Summary
라이브 공 촛점 이미징 개발을 연구하는 강력한 도구로 생물 학자를 제공합니다. 여기, 우리 애기 꽃을 개발하는 라이브 공 촛점 이미징에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
식물의 성장과 발전의 연구는 긴 죽은, 고정 된 조직을 사용하고 적절한 세포 해상도가 부족한 실험 기술에 의존하고있다. 많은 형광 물질의 개발과 함께 공 초점 현미경의 최근 발전은 이러한 문제를 극복 라이브 샘플에서 좋은 세포 해상도, 동시에 여러 유전자의 발현을 연구 할 수있는 가능성을 열었다. 라이브 공 촛점 이미징 개발을 연구하는 강력한 도구로 식물 생물학을 제공하고, 광범위하게 뿌리 성장과 촬영 정단 분열 조직의 측면에 측면 기관의 형성을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, 널리 때문에 같은 꽃 분열 조직을 통해 성장 꽃받침 같은 꽃, 이미징 및 기본 조직에서 형광을 필터링 할 특정 문제에 부분적으로 꽃 개발의 연구에 적용되지 않았습니다. 여기, 우리는 아랍을 개발, 라이브 라이브 공 촛점 이미징을 수행하기 위해 상세한 프로토콜을 제시수직 또는 거꾸로 현미경을 사용하여 idopsis 꽃 봉오리.
Introduction
또는 정단 분열 조직 - - 싹과 뿌리의 식물체의 대부분은 줄기 끝이나 근처에 위치한 세포의 그룹에서 포스트 embryonically 형성한다. 생장 단계에서 잎과 꽃 분열 조직 FMS ()는 생식 단계로 전환 후 : 어른 공장의 모든 지상 구조는 지속적으로 측면에 측면 장기를 생산하는 촬영 정단 분열 조직 (SAM)에서 파생. 차례로 FM에 꽃으로 개발한다. 아라비돕시스 SAM 한번에 측 장기 하나를 생성하는 동안, 반복, 나선형 패턴, FM에 여러 개발 프로그램을 동시에 탈피하여, 부분적으로 동시 방식으로 나선 부 내의 네 꽃 기관의 네 가지 유형을 생성한다. 다른 꽃 기관의 정체성의 사양을 기본 유전자 네트워크는 부분적으로 꽃 developme에의,하지만 여러 측면 (리뷰를 위해, 참고 문헌 1, 2 참조) 해독 된NT, 같은 꽃 장기 위치와 나선 부 사이의 경계의 정의로, 제대로 이해 남아 있습니다.
식물 개발의 초기 분자 유전 학적 연구는 주로 같은 유전자 발현을 분석하는 현장 하이브리드 및 GUS 기자의 같은 기술에 의존했다. 이러한 방법은 풍부한 정보를 제공하고 크게 식물의 성장과 꽃 개발에 대한 우리의 이해에 기여하고 있지만, 중요한 제한 사항이 있습니다 : 그들은 좋은 셀룰러 해상도 부족, 같은 여러 유전자의 발현 패턴의 관찰이 쉬운을 허용하지 않습니다 샘플, 그리고 중요한 것은, 오직 죽은, 고정 된 조직에 적용 할 수 있습니다. 공 초점 현미경의 최근 발전은 이러한 한계를 극복하고, 프로세스를 기본 식물의 형태 형성을 조사 할 수있는 강력한 도구로 발달 생물 학자를 제공했다. 특히, 공 초점 현미경은 C가 자신의 형성에 걸쳐 라이브 조직과 장기의 관찰이 가능완전히 같은 개발 등의 정수를 보여주는 역동적 인 과정을 이해하기 ritical.
라이브 촛점 촬상 광범위하게 (예를 들어 참고 문헌 7, 8의 (예를 들어, 3 참조 4, 5, 6), 그러나 약간의 보고서를 제외하고 SAM에 의해 식물의 공중 성장 횡 기관의 생산을 분석하는 데 사용 된 9, 10), 널리 꽃 개발의 연구에 적용되지 않았습니다. 샘의 라이브 공 촛점 이미징을위한 프로토콜 (예, 12 11 참조) 사용할 수 있으며, SAM을 둘러싸는 방법을 이미지로 개발 꽃 봉오리를위한 좋은 기반을 제공합니다. 그러나, 영상 꽃 봉오리가 특정 과제 제시 : 예를 들어,꽃 봉오리 신속 SAM보다 크게되고, 스테이지 (4)에서, 꽃받침은 (기준 13에 기재된 바와 같이 단계)이 FM을 피복하고, 조직을 (도 2A)를 하부에서 형광 디밍 시작. 여기, 우리는 똑바로 또는 거꾸로 현미경과 물에 침지 렌즈를 사용 애기 꽃 봉오리 개발에 라이브 공 촛점 이미징을 수행하는 방법을 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 이전에 참조 (14)이 프로토콜을 발표했다.
Protocol
1. 미디어와 요리 준비
- 2 % 아가로 오스를 0.5 cm (2 cm 깊이 약 6 cm 폭) 둥근 플라스틱 상자 채움으로써 요리 해부 준비한다.
- 요리를 이미징 준비합니다.
- 직립 공 촛점 현미경 직사각형 플라스틱 촬상 매체와 0.5 cm 내지 (3 cm 깊이 4.5 cm, 폭 약 7cm 길이) 박스 힌지 기입 (섹션 1.3 참조, "이미징 매체";도 1F).
- 반전 된 공 초점 현미경 : 정확하게 촬상 매체와 모자 챙 (약 3.5 cm 폭 1cm 깊이) 작은 페트리 접시를 채우기 (섹션 1.3 참조, "이미징 매체";도 1G).
- 영상 매체를 준비합니다.
- 단일 지점 이미징의 경우, 1 % 아가로 오스를 사용합니다.
- 시간 경과 실험 칼륨 hydroxid 정점으로 성장 배지 (비타민없이 0.5X 무라 시게 및 스쿡 바살 염 혼합물을 1 % 수 크로즈, 0.8 % 아가, pH가 5.8를 사용비타민 [0.01 %의 미오 - 이노시톨, 0.0001 % 니코틴산 0.0001 %의 피리독신 염산염, 티아민 염산염 0.001 %, 0.0002 % 글리신] 및 시토키닌 [500 nM의 N6-benzyladenine]) (15)로 보충 E 용액.
2. 식물 성장
- 적절한 선택에 MS 판 (비타민없이 0.5 1X 무라 시게 및 스쿡 바살 염 혼합물을 0.8 % 한천, 수산화 칼륨 용액으로 pH 5.8)에 무균 종자를 뿌리고. 긴 일 (16 시간 빛) 또는 연속 일에 배치 판, 2 주 동안 16 ~ 22 ° C의 조건.
- 충분한 간격 토양 위에 이식 모종 강력한 개발을 허용합니다. 짧은 하루에 장소 공장, 3 주간 16 ~ 22 ° C 조건.
참고 : 직접 조기 꽃 덜 활발하고 해부하기가 훨씬 더 어렵다 화서 결과 이식 후 긴 하루 또는 연속 일 조건에서 식물을 성장. 이와 유사하게, 짧은 일 CONDIT에서 식물을 떠나3 개 주 이상 하루 길이에 관계없이 꽃의 결과와 덜 활발하다 화서에 대한 이온. - 긴 하루 (16 시간 등) 또는 연속 일에 전송 식물들은 꽃까지 16 ~ 22 ° C 조건. 꽃차례는 2-10cm 긴 경우 촬영의 정점은 해부하기 쉬운 있습니다.
촬영 에이펙스 3. 해부
- 옵션 : 고급 선명 돌과 빛 오일 한 방울을 사용하여, 포인트 같은하지, 그들이 칼날처럼 만들기 위해 실체 현미경 아래 집게를 선명하게.
- 그들이 깰 때까지 집게와 꽃자루의 기반을 밀어 차 꽃이 핌에서 siliques, 오래된 꽃 봉오리 및 보조 화서를 제거합니다. (A와 B를 비교하고,도 1) 배율없이 가능한 한 많은 꽃을 제거한다.
- 핀셋, 해부 접시의 아가로 오스 피어스 수직 구멍을 사용하여, 꽃이 핌의 마지막 0.5 cm를 차단하고 아가로 오스에 수직으로 붙어. 나머지꽃 봉오리는 아가로 오스 표면 위에 있어야합니다.
- 촬영의 정점 완전히 몰입되도록 멸균, 탈 이온수로 영상 접시를 채우십시오. (C 및 D를 비교하고,도 1)을 실체 현미경 해부 접시를 배치하고, 1,000 μL 피펫 워터 제트를 생성하여 촬영 에이펙스 주위 갇힌 공기를 제거한다.
- 입체 현미경 하에서, 꽃자루의 기본 또는 꽃자루 나누기 (그림 1E)까지 꽃 봉오리의 상단에 밀어, 촬영되지 않은 꽃 봉오리를 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 남은 꽃자루가 젊은 꽃 봉오리의 제거를 방해로 꽃자루는, 줄기와 교차점에 완전히 휴식하는 것이 중요합니다.
- 영상 만 꽃 봉오리 5 단계 이하 (그림 2A)는 단계 6-8 꽃 봉오리를 해부하기 전에 물을 제거합니다. 영상 꽃 봉오리 단계 5 세 이상, 꽃받침 잎 절제로 진행하는 경우 (5.1 절 참조). 그렇지 않으면, 프로3.7 단계로 넘 어.
- 집게를 사용하여, 영상 접시의 매체에 수직 구멍을 관통하고, 매체의 해부 정점 똑바로 스틱만을 촬영 정단 분열 조직과 주변 꽃 봉오리가 매체의 표면 위에 있도록. 어떤 꽃 봉오리 (들), 촬영하는에 따라서는 꽃 봉오리가 반드시 정확하게 줄기 (그림 2A)처럼 지향하지 않는 한 약간 샘플을 기울일 필요가있다.
- 필요한 경우 샘플을 염색으로 진행합니다. 염색 및 / 또는 즉시 샘플을 이미징하지 않으면 물을 추가하고 탈수를 방지하기 위해 영상 접시를 닫습니다. 거꾸로 현미경을 사용하는 경우, 투명 플라스틱 상자에 영상 접시를 배치하고 닫습니다.
그림 1 : 라이브 공 촛점 영상의 촬영 정점의 준비. (A - E)를의 해부를이미징 정점을 촬영합니다. 꽃이 핌 (A) 전에 siliques 세 꽃의 (B) 제거 후. (C - D) 촬영 에이펙스는 팁 (C)에 포획 된 공기 버블의 해부 접시에서 물에 침지하고, 기포 (D)의 제거 후. (G) (F) 똑바로 세워 반전 공 초점 현미경의 무대에서, 이미징 접시에 촬영 정점보기 - (E)의 단계 5. (G F)보다 오래된 꽃 봉오리의 해부 후, 해부 접시에 정점을 쏴 . (F)에서, 40 배의 물에 침지 렌즈를 물에 침지 렌즈의 끝의 정점 중 하나 위에 위치된다. (G)에서, 촬영 에이펙스는 렌즈의 선단을 촬상 매체를 연결하는 물기둥으로 거꾸로 40X 물 침지 렌즈 위에 배치된다. (F)에 더 작은 패널은 HIG를 도시촬상 매체에 삽입 된 촬영 에이펙스와 적색 사각형의 영역, 그녀의 확대도; 적색 및 청색 라인 각각의 중간 물의 표면을 나타낸다. (H - I) 물 침지 렌즈의 선단에 물을 더 첨가 있도록 주문 제작 장치의 예 : (A)의 손가락으로 이루어지는 스파크 플러그 부트 (H)로 이루어진 실리콘 고무 슬리브 및 임시 슬리브 powderless 라텍스 장갑 (G). 스케일 바 = 0.5 (A)에서 cm 및 (B), (C) 0.1 cm 및 (D), 및 100 ㎛의 (E). 이 수치는 처음 참조 (14)에 출판되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 염색
참고 세포벽이나 세포막은 요오드화 프로피 듐 염색 또는 FM4-64 수 각각 셀룰러 해상도를 달성영상 중. 또는, 세포막에 태그 형광 단백질과 리포터 라인 16 6 사용될 수있다.
- 촬상 접시에서 수분을 제거하고, 배지 염료 희석 피하기 위해 건조한 표면을 보장한다.
- 실체 현미경 (20) 10 μL 피펫 해부에 정점 중 1 ㎎ / ㎖ 프로피 듐 요오드화 용액 또는 80 ㎍ / mL의 FM4-64 용액 30 μL에 적용된다. 전체 시료가 균일 한 염색을 보장하기 위해 염료에 포함되어 있는지 확인합니다.
- FM4-64를 사용하는 경우, 요오드화 프로피 듐 또는 20 분을 사용하는 경우, 2 분 동안 염색.
- 무균 탈 이온수로 두번 씻어.
5. 꽃받침 절제
참고 : 4 단계에서, 꽃받침 잎 primordia는 FM을 포함 시작합니다. 그들은 성장, 그들은 기본 조직에서 형광을 필터링, 및 이미징 프로세스를 방해. 꽃받침은 하나의 금속 핀 mounte를 사용하여 수동으로 제거 될 수있다핀 바이스에 D는 또는 꽃받침 primordia 신흥에 레이저 어블 레이션을 이용하여 성장하는 것을 방지. 어떤 경우는 꽃받침 잎이 없거나 꽃의 중앙 부분은 일반적으로 (그림 2 층) 17 개발하면서 FM을 포함하지 않는 잎 모양의 장기로 대체하는 등 apetala1-1 같은 돌연변이를 사용하는에 대안으로,이 가능합니다.
- 꽃 봉오리 단계 5 이상 직선 금속 바늘을 잡고 핀 바이스 사용에 꽃받침 절제 (도 2, E1-E2)
- 실체 현미경 해부 정점으로 해부 접시를 배치하고, 최대 배율을 설정. 꽃받침을 해부 동안 정기적으로 촬영 정점에 물을 적용 할 1,000 μL 피펫을 사용하여 선택적으로 살균, 탈 이온수에서 촬영 정점을 빠져 나.
- 핀 바이스, 촬영 정점에 대하여 접선 방향으로 축외 꽃받침 위에 핀 위치. 멀리 휴식 때까지 조심스럽게 촬영 정점에서 멀리 꽃받침 잎을 밀어꽃 봉오리에서.
- 향축 꽃받침 잎과 유사하게 진행되지만 촬영 정점을 향해 꽃받침을 밀어 넣습니다.
- 측면 꽃받침 잎과 유사하게 진행되지만 촬영 정점에 반경 방향으로 핀의 위치, 그리고 꽃 봉오리에서 떨어져 측면으로 꽃받침을 밀어 넣습니다.
- 탈수를 방지하기 위해 몇 분 동안 멸균, 탈 이온수에서 촬영 정점을 담근다.
- 단계 3-4에서 꽃받침 primordia의 레이저 어블 레이션 (도 2, C5-D5)
- 공 초점 현미경 무대에서 스테인드, 해부 정점과 영상 접시를 놓습니다. 찾아서 그 화상 (제 6, "화상 설정"참조)을 준비하는 것처럼 정점에 초점을 맞춘다.
- 레이저 어블 레이션 시스템 소프트웨어를 사용하여, 배축과 향축 꽃받침위한 스테이지 (3)에서, 크레스트 및 신흥 꽃받침 primordia 팁들은 일반적으로 꽃 분열 조직을 (피복하기 전에 해당하는 절제 영역을 정의하고, 말기 3 / 초에게에서 횡 SE 용 스테이지 (4)친구).
- 설정 레이저 파워와 적절한 매개 변수에 거주하는 시간은 기본 조직에 너무 많은 피해를하지 않고 충분한 세포를 브레이션. 일반적으로 사용되는 레이저 제거 시스템에 따라 적절한 매개 변수는 처음 꽃의 나머지 부분에 영향을주지 않고, 이후 FM을 통해 성장하는 꽃받침을 방지하기 위해 제거 충분한 세포를 보장하기 위해 시행 착오 과정을 통해 확인해야 싹. 너무 많은 레이저 파워를 사용하고 그것의 성장 및 / 또는 생존에 영향을 미치는, 꽃의 중심에 손해 배상 시간 결과 주거. 적절한 매개 변수가 확인되고 나면, 그들은 다음 실험을 위해 재사용 될 수있다.
주 : 초기 박리가 불충분 입증되면, 그 다음 날 제 절제 (도 2, C4 및 D2)로 진행할 수있다.
6. 이미징 설정
- 수직 현미경을 사용합니다.
참고 : 직립 현미경으로 이미징 할 때, 여러 개의 정점이 같은 영상 접시에 배치 할 수 있습니다. 이미징 프로세스 시간 이상 지속되는 경우, 요오드화 프로피 듐은 희석되는 경향이 있으며, 일부 샘플은 촬상 전에 재 염색이 필요한 것이다. - 현미경 단계 (그림 1 층)에서 영상 접시를 놓습니다. 물 침지 렌즈를 낮추고, 렌즈의 끝이 물에 담근다되도록 스테이지를 올린다. 해부 정점을 분쇄 또는 영상 매체에 렌즈를 찍어되지 않도록 조심스럽게 진행합니다.
- 기포가 렌즈의 선단에 포집되는 경우, 1000 μL 피펫 워터 제트를 제거 할 수 있습니다.
- 표면 형광 조명 위치에서 렌즈 필드로 해부 정점 중 하나는 XY 콘을 사용하여troller. 접안 렌즈를 통해 살펴보고 Z 컨트롤러를 사용하여 샘플에 초점을 맞 춥니 다. 시료를 분쇄하지 않기 위해 조심스럽게 진행합니다.
- 공 초점 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지화 할 수있는 꽃 봉오리를 확대하고 샘플을 이미징로 진행합니다.
- 1000 μL 피펫을 사용하여 렌즈의 선단에 멸균 증류수 방울을 넣어.
- 촬상 접시 거꾸로 잡은 1000 μL 피펫, 해부 정점에 멸균 증류수 방울을 추가한다.
- 현미경 단계 (그림 1G)에 영상 접시 거꾸로 놓습니다. 시료를 분쇄하지 않도록 조심스럽게 진행합니다.
- 표면 형광 조명 하에서 XY 컨트롤러를 이용하여 렌즈의 팁 위에 해부 정점 위치. 샘플 렌즈의 끝에서 물 방울에 도달 할 때까지 Z 컨트롤러 신중 단계 하향 조정한다. 물기둥을 형성한다 betw렌즈와 매질의 끝 EEN.
- 물 열을 형성하지 않는 경우, 신중 1,000 μL 피펫으로 시료에 물 한 방울을 추가합니다. 수층 (도 1H 및 1I)의 설치 및 유지 보수를 용이 선단에서 더 많은 물을 추가하기 위해 렌즈에 임시 슬리브를 추가한다.
- 표면 형광 조명에 따라, 접안 렌즈를 통해 살펴보고 Z 컨트롤러를 사용하여 샘플에 초점을 맞 춥니 다. 시료를 분쇄하지 않도록 조심스럽게 진행합니다.
- 공 초점 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지화 할 수있는 꽃 봉오리를 확대하고, 샘플을 이미징로 진행합니다.
참고 : 동안 develo의 세포핑 꽃 기관은 매초마다 하루에 한 번 또는 두 번 꽃 분열 조직 분할에 빠르게 세포를 나눌 수, 세포 계보는 시점마다 24 시간으로 추적하기 쉽습니다. 필요가있을 경우, 그 이미지를 6 시간마다 샘플 수있다.
이미징 매개 변수 7. 고려 사항
참고 : 이미지 매개 변수를 설정하는 방법은 사용 된 공 초점 시스템에 많이 의존한다. 다음은 어떤 공 초점 현미경으로 사용할 수있는 이러한 매개 변수 중 일부에 대한 제안입니다. 촬상 파라미터에 대한 고려 사항은 토론 부분을 참조, 14 참조.
- XY 해상도 : 좋은 휴대 해결을 위해 X 1024 1024를 사용합니다. 또한, 해상도의 비용으로, 이미징 시간을 줄이기 위해 512 X 512을 사용합니다.
- 는 Z 해상도 : 0.5 ~ 1.5 μm의 스텝 크기를 설정합니다. 스텝 크기를 낮추면 또한 Z 해상도하지만 이미징 시간을 증가시킨다.
공 초점 데이터 제 시각화
- 영화로 여전히 꽃 개발의 시점의 이미지를 돌립니다.
- 소프트웨어 (예를 들어, 피지)에 (JPEG 또는 TIF 형식) 스틸 이미지를 엽니 다.
- 스택 이미지> 스택> 이미지로 이동합니다. 오픈 이미지 스택에 그룹화된다.
- 스택의 이미지의 순서가 시간 순서에 해당하지 않는 경우, 그 순서를 스택 분류기 플러그인 (플러그인> 스택> 스택 분류기)를 사용합니다.
- 영화로 스택을 켜려면> 다른 이름으로 저장> AVI 파일로 이동합니다.
Representative Results
도 2는 상이한 형광 리포터 유전자를 발현하는 살아있는 애기 꽃 봉오리의 촛점 Z-스택의 다른 뷰를 제공하고, 하나 요오드화 프로피 듐 (도 2, A-C5 및 G) 또는 FM4-64 (도 2, E1-F)로 염색 명확한 세포 해상도를 제공합니다. 대부분의 촛점 시스템은 요오드화 프로피 듐 또는 FM4-64 (- 2F도 2a) 중 하나와 함께 이러한 GFP 또는 YFP 비 중첩 발광 스펙트럼 두 형광의 촬상이 가능. 최상의 촛점 시스템은 또한 GFP 및 YFP하고을 DsRed와 요오드화 프로피 듐 (도 2G)와 같은 샘플 부분 오버랩 발광 스펙트럼과 여러 형광 물질을 분리 할 수있다.
시간 경과 실험의 세 가지 예는 그림에 나타나있다2가 꽃받침 절제 레이저 어블 시스템 중 수행 된 후 꽃 봉오리가 정상적으로 현상 보여준다 (도 2, C1-C5와 D1-D5) 또는 수동 핀 바이스 금속 핀 (도 2, E1-E2). 그림 2의 꽃 봉오리가, E1-E2는 심피 primordia는 꽃 봉오리의 신흥 꽃받침 잎 primordia의 단계 7. 레이저 절제의 꽃 봉오리의 중심에서 관찰되지 않는 이유는 슈퍼맨-1 돌연변이 식물에서 유의 도 2에 도시 된, C1-C5 여전히 스테이지 5 (도 2, C5)에 묘화 될 수있는 FM을 덮는 그들을 방지한다. 반대로,도 2에 도시 된 꽃 봉오리의 경우, D1-D5는, 레이저 어블 레이션은 꽃받침 성장이 지연되지만 꽃받침 결국 스테이지 (5) (도 2, D5에 의해 FM의 대부분을 덮도록 성장
그림 2 : 라이브 꽃 봉오리의 촛점 Z - 스택의 시각화. A와 B2 투명성들이다; B1 및 B4-G가 최대 강도 돌기이고; B3은 직교 슬라이스 도면. (A - E2)를 APETALA3 유전자 (녹색)에 대한 금성 기자를 표현하는 꽃; 세포벽 (녹색, B4 제외 적색) 프로피 듐 요오다 이드 염색 하였다. (A) 화서; 숫자는 꽃 단계를 나타냅니다; 단계 4 및 5 꽃받침 꽃 일반적 FO 금성 리포터의 형광을 걸러반지를 RMS. 몇 가지 꽃 봉오리가 꽃이 핌에 비해 기울어 나타납니다합니다. (B1 - B4)를 스테이지 (5)의 꽃 봉오리 같은 촛점 Z 스택의 4 개의 다른 시청자 최대 강도 돌기의 녹색 (B1)에서 픽셀 강도로 코딩 금성 신호 강도 (B1 및 B4) 및 화재 컬러 코드 (B4, 컬러 코드는 패널의 하단에 도시되어있다); 투명성도 (B2) 및 직교 슬라이스 볼 (B3, 슬라이스의 XY, XZ 및 YZ 방향이 패널에 표시된다). (C1 - C5) 단계 5 단계 3에서 개별 꽃 봉오리 -4- 일 경과; (화이트 특성으로 표시), 레이저 절제는 1 일에 수행 일 3 단계 5. (D1 - D5)의 꽃 봉오리의 중심을 덮고에서 꽃받침을 방지하기에 충분했다 개별 꽃 봉오리 -4- 일 경과에서 단계3 ~ 5 단계; 일 1, 2, 3을 수행 레이저 절제는 꽃 봉오리의 중심을 덮고에서 꽃받침을 방지하기에 충분했다. (E1 - E2)이 배축과 향축 꽃받침 (E1)의 수동 제거 후 개별 꽃 봉오리, 모든 꽃받침 잎의 (E2); 흰색 화살촉이 남아있는 꽃받침을 나타냅니다; 흰색 별표는 꽃받침의 제거로 인한 흉터를 나타냅니다. (F) 단계 DR5-3xVenusN7 기자 (18) (녹색)을 표현하는 7 apetala1-1 꽃; 세포막은 FM4-64 (적색)으로 염색 하였다; 블루 화살촉은 꽃받침 잎을 교체하고 꽃 봉오리를 포함하지 않는 잎 같은 구조를 나타냅니다. (G) DORNROSCHEN 형 7 (녹색) 슈퍼맨 (적색)을위한 비너스 리포터 형광 GFP 리포터 발현을 4 단계의 꽃 봉오리 및 CLAVATA3 19 (청록색) 용을 DsRed 기자; 세포벽은 요오드화 프로피 듐 (회색)으로 염색 하였다. D : 일; 성 : 단계. 스케일 바는 25 μm의 =; 스케일은 C1-C5와 D1-D5에서, B1, B2와 B4 동일하다. 이 수치는 기준 (14)으로부터 변형 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기, 우리는 공 초점 현미경과 물에 침지 렌즈와 라이브 개발, 애기 꽃 봉오리의 이미징을위한 프로토콜을 제공합니다. 이 직립하거나 거꾸로 현미경 중 하나와 함께 할 수 있지만, 쉽고 전자를 사용하는 것이 더 빠릅니다. 이것은 다른 공 초점 시스템은 파장을 분리하는 속도, 감도 및 기능면에서 크게 차이가 있음을 주목할 가치가있다. 동일한 샘플에 상기 최상의 촛점 현미경 이미지는 이제 여러 채널 (도 2G 예 : GFP, YFP DsRed의 및 프로피 듐 요오다 이드) 할 수있다. 일부 공 초점 현미경은 동시에 여러 형광 물질에서 형광을 수집하고 나중에 그들을 분리 할 수있는 스펙트럼 검출기가 장착되어 있습니다. 일반 검출기를 사용하는 경우, 그러나, 레이저 및 필터 집합은 여기 및 다른 형광체로부터의 형광을 분리하는 데 사용되어야한다. 일부 형광 완전히 별개의 발광 스펙트럼을 (예를 들어, CFP의YFP D)과 동시에 이미지화 될 수있다. 다른 형광체는 부분적으로 중첩하는 발광 스펙트럼 (예 : GFP 및 YFP)가, 통상 촬영 시간을 증가시킨다 별도로 이미징 될 필요가있다. 가까운 형광 이미징하는 것은 종종 다른 채널로의 누출 한 형광 물질로부터의 형광을 방지하기 위해 각각의 채널에 대해 수집하는 방식, 스펙트럼의 많은 제한이 필요하다. 이 레이저 전력 및 이득의 증가에 의해 보상 될 수 수집 된 신호의 세기의 손실을 야기한다. 그러나, 장시간 촬상 시간 증가 레이저 파워 표백제 및 / 또는 샘플이 손상 될 수있다. 증가 레이저 파워 및 / 또는 이득은 배경 잡음이 증가 할 수 있습니다. 신호 강도, 해상도 및 각 샘플에 대한 촬상 시간의 최적화는 시행 착오 프로세스를 수행하고, 영구 절충을 수반한다.
이 프로토콜은 해부 촬영 정점의 측면에서 개발 꽃 봉오리의 라이브 공 촛점 이미징을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 그것촬영의 정점은 식물의 나머지 부분에 연결되어 있지 않다는 사실은 SAM과 꽃 개발에 영향을 미칠 수있는 토키 닌을 포함하는 배지에서 성장한다고 주장 할 수있다. 그러나이 매체는 혀끝의 분열 조직이 정상 plastochron에서 새로운 꽃 봉오리를 생산,이 꽃 봉오리는 일반적으로 15 개발하는 해부 촬영을 보장하기 위해 시행 착오 과정을 통해 경험적으로 설계되었다. 마찬가지로, 꽃받침 잎 해부는 유전자 발현 패턴이나 꽃의 나머지 부분의 발전에 영향을 나타나지 않습니다. 샘의 라이브 공 촛점 이미징을 수행하는 방법을 다른 프로토콜 세부 사항은 여전히 (예 11 참조) 식물의 나머지 부분에 연결합니다. 이러한 프로토콜에 적응, 특히 닌 관련 프로세스를 연구 할 때, 꽃을 개발하는 이미징을위한 유용한 대안을 제공 할 수있다. 줄기가 신장과 왜곡을하고, 꽃 봉오리의 방향을 변경; 그들은 그러나 몇 가지 단점을 제시 에이식물의 나머지 부분에 부착 된 촬영 정점을 이미징하는 것은 직립 현미경으로 잘 작동하는 동안 차, 그것은 거꾸로 현미경으로 그렇게 훨씬 더 복잡하다.
침지 렌즈 "건조"렌즈 (공기 샘플로부터 분리되는, 즉 렌즈)보다 더 개구 수 (NA)를 가지며, 그러므로 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하는 경우 중요하다 시료의 미세한 해상도를 제공한다. 촬상 탈수 과정에서 촬영 에이펙스를 방지하면서, 물 침지 렌즈를 사용하기 때문에, 건조 렌즈보다 훨씬 더 NA를 제공한다. 글리세린과 오일 렌즈는 물 렌즈보다 더 높은 NA를 가지고 있지만, 그들은 샘플 또한 시간 경과 실험을하는 동안 성장 유지하는 촬영 정점의 크기에 매우 비실용적 인 커버 슬립의 사용을 필요로한다. 샘플의 크기를 감안할 때, 긴 작동 거리를 가진 렌즈를 사용하는 것도 중요하다 (꽃 단계에 따라, 스택을 통해 150 μm의 두께가 될 수 있습니다). 우리는 일반적으로 (1)의 NA 및 1.7-2.5 mm의 작업 거리 : 20 또는 40X 렌즈를 사용한다.
공 초점 레이저 주사 현미경 소프트웨어 삼차원 재구성 (도 2, B1, B2 및 B4)와 슬라이스 뷰 (도 2, B3)을 포함 촛점 데이터를 시각화하는 여러 가지 방법을 제공한다. 가장 일반적으로 사용되는 입체보기는 촛점 Z-스택 (도 2, B1 및 B4), 일부 소프트웨어의 최대 강도의 돌출부가 있지만 (예 ZEN 및 Imaris)도의 깊은 부분에서 상기 신호를 필터링하여 해당 투명도 전망을 제공 표피층으로 표현 일어나는 프로세스 또는 유전자에서 볼 때 유용 할 수있는 샘플 (도 2, B2). 신호 강도가 어느 화소 INTE를 이용하여 단일 컬러 (도 2, B1)로 코딩 될 수있다nsity 또는 컬러 코드 (도 2, B4)를 사용.
라이브 공 촛점 영상뿐만 아니라 꽃 개발에 중요한 질적 통찰력을 제공하고, 또한 잠재적으로 정량적 데이터의 풍부한 발달 생물학을 제공합니다. 다양한 소프트웨어 (예 Imaris는 피지, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21)의 수 또는 하나 이상의 리포터 또는 다른 세포에서 리포터의 발현 수준을 발현하는 세포의 양의 정량화를 허용한다. 이러한 소프트웨어는, 자동 세포 분할을 수행하는 세포 계통을 추적하고 성장을 정량화하는데 사용될 수있다. 이 다른 소프트웨어는 비슷한 도구를 제공뿐만 아니라 여러 가지면에서 다르다. MARS-ALT 및 MorphoGraphX는 Imaris a를 달리 식물 15, 20, 21을 위해 특별히 설계되었습니다ND 피지. Imaris 화성-ALT 전체 샘플의 분류 및 분석을 허용하면서 MorphoGraphX은, 표피층의 분류 및 분석을 허용한다. 그러나, 화성 ALT 세 가지 각도 (15)로부터 동일한 샘플의 이전 영상을 필요로하고, Imaris는 단일 스택을 요구한다. 양적 정보에 대한 액세스는 꽃 개발에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 중요합니다.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없습니다.
Acknowledgments
저자는 그의 지원을위한 교수 엘리엇 M 메이어오위츠 감사드립니다, 그리고 기술적 인 문제를 해결하는 그들의 도움을 캘리포니아 공과 대학에서 생물 이미징 시설에서 다트머스 대학 박사 안드레스 콜라조의 원고에 대한 의견뿐만 아니라, 앤 라반웨이 라이브 공 촛점 영상. 나다나엘 프루넷의 작품은 엘리엇 M 메이어오위츠에 부여 R01 GM104244를 통해 미국 국립 보건 연구소에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90X maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40X water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
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