Summary
imagem confocal ao vivo fornece biólogos com uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a imagem confocal ao vivo de desenvolver flores Arabidopsis.
Abstract
O estudo do crescimento e desenvolvimento das plantas foi confiado por muito tempo em técnicas experimentais utilizando, tecidos fixados mortas e sem resolução celular adequada. Recentes avanços em microscopia confocal, combinados com o desenvolvimento de vários fluoróforos, têm superar esses problemas e abriu a possibilidade de estudar a expressão de vários genes simultaneamente, com uma boa resolução celular, em amostras vivas. imagem confocal ao vivo fornece biólogos de plantas com uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento, e tem sido amplamente utilizada para estudar o crescimento das raízes ea formação de órgãos laterais nos flancos do meristema apical atirar. No entanto, ele não tem sido amplamente aplicada ao estudo de desenvolvimento da flor, em parte devido aos desafios que são específicos para imagiologia flores, como as sépalas que crescem sobre o meristema flor, e filtrar a fluorescência dos tecidos subjacentes. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para executar imagem confocal ao vivo em directo, desenvolvendo árabeidopsis botões de flores, utilizando quer uma posição vertical ou um microscópio invertido.
Introduction
A maioria do corpo planta forma pós-embrionariamente de grupos de células-tronco situados na ou perto da ponta - ou meristemas apicais - dos brotos e raízes. Todas as estruturas acima do solo da planta adulta derivar a partir do meristema apical (SAM), o qual produz continuamente órgãos laterais nos flancos: folhas durante a fase vegetativa, e meristemas de flores (FMS), depois ele passa para a fase de reprodução. FMs, por sua vez desenvolver em flores. Enquanto o SAM Arabidopsis produz órgãos laterais, uma de cada vez, num padrão repetitivo, espiral, o FMS produzir quatro tipos de órgãos florais dentro de quatro espirais, de uma maneira parcialmente síncrono, com vários programas de desenvolvimento desvendar simultaneamente. As redes genéticas subjacentes à especificação da identidade dos diferentes órgãos florais foram parcialmente decifrado (para revisões, ver referências 1, 2), mas muitos aspectos da developme flornt, tal como o posicionamento dos órgãos florais e a definição de limites entre giros, permanecem pouco compreendidos.
Estudos genéticos moleculares iniciais de desenvolvimento da planta confiou na técnicas tais como hibridação in situ e repórteres de GUS para analisar a expressão do gene. Embora estes métodos têm proporcionado uma riqueza de informações e contribuíram muito para a nossa compreensão do crescimento da planta e desenvolvimento da flor, existem limitações importantes: eles não têm boa resolução celular, não permitir a fácil observação do padrão de múltiplos genes expressão na mesma amostras, e mais importante, apenas pode ser aplicado a tecidos mortos, fixos. Recentes avanços em microscopia confocal têm superar essas limitações, e fornecer os biólogos do desenvolvimento com uma ferramenta poderosa para investigar os processos de morfogênese planta subjacente. Em particular, a microscopia confocal permite a observação de tecidos vivos e órgãos ao longo da sua formação, que é critical para compreender plenamente um processo essencialmente dinâmico, como o desenvolvimento.
Imagem confocal vivo tem sido extensivamente utilizado para analisar o crescimento aéreo de plantas e a produção de órgãos laterais pelo SAM (por exemplo referências 3, 4, 5, 6), mas com a excepção de alguns relatórios (por exemplo, as referências 7, 8, 9, 10), ele não tem sido amplamente aplicada para o estudo de desenvolvimento da flor. Protocolos para imagem confocal ao vivo do SAM estão disponíveis (por exemplo, faz referência 11, 12), e fornecer uma boa base para a representação do botões florais em desenvolvimento que cercam o SAM. No entanto, botões florais de imagem apresenta desafios específicos: por exemplo,botões de flores rapidamente tornar-se maior do que o SAM, e a fase 4, sépalas começar a cobrir os (FM fases como descrito na referência 13), e escurecimento da fluorescência a partir de tecidos subjacentes (Figura 2A). Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado explicando como realizar imagem confocal ao vivo no desenvolvimento de botões florais de Arabidopsis usando uma posição vertical ou um microscópio invertido e uma lente de água-dipping. Nós publicado anteriormente este protocolo em referência 14.
Protocol
1. Mídia e pratos de preparação
- Prepare dissecando pratos preenchendo caixas rodada de plástico (aproximadamente 6 cm de largura, 2 cm de profundidade) de 0,5 cm de altura com 2% de agarose.
- Prepare imagiologia pratos.
- Para um microscópio confocal vertical, encher plástico rectangular articulada caixas (cerca de 7 cm de comprimento, 4,5 cm de largura, 3 cm de profundidade) de 0,5 cm com meio de imagem (ver secção 1.3, "meio de imagem"; Figura 1F).
- Para um microscópio confocal invertido: encher pequena placa de Petri (aproximadamente 3,5 cm de largura, 1 cm de profundidade) exactamente até a borda com meio de imagem (ver secção 1.3, "meio de imagem"; Figura 1G).
- Prepare meio de imagem.
- Para imagem de ponto único, usar 1% de agarose.
- Para as experiências de lapso de tempo, utilizar meio de crescimento vértice (0,5 x Murashige e Skoog mistura de sal basal sem vitamina, 1% de sacarose, 0,8% de agarose, pH 5,8 com hidróxido de potássioe solução, suplementado com vitamina [0,01% de mio-inositol, 0,0001% de ácido nicotínico, 0,0001% de cloridrato de piridoxina, cloridrato de tiamina 0,001%, 0,0002% de glicina] e citocinina [500 nM N6-benziladenina]) 15.
2. Crescimento de Plantas
- Semear as sementes esterilizadas em placas MS (0,5 ou mistura de sais basais de Murashige e Skoog 1x sem vitamina, 0,8% de ágar, pH 5,8 com solução de hidróxido de potássio) com uma selecção apropriada. placas lugar no dia longo (16 horas de luz) ou contínuo dia, 16-22 ° C Condições para duas semanas.
- O transplante das plântulas em solo com espaçamento suficiente para permitir o desenvolvimento robusto. Coloque plantas em dia curto, 16-22 ° C Condições de três semanas.
NOTA: O cultivo de plantas em dia longo ou condições de dia contínua directamente após o transplante resulta na floração precoce e inflorescências que são menos vigorosa, e muito mais difícil de dissecar. Da mesma forma, deixando plantas sob curto Condit diaiões para mais do que três semanas resulta em dia floração independente de comprimento e inflorescências que são menos vigorosa. - Transferir as plantas para o dia longo (16 horas de luz) ou contínuo dia, 16-22 ° C Condições até florirem. ápices são mais fáceis de dissecar quando a inflorescência é 2-10 cm de comprimento.
3. Dissecção do rebento Apex
- Opcional: Usando uma pedra de afiar fina e uma gota de óleo leve, aguçar a fórceps sob o microscópio estereoscópico para torná-los blade-like, não apontar-like.
- Remover siliques, botões de flores mais velhas e inflorescências secundárias da inflorescência principal empurrando a base dos pedúnculos com a pinça até quebrar. Remover como muitas flores quanto possível sem ampliação (figura 1, comparar A e B).
- Usando fórceps, perfure um furo vertical na agarose de um prato de dissecação, cortados nos últimos 0,5 cm da inflorescência e colocá-lo na vertical, em que a agarose. O restantebotões de flores deve ser acima da superfície da agarose.
- Encha o prato de imagem com estéril, água deionizada para que o ápice shoot está totalmente imerso. Colocar o prato de dissecação, ao microscópio estereoscópico, e remover o ar aprisionado em torno do vértice filmagem, criando jactos de água com uma pipeta de 1000? L (Figura 1, comparar C e D).
- Sob o microscópio estereoscópico, usar os fórceps para remover botões de flores que não está a ser trabalhada, empurrando a base do pedúnculo ou a parte superior da gema até à ruptura do pedúnculo (Figura 1E). É importante que os pedúnculos quebrar limpa na junção com a haste, como pedúnculos sobra dificultar a remoção dos jovens botões florais.
- Se imagiologia apenas botões de flores de fase 5 e mais jovens (Figura 2A), remover a água antes dissecando fase 6-8 botões de flores. Se as flores em botão de imagem Fase 5 e mais velhos, proceder à ablação sepal (ver secção 5.1). Caso contrário, proCEED para o passo 3.7.
- Usando fórceps, perfurar um furo vertical na forma de um prato de imagem, e manter a posição vertical ápice dissecados no meio, de modo que apenas o meristema apical e brotos de flores circundantes estão acima da superfície do meio. Dependendo de qual broto (s) flor estão a ser trabalhada, pode ser necessário para inclinar ligeiramente a amostra, tal como botões de flores não estão necessariamente orientadas exactamente como a haste (Figura 2A).
- Avance para manchar a amostra se necessário. Se não coloração e / ou imagem da amostra imediatamente, adicionar água e fechar o prato de imagens para evitar a desidratação. Se estiver usando um microscópio invertido, coloque o prato de imagem em uma caixa de plástico transparente e fechá-lo.
Figura 1: Preparação dos ápices atirar para imagem confocal ao vivo. (A - E) de uma dissecçãoatirar ápice para a imagem latente. Inflorescência antes (A) e depois (B) a remoção de siliques e flores mais velhas. (C - D) Tiro ápice imerso em água no prato de dissecação, com uma bolha de ar presa na ponta (C) e depois da remoção da bolha de ar (D). (E) Atire ápice no prato de dissecação, após dissecção de botões florais com mais de estágio 5. (F - G) Visão de ápices no prato de imagem, no palco de um microscópio confocal vertical (F) e invertida (G) . Em (F), uma lente de água-imersão 40X está posicionado acima de um dos vértices, com a ponta da lente imerso em água. Em (G), o vértice filmagem é posicionado de cabeça para baixo por cima da lente da água de imersão-40X, com uma coluna de água que liga o meio de imagem para a ponta do cristalino. O painel mais pequeno em (F) mostra uma higsua visão de ampliação da área no retângulo vermelho, com um ápice shoot inserido no meio de imagem; linhas vermelhas e azuis indicam a superfície do meio e água, respectivamente. (H - I), Exemplos de dispositivos feitos por medida, que permitem a adição de mais água na ponta da lente água-imersão: uma manga de borracha de silicone feita a partir de um arranque a vela de ignição (H), e uma manga improvisada feita a partir do dedo de um luva de látex sem pó (G). Barras de escala = 0,5 cm em (A) e (B), de 0,1 cm em (C) e (D), e 100 ^ m em (E). Esta figura foi inicialmente publicada em 14 de referência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. coloração
NOTA: As paredes celulares ou membranas de plasma podem ser coradas com iodeto de propio ou FM4-64, respectivamente, para obter uma resolução celulardurante a imagiologia. Alternativamente, as linhas de repórter com proteínas fluorescentes marcadas para a membrana de plasma pode ser utilizado 6, 16.
- Remover a água do prato de imagem, e assegurar que a superfície do meio é seco para evitar a diluição do corante.
- Sob o microscópio estereoscópico, aplicam-se 20 a 30 uL de 1 mg / mL solução de iodeto de propídio, ou 80 ug / ml solução FM4-64 para o ápice dissecados com uma pipeta de 10 mL. Certifique-se de toda a amostra está coberto de tinta para garantir uma coloração homogênea.
- Manchar durante 2 minutos, se utilizando iodeto de propio, 20 min ou se utilizando FM4-64.
- Lavar duas vezes com água estéril, desionizada.
5. Sepal Ablação
NOTA: No estágio 4, primórdios das sépalas começar cobrindo a FM. À medida que crescem, que filtram a fluorescência a partir de tecido subjacente, e dificultar o processo de imagiologia. Sépalas pode ser removido manualmente utilizando um pino de metal Mounted em um pino-vise, ou impedidos de crescer utilizando ablação a laser no primórdio sépalas emergente. Alternativamente, é possível em alguns casos utilizar mutantes, tais como apetala1-1, em que sépalas estão ausentes ou substituídos por órgãos semelhantes a folhas que não cobrem o FM enquanto a parte central da flor se desenvolve normalmente (Figura 2F) 17.
- Ablação Sépala em botões de flores fase 5 e mais velhos usando um pino torno segurando uma agulha de metal linear (Figura 2, E1-E2)
- Coloque o prato de dissecação com o ápice dissecadas sob o microscópio estereoscópico, e definir a ampliação para máximo. Mergulha-se o ápice de rebentos em água estéril, desionizada, ou em alternativa, utilizar uma pipeta de 1000 mL para aplicar água para o ápice filmagem regularmente enquanto dissecando as sépalas.
- Com a extremidade do pino do torno, posicionar o pino na parte superior do sépalas abaxial, tangencialmente em relação ao vértice filmagem. Com cuidado, empurre a sépala longe do ápice shoot até que rompedo botão de flor.
- Proceda da mesma forma com a sépala adaxial, mas empurrar a sépala em direção ao ápice atirar.
- Continuar de modo semelhante com as sépalas laterais, mas a posição do pino radialmente em relação ao vértice da parte aérea, e empurrar os sépalas para o lado, para longe do botão de flor.
- Mergulha-se o ápice de rebentos em água estéril, desionizada durante alguns minutos, para evitar a desidratação.
- A ablação de primórdios de sépalas na fase de 3-4 (Figura 2, C5-D5)
- Colocar a cápsula de imagem com o vértice manchado, dissecado na platina do microscópio confocal. Localize e foco no ápice como se estivesse se preparando para a imagem (ver secção 6, "Configuração de imagem").
- Utilizando o software de sistema de ablação a laser, definir a zona de ablação, que corresponde à crista e ponta da primórdios sépalas emergente antes de começar a cobrir o meristema flor (tipicamente, na fase 3 para sépalas abaxial e adaxiais, e no fim da fase 3 / cedo fase 4 para se lateraisamigos).
- Definir a potência do laser e tempo de moradia com parâmetros adequados para retirar células suficientes sem infligir muito dano aos tecidos subjacentes. Normalmente, dependendo do sistema de ablação a laser utilizado, os parâmetros apropriados precisa inicialmente ser identificado através de um processo de tentativa e erro para garantir que as células suficientes são removidos para evitar as sépalas para crescer posteriormente sobre o FM, sem afetar o resto da flor bud. Usando muita potência do laser e habitação tempo resulta em danos para o centro da flor, afetando o seu crescimento e / ou sobrevivência. Uma vez que os parâmetros corretos foram identificados, eles podem ser reutilizados para experimentos posteriores.
NOTA: Se a ablação inicial revelar insuficiente, é possível proceder a uma segunda ablação nos dias seguintes (figura 2, C4 e D2).
6. Configuração de imagem
- Use um microscópio vertical.
NOTA: Quando imagem com um microscópio vertical, vários ápices pode ser colocado no mesmo prato de imagem. No entanto, se o processo de imagem dura mais do que uma hora, iodeto de propio tende a ser diluído, e algumas amostras pode precisar de re-colorao antes da imagiologia. - Colocar a cápsula de imagem na platina do microscópio (Figura 1F). Diminuir a lente água-imersão e elevar a mesa de modo que a ponta do cristalino mergulha na água. Proceder com cautela, de modo a não esmagar os ápices dissecados ou mergulhar a lente para o meio de geração de imagens.
- Se uma bolha de ar está preso na ponta da lente, fazer jactos de água com uma pipeta de 1000 mL para removê-lo.
- Sob iluminação de epifluorescência, posição de um dos vértices dissecados no campo da lente usando o con XYtroller. Olhe pelas oculares e focar a amostra usando o controlador Z. Proceder com cautela para não esmagar a amostra.
- Usando o software microscópio confocal, zoom no botão de flor a ser trabalhada, e proceder à imagiologia sua amostra.
- Usando uma pipeta de 1000 uL, colocar uma gota de água estéril, desionizada na ponta da lente.
- Segure o prato de imagem de cabeça para baixo, e com uma pipeta de 1000 mL, adicione uma gota de água estéril, deionizada ao ápice dissecado.
- Colocar a cápsula de imagem de cabeça para baixo sobre a platina do microscópio (Figura 1G). Proceder com cautela para não esmagar a amostra.
- Sob iluminação de epifluorescência, posicionar o vértice dissecados sobre a ponta da lente usando o controlador XY. Com o controlador Z, cuidadosamente baixar a fase até a amostra atingir a gota de água na ponta da lente. Uma coluna de água deve formar between a ponta da lente e o meio.
- Se a coluna de água não forma, adicione cuidadosamente uma gota de água para a amostra com uma pipeta de 1000 mL. Adicionar mangas improvisados para a lente, a fim de adicionar mais água, na sua ponta, o que facilita o estabelecimento e manutenção da coluna de água (Figura 1H e 1I).
- Sob iluminação de epifluorescência, olhar pelas oculares e focar a amostra usando o controlador Z. Proceder com cautela para não esmagar a amostra.
- Usando o software microscópio confocal, zoom no botão de flor a ser trabalhada, e prossiga para a imagem da amostra.
NOTA: Enquanto as células em desenPing órgãos florais pode dividir mais rápido, as células na divisão meristema floral uma ou duas vezes a cada segundo dia, e linhagens celulares são fáceis de controlar com pontos de tempo a cada 24 h. No entanto, se for necessário, é possível para a imagem das amostras a cada seis horas.
7. Considerações sobre os parâmetros de imagem
NOTA: Como configurar os parâmetros de imagem depende muito o sistema confocal usado. Abaixo estão sugestões de alguns desses parâmetros que podem ser usados com qualquer microscópio confocal. Para mais considerações sobre os parâmetros de imagem, consulte a seção Discussão e referência 14.
- Para a resolução XY: use 1.024 x 1.024 para uma boa resolução celular. Como alternativa, use 512 x 512 para reduzir o tempo de imagem, em detrimento da resolução.
- Para a resolução Z: definir o passo de tamanho de 0,5-1,5 | im. Baixando o passo tamanho aumenta a resolução Z, mas também o tempo de imagem.
8. A visualização de dados confocal
- Transformar imagens estáticas de pontos no tempo de desenvolvimento da flor em um filme.
- Abra as imagens fixas (em formato jpeg ou tif) no software (por exemplo, Fiji).
- Vá em Image> Pilhas> Imagens de pilha. As imagens abertas serão agrupadas em uma pilha.
- Se a ordem das imagens na pilha não correspondem à ordem cronológica, usar o plugin Stack Sorter (Plugins> Pilhas> Stack Sorter) para reordená-las.
- Para ligar a pilha em um filme, vá em File> Save As> AVI.
Representative Results
A Figura 2 apresenta vistas de diferentes confocal Z-pilhas de botões de flores de Arabidopsis vivas que expressam diferentes genes repórter fluorescentes, e coradas com iodeto de propídio (Figura 2, A-C5 e G) ou FM4-64 (Figura 2, E1-F) para fornecer uma resolução celular clara. A maioria dos sistemas confocais para permitir a imagiologia de dois fluororos com não-sobreposição espectros de emissão, tais como GFP ou YFP em conjunto com qualquer um iodeto de propio ou FM4-64 (Figura 2A - 2F). Os melhores sistemas confocais também são capazes de separar vários fluoróforos com espectros de emissão que se sobrepõem parcialmente nas mesmas amostras, tais como GFP e YFP, e dsRed e iodeto de propio (Figura 2G).
Três exemplos de experiências de lapso de tempo são apresentados na Figura2 e mostram botões de flores em desenvolvimento normalmente após a ablação sépalas foi realizada quer com um sistema de ablação por laser (Figura 2, C1-C5 e D1-D5) ou manualmente com um pino do torno e um pino de metal (Figura 2, E1-E2). Note-se que o botão da flor mostrado na Figura 2, E1-E2 é a partir de uma planta mutante super-homem-1, que é por isso primórdios carpelo não são observados no centro da gema na etapa 7. A ablação por laser de emergente primórdios sépalas do botão de flor mostrado na Figura 2, C1-C5 impede-os de que cobre o modo FM, que ainda pode ser trabalhada no estádio 5 (Figura 2, C5). Por outro lado, no caso do botão de flor mostrado na Figura 2, D1-D5, ablação por laser só atrasou o crescimento sépalas, mas sépalas eventualmente cresceu para cobrir a maior parte da fase de FM por 5 (Figura 2, D5
Figura 2: Visualização de confocal Z-pilhas de botões de flores ao vivo. A e B2 são vistas de transparência; B1 e B4-G são projecções de intensidade máxima; B3 é uma vista em corte ortogonal. (A - E2) flores que expressam um repórter Vénus para o gene APETALA3 (verde); paredes das células foram coradas com iodeto de propio (vermelho, excepto para B4, verde). (A) A inflorescência; números indicam estágios florais; sépalas, na fase 4 e 5 flores filtrar a fluorescência do repórter Vénus, que normalmente forms um anel. Note-se que alguns botões florais aparecem inclinado em comparação com a inflorescência. (B1 - B4) Quatro vistas diferentes do mesmo confocal Z-pilha de um botão de fase 5 flor: projecções de intensidade máxima (B1 e B4) com uma intensidade de sinal Vénus codificada com intensidade de pixel na cor verde (B1) ou com o código de cor fogo (B4; código de cor é mostrada na parte inferior do painel); vista transparência (B2) e vista fatia ortogonal (B3; a orientação XY, XZ e YZ das fatias é indicada no painel). (C1 - C5) 4-dia com intervalo de tempo de um botão de flor individual a partir estados 3 e 5; ablação por laser (marcados como traços brancos) realizada no dia 1 e no dia 3 foram suficientes para impedir que os sépalas de cobrir o centro do botão de flor na etapa 5. (D1 - D5) 4-dia com intervalo de tempo de um botão de flor do indivíduo etapa3 a fase 5; ablação por laser registo realizados no dia 1, 2 e 3 eram insuficientes para impedir que as sépalas de cobrir o centro do botão de flor. (E1 - E2) botão de flor individual após a remoção manual da abaxial e sépalas adaxiais (E1), e de todos os sépalas (E2); setas brancas indicam sépalas restantes; asteriscos brancas indicam cicatrizes resultantes da remoção das sépalas. (F) fase 7 flor apetala1-1 que expressa um repórter DR5-3xVenusN7 18 (verde); membranas de plasma foram coradas com FM4-64 (vermelho); setas azuis indicam as estruturas de folha-like que substituem sépalas e não cobrem o botão de flor. (L) Fase 4 botão de flor que expressa um repórter GFP fluorescente para Dornröschen-COMO 7 (verde), um repórter para Vénus SUPERMAN (vermelho) e um repórter para dsRed CLAVATA3 19 (ciano); célulasparedes foram coradas com iodeto de propídio (cinzento). d: dias; r: fase. Barras de escala = 25? m; escala é idêntico em B1, B2 e B4, em C1-C5 e D1-D5, em. Esta figura foi modificado a partir de referência 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aqui, nós fornecemos um protocolo para a imagem de, em desenvolvimento de Arabidopsis botões de flores ao vivo com um microscópio confocal e uma lente de água-dipping. Enquanto isso pode ser feito com qualquer um pé ou um microscópio invertido, é mais fácil e rápido de usar o antigo. É também importante notar que diferentes sistemas confocais variar significativamente em termos de velocidade, sensibilidade, e a capacidade de separar os comprimentos de onda. Os melhores microscópios confocais agora permitir a imagem vários canais diferentes (por exemplo, GFP, YFP, dsRed e iodeto de propidio; Figura 2G) nas mesmas amostras. Alguns microscópios confocal estão equipados com um detector espectral, que pode coletar a fluorescência de diversos fluoróforos simultaneamente e separá-los depois. Ao usar um detector regular, no entanto, um conjunto de lasers e filtros devem ser usados para excitar e separar a fluorescência de fluoróforos diferentes. Alguns fluoróforos têm espectros de emissão totalmente distinta (por exemplo, um PCPd YFP), e podem ser visualizados simultaneamente. Outros fluoróforos têm espectros de emissão de sobreposição parcial (por exemplo, GFP e YFP), e geralmente têm de ser trabalhada separadamente, o que aumenta o tempo de imagiologia. Imagiologia de fluoróforos perto também muitas vezes requer a restrição quanto do espectro é recolhido para cada canal para evitar fluorescência de um fluoróforo a partir de vazando para outro canal. Isto provoca uma perda da intensidade do sinal recolhido, o que pode ser compensado por um aumento da potência do laser e ganho. No entanto, o tempo de imagiologia prolongada e aumentou a potência do laser pode branquear e / ou danificar a amostra. potência do laser aumentado e / ou ganho também pode aumentar o ruído de fundo. Otimização da intensidade do sinal, resolução e tempo de imagem para cada amostra é feito através de um processo de tentativa e erro, e envolve trade-offs permanentes.
Este protocolo explica como executar imagem confocal ao vivo de botões florais em desenvolvimento nos flancos de um ápice shoot dissecado. istoPode-se argumentar que o fato de que o ápice shoot não está ligado ao resto da planta e cresce em meio contendo citocininas podem afetar SAM e desenvolvimento da flor. No entanto, este meio foi concebido empiricamente através de um processo de tentativa e erro para garantir a atirar dissecado meristemas apicais produzir novos botões florais no plastocrono normal, e que estes botões florais desenvolver normalmente 15. Da mesma forma, dissecção sepal não parece afetar os padrões de expressão de genes ou o desenvolvimento do resto da flor. Outros protocolos detalhes como realizar imagiologia confocal vivo do SAM ainda ligado ao resto da planta (por exemplo 11 de referência). Tais protocolos poderia ser adaptada para, e oferecer uma alternativa útil para a imagem latente de desenvolver flores, especialmente quando o estudo dos processos relacionados com a citoquinina. Eles apresentam contudo várias desvantagens: os alonga-tronco e torções, e altera a orientação dos botões de flores; umand enquanto a imagem de um ápice shoot ligado ao resto da planta funciona bem com um microscópio vertical, é muito mais complicado fazê-lo com um microscópio invertido.
Lentes de imersão tem uma melhor abertura numérica (NA) do que as lentes "seco" (isto é, lentes que são separados da amostra de ar), e, por conseguinte, proporcionar uma resolução mais fina da amostra, o que é crítico quando se utiliza um microscópio confocal. Usando uma lente de água-imersão, assim, fornece uma muito melhor do que uma lente de NA seco, evitando o ápice filmagem de desidratação durante o processo de imagiologia. Enquanto glicerina e lentes de petróleo têm uma NA ainda maior do que as lentes de água, eles requerem o uso de uma lamela, que é muito pouco prático com uma amostra do tamanho de um ápice shoot, que também continua crescendo durante as experiências de lapso de tempo. Dado o tamanho das amostras (de acordo com as fases florais, pilhas pode ser superior a 150 um de espessura), que também é importante usar uma lente com uma distância de trabalho. Normalmente, utilizar uma lente de 20 ou 40X com NA de um e uma distância de trabalho de 1,7-2,5 mm.
Software microscópio confocal oferece várias formas de visualizar dados confocal, incluindo reconstruções tridimensionais (Figura 2, B1, B2 e B4) e vistas fatia (Figura 2, B3). Enquanto as vistas tridimensionais mais vulgarmente utilizados são projecções máximos de intensidade de z-pilhas confocal (Figura 2, B1 e B4), alguns de software (por exemplo, ZEN e Imaris) também proporcionam vistas de transparência que filtra o sinal a partir das partes mais profundas de a amostra (Figura 2, B2), o que pode ser útil quando se olha para processos que tomam lugar, ou genes expressos em, a camada epidérmica. A intensidade do sinal pode ser codificada com uma única cor (Figura 2, B1), utilizando pixels intensity, ou utilizando um código de cor (Figura 2, B4).
imagem confocal ao vivo não só oferece insights qualitativos valiosas sobre o desenvolvimento da flor, mas também potencialmente fornece os biólogos do desenvolvimento com uma riqueza de dados quantitativos. Software diferente (por exemplo Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permite a quantificação do número ou o volume de células que expressam um ou vários repórteres, ou o nível de expressão de um repórter em células diferentes. Esse software também pode ser usado para realizar segmentação automático de células, rastrear linhagens de células e quantificar o crescimento. Este software diferente oferece ferramentas similares, mas também difere de muitas maneiras. MARS-ALT e MorphoGraphX foram concebidos especificamente para as plantas 15, 20, 21, ao contrário de um Imarisnd Fiji. MorphoGraphX permite apenas a segmentação e análise da camada de epiderme, enquanto Imaris e MARS-ALT permitir a segmentação e análise de toda a amostra. No entanto, MARS-ALT requer a imagem antes de a mesma amostra de três ângulos diferentes 15, e Imaris requer apenas uma única pilha. O acesso à informação quantitativa é fundamental para promover nossa compreensão do desenvolvimento da flor.
Disclosures
O autor não tem nada a divulgar.
Acknowledgments
O autor gostaria de agradecer a Prof. Elliot M. Meyerowitz por seu apoio e comentários sobre o manuscrito, assim como Ann Lavanway no Dartmouth College e Dr. Andres Collazo no Facility Imagem Biológica em Caltech por sua ajuda na resolução de problemas técnicos com o imagem confocal ao vivo. O trabalho de Nathanaël Prunet é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, através Grant R01 GM104244 para Elliot M. Meyerowitz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90X maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40X water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
References
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