjoniserat vatten på spetsen av linsen.
2. Hålla avbildnings skålen upp och ned, och med ett 1000 mikroliter pipett, tillsätt en droppe sterilt, avjoniserat vatten till den dissekeras apex.
3. Placera avbildnings skålen upp och ned på mikroskopsteget (figur 1G). Gå försiktigt för att inte krossa provet.
4. I epifluorescence belysning, placera dissekerade spetsen över spetsen av linsen med användning av XY-styrenheten. Med Z styrenheten, försiktigt sänka korsbordet tills provet når droppe vatten vid spetsen av linsen. En vattenpelaren bör bilda between spetsen av linsen och mediet.
5. Om vattenmassan inte bildar, försiktigt lägga till en droppe vatten till provet med en 1000 mikroliter pipett. Lägga provisoriska hylsor till linsen för att lägga till mer vatten vid sin spets, vilket underlättar upprättandet och upprätthållandet av vattenmassan (Figur 1H och 1I).
6. Under epifluorescence belysning, titta igenom okularen och fokusera på provet med hjälp av Z-controller. Gå försiktigt för att inte krossa provet.
7. Med hjälp av konfokalmikroskop programvara, zooma på blomknopp som ska avbildas, och fortsätt att avbilda provet.

Om du utför tidsförlopp experiment, häll vatten ur bild skålen och stänga den för att förhindra uttorkning mellan tidpunkter. Placera avbildnings skålen med proverna i lång dag (16 h ljus) eller kontinuerlig dag, 16-22 ° C förhållanden. Re-fläck prover före varje tidpunkt.
OBS: Även om celler i developing blommiga organ kan dela snabbare, celler i blomster meristem dela en eller två gånger varannan dag, och cellinjer är lätt att spåra med tidpunkter varje 24 h. Men vid behov, är det möjligt att avbilda proven var sjätte timme.

7. Överväganden om de Imaging Parametrar

OBS: Hur man ställer in bildparametrar beror mycket på den konfokala system som används. Nedan finns förslag på några av dessa parametrar som kan användas med alla konfokalmikroskop. För mer överväganden bildparametrar, se diskussionen avsnittet och referens ^14.

1. För XY upplösning: använd 1024 x 1024 för en bra cellulär upplösning. Alternativt använda 512 x 512 för att reducera avbildningstiden, på bekostnad av upplösningen.
2. För Z upplösning: ställ in stegstorleks till 0,5-1,5 | im. Sänkning stegstorleken ökar Z upplösning men också avbildningstiden.

8. Visualisering av Confocal Data

1. Vänd stillbilder av tidpunkter på blombildning i en film.
   1. Öppna stillbilder (i JPEG- eller TIF-format) i programvaran (t.ex. Fiji).
   2. Gå till Bild> Staplar> bilder till stacken. De öppna bilderna kommer att grupperas i en stapel.
   3. Om ordningen på bilderna i bunten inte motsvarar den kronologiska ordningen, använd Stack Sorter plugin (Plugins> Staplar> Stack Sorter) för att ordna dem.
   4. Att vända bunten till en film, gå till Arkiv> Spara som> AVI.

Representative Results

Figur 2 visar olika vyer av konfokala Z-staplar av levande Arabidopsis blomknoppar uttrycker olika fluorescerande reportergener, och färgades med antingen propidiumjodid (figur 2, A-C5 och G) eller FM4-64 (figur 2, E1-F) till ger en tydlig cellulär upplösning. Flesta konfokala system möjliggöra avbildning av två fluoroforer med icke-överlappande emissionsspektra såsom GFP eller YFP tillsammans med antingen propidiumjodid eller FM4-64 (figur 2A - 2F). De bästa konfokala system är också i stånd att separera flera fluoroforer med delvis överlappande emissionsspektra i samma prover, såsom GFP och YFP, och dsRed och propidiumjodid (figur 2G).

Tre exempel på tidsförlopp experiment presenteras i figur2 och visar blomknoppar utvecklas normalt efter sepal ablation utfördes antingen med en laser ablation system (figur 2, C1-C5 och D1-D5) eller manuellt med ett stift-skruvstycke och ett metallstift (Figur 2, E1-E2). Notera att blomknopp som visas i figur 2, är E1-E2 från en övermänniska-1 mutant växt, vilket är anledningen till Carpel primordia inte observeras vid centrum av knoppen i skede 7. Laser ablation av framväxande sepal primordia av blomknopp visas i figur 2, C1-C5 hindrar dem från att täcka FM, som fortfarande kan avbildas vid steg 5 (figur 2, C5). Omvänt, i fallet med den blomknopp som visas i figur 2, D1-D5, laserablation endast fördröjd foderblad tillväxt, men växte foderblad så småningom att täcka större delen av FM på etapp 5 (figur 2, D5

Figur 2: Visualisering av konfokala Z-stackar av levande blomknoppar. A och B2 är vyer öppenhet; B1 och B4-G är maximala intensitets projektioner; B3 är en ortogonal slice vy. (A - E2) blommor som uttrycker en Venus reporter för APETALA3 genen (grön); cellväggar färgades med propidiumjodid (röd, med undantag för B4, grön). (A) Blomställning; Siffrorna anger Blom steg; foderblad i stadium 4 och 5 blommor filtrera ut fluorescensen hos Venus reportern, som normalt forms en ring. Observera att vissa blomknoppar visas lutas i förhållande till blomställningen. (B1 - B4) Fyra olika vyer av samma konfokala Z-stapel av ett stadium 5 blomknopp: maximal intensitet utsprång (B1 och B4) med Venus signalintensiteten kodas med pixelintensitet i den gröna färgen (B1) eller med eld färgkod (B4; färgkod visas längst ned på panelen); visa transparens (B2) och ortogonal slice vy (B3; XY, XZ och YZ orientering av skivorna indikeras i panelen). (C1 - C5) 4-dagars tidsförlopp av en enskild blomknopp från steg 3 till steg 5; laser ablationer (markerade som vita drag) utfördes på dag 1 och dag 3 var tillräckliga för att förhindra att foderblad från att täcka mitten av blomknopp i steg 5. (D1 - D5) 4-dagars tidsförlopp av en enskild blomknopp från skede3 till steg 5; laser ablationer utförda på dag 1, 2 och 3 var otillräckliga för att förhindra att foderblad från att täcka mitten av blomknopp. (E1 - E2) Individuell blomknopp efter manuellt avlägsnande av abaxial och adaxial foderblad (E1), och alla foderblad (E2); vita pilspetsar indikerar återstående foderblad; vita asterisker indikerar ärr till följd av avlägsnandet av foderblad. (F) -steget 7 apetala1-1 blomma som uttrycker en DR5-3xVenusN7 reporter ¹⁸ (grön); plasmamembran färgades med FM4-64 (röd); blå pilspetsar visar bladliknande strukturer som ersätter foderblad och inte täcker blomknopp. (G) Steg 4 blomknopp som uttrycker en fluorescerande GFP reporter för Dornröschen-LIKE ⁷ (grön), en Venus reporter för STÅLMAN (röd) och en dsRed reporter för CLAVATA3 ¹⁹ (cyan); cellerväggar färgades med propidiumjodid (grå). D-dagen; st: skede. Skalstrecken = 25 um; skala är identisk i B1, B2 och B4, i C1-C5 och i D1-D5. Denna figur modifierades från ¹⁴ referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här ger vi ett protokoll för avbildning av levande, utveckla Arabidopsis blomknoppar med ett konfokalmikroskop och en vattendoppning lins. Även om detta kan göras med antingen en upprätt eller inverterat mikroskop, är det lättare och snabbare att använda den förstnämnda. Det är också värt att notera att olika konfokala system varierar kraftigt när det gäller snabbhet, känslighet och förmåga att separera våglängder. De bästa konfokala mikroskop tillåter nu att avbilda flera olika kanaler (t.ex. GFP, YFP, dsRed och propidiumjodid; Figur 2G) i samma prover. Vissa konfokala mikroskop är utrustade med en spektral detektor, som kan samla fluorescensen från flera fluoroforer samtidigt och separera dem efteråt. Vid användning av en vanlig detektor, dock en uppsättning av lasrar och filter måste användas för att excitera och separera fluorescens från olika fluoroforer. Vissa fluoroforer har helt distinkta emissionsspektra (t.ex. GFP end YFP), och kan avbildas samtidigt. Andra fluoroforer har delvis överlappande emissionsspektra (t.ex. GFP och YFP), och vanligtvis måste avbildas separat, vilket ökar avbildningstiden. Avbildning close fluoroforer också kräver ofta att begränsa hur mycket av spektrumet samlas in för varje kanal för att förhindra fluorescens från en fluorofor från att läcka in i en annan kanal. Detta orsakar en förlust av intensitet av det insamlade signalen, vilket kan kompenseras genom en ökning av lasereffekt och förstärkningen. Emellertid kan förlängd imaging tid och ökad lasereffekt bleka och / eller skada provet. Ökad lasereffekt och / eller förstärkning kan också öka bakgrundsbruset. Optimering av signalintensitet, upplösning och avbildningstiden för varje prov görs genom en trial-and-error process, och involverar permanenta kompromisser.

Detta protokoll förklarar hur man spela live konfokal avbildning av blomknoppar utvecklas på sidorna av en dissekerade skott apex. Detkan hävdas att det faktum att skjuta spetsen inte är ansluten till resten av anläggningen och växer i ett medium som innehåller cytokininer skulle kunna påverka SAM och blomma utveckling. Emellertid var detta medium utformad empiriskt genom trial-and-error process för att säkerställa dissekerade skjuta apikala meristem producera nya blomknoppar vid normal plastochron, och att dessa blomknoppar utvecklas normalt ^15. Inte heller sepal dissektion verkar inte påverka genuttryck mönster eller utvecklingen i resten av blomman. Andra protokoll specificerar hur man utför levande konfokal avbildning av SAM fortfarande är fäst till resten av anläggningen (t.ex. ¹¹ referens). Sådana protokoll skulle kunna anpassas till, och erbjuda ett användbart alternativ för avbildning av att utveckla blommor, speciellt när man studerar cytokininglukuronider relaterade processer. De presenterar flera nackdelar dock: stammen förlängs och vändningar, och ändrar inriktningen av blomknoppar; ennd medan avbildning ett skott apex fäst till resten av anläggningen fungerar bra med en upprätt mikroskop, är det mycket mer komplicerat att göra det med ett inverterat mikroskop.

Dopp linser har en bättre numerisk apertur (NA) än "torra" linser (dvs. linser som är separerade från provet genom luft), och ger därmed en finare upplösning av provet, vilket är kritiskt när man använder ett konfokalt mikroskop. Med användning av en vatten-doppning lins tillhandahåller således en mycket bättre NA än en torr lins, samtidigt förhindra skott apex från dehydratisering under avbildningsprocessen. Medan glycerin och olje linser har en ännu högre NA än vatten linser, de kräver användning av ett täck, vilket är mycket opraktiskt med ett prov storleken på ett skott apex, som också fortsätter att växa under tidsförlopp experiment. Med tanke på storleken av proverna (beroende på blom steg, kan staplarna vara över 150 ^ m tjock), är det också viktigt att använda en lins med en lång arbetsavstånd. Vi använder typiskt en 20 eller 40X objektiv med ett NA på 1 och ett arbetsavstånd av 1,7-2,5 mm.

Konfokalmikroskop mjukvara erbjuder flera sätt att visualisera konfokala data, inklusive tredimensionella rekonstruktioner (Figur 2, B1, B2 och B4) och vyer slice (Figur 2, B3). Medan de mest vanligen använda tredimensionella vyer är maximala intensitets projektioner av de konfokala Z-stackar (Figur 2, B1 och B4), vissa program (t.ex. ZEN och Imaris) erbjuder också utsikt transparens som filtrerar bort signalen från de djupare delarna av provet (Figur 2, B2), vilket kan vara användbart när man tittar på processer som äger rum, eller gener som uttrycks i, det epidermala skiktet. Signalintensiteten kan antingen kodas med en enda färg (Figur 2, B1), med användning av pixel integrensity, eller med användning av en färgkod (Figur 2, B4).

Live konfokal avbildning erbjuder inte bara värdefulla kvalitativa insikter blomma utveckling, potentiellt ger också utvecklingsbiologer med en mängd kvantitativa data. Annorlunda mjukvara (t.ex. Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX ^{15, 20, 21)} möjliggör för kvantifiering av antalet eller volymen av celler som uttrycker en eller flera reportrar eller nivån av uttryck av en rapportörgen i olika celler. Sådan programvara kan också användas för att utföra automatisk cell segmentering, spåra cellhärkomster och kvantifiera tillväxt. Denna annorlunda mjukvara erbjuder liknande verktyg, men också skiljer sig på många sätt. MARS-ALT och MorphoGraphX utformades specifikt för växter ^{15, 20, 21,} till skillnad från Imaris ennd Fiji. MorphoGraphX ​​tillåter endast för segmentering och analys av epidermal lagret, medan Imaris och MARS-ALT möjliggöra segmentering och analys av hela provet. Kräver emellertid MARS-ALT den tidigare avbildning av samma prov från tre olika vinklar ^15, och Imaris kräver endast en enda stack. Tillgång till kvantitativ information är avgörande för att främja vår förståelse av blomutveckling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72701-D	Dumont Style 5 Inox, for apex dissection
Pin Vise	Ted Pella, Inc.	13560	80 cm long, for sepal ablation
Straight Stainless Steel Needles	Ted Pella, Inc.	13561-50	0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation
Round plastic boxes	Electron Microscopy Sciences	64332	transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes
Rectangular hinged boxes	Durphy Packaging Co.	DG-0730	transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile	VWR	25382-064	transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope
P10 and P1000 pipettes			with corresponding filter tips
Stereomicroscope			with an 80-90X maximum magnification
Laser ablation system			for sepal ablation
Laser scanning confocal microscope system
20 or 40X water-dipping lens			with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm
Agarose
Sucrose
Murashige and Skoog basic salt mixture	Sigma-Aldrich	M5524	without vitamins
Myo-inositol	Sigma-Aldrich	I7508	vitamin
Nicotinic acid	Sigma-Aldrich	N0761	vitamin
Pyridoxine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6280	vitamin
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1270	vitamin
Glycine	Sigma-Aldrich	G8790	vitamin
N6-Benzyladenine	Sigma-Aldrich	B3408	BAP, a cytokinin
Propidium iodide solution	Sigma-Aldrich	P4864	1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
FM4-64	Invitrogen	F34653	dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes