Summary
Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.
Abstract
Bitki büyüme ve gelişme çalışması uzun zaman önce ölmüş, sabit dokuları kullanılarak ve uygun hücresel çözünürlük eksik deneysel teknikler güvenmiştir. sayısız floroforların gelişimi ile kombine eş odaklı mikroskopi son gelişmeler, bu sorunları aşmak ve canlı örneklerde, iyi bir hücresel çözünürlükte, aynı anda birkaç genlerin ifadesini çalışma imkanı açtı. Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç ile bitki biyologlar sağlar ve yoğun kök büyümesi ve sürgün apikal meristem yamaçlarında yanal organlarının oluşumunu incelemek için kullanılmıştır. Ancak, yaygın nedeni böyle çiçek meristem üzerinde büyümeye sepals olarak çiçekler, görüntülenmesi ve bu altta kalan dokulardan floresan filtre özgü zorluklara kısmen, çiçek gelişimini çalışmaya uygulanmamıştır. Burada, Arap gelişmekte canlı canlı eş odaklı görüntüleme gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol mevcutDik veya ters bir mikroskop kullanılarak idopsis çiçek tomurcukları.
Introduction
ya meristeme - - Filiz ve köklerin bitki gövdesinin çoğu kök ucundaki veya yakınında hücrelerin gruplardan post-embriyonik oluşturur. Vejetatif aşamasında bırakır ve çiçek meristemler (FMS) üreme faza geçiş yapar sonra: yetişkin bitkinin toprak üzerinde kalan tüm yapıların sürekli olarak yanları lateral organ üreten sürgün apikal meristem (SAM) türer. sırayla Dışişleri bakanları çiçeklerin içine gelişir. Arabidopsis SAM zamanda yan organların bir üretirken, yinelemeli bir, yay örgüsü içinde FMS birden fazla gelişim programları aynı anda çözülüyor ile, kısmen eş zamanlı bir şekilde, dört kıvrımları olan çiçek organları dört tip üretir. Farklı çiçek organlarının kimlik şartname altında yatan genetik ağların kısmen çiçek developme ki, ama pek çok açıdan (yorumlara, referanslar 1, 2 bakınız) deşifre edilmişnt, örneğin bitkisel, organ konumlandırma ve kıvrımları arasındaki sınırların tanımı olarak, yeterince anlaşılamamıştır.
Bitki gelişiminin erken moleküler genetik çalışmalar daha çok gen ekspresyonunu analiz etmek için in situ hibridizasyon ve GUS muhabir gibi teknikler dayanıyordu. Bu yöntemler bilgi hazinesi sağlanan ve büyük ölçüde bitki büyüme ve çiçek gelişimi anlayışımıza katkıda bulunmuş olsa da, önemli sınırlamalar vardır: onlar iyi hücresel çözünürlük eksikliği, aynı birden fazla genlerin ifade örneğinin kolay gözlem için izin vermez numuneler, ve daha da önemlisi, sadece ölü sabit dokular için uygulanabilir. Konfokal mikroskopi son gelişmeler bu sınırlamaları aşmak ve işlemesi ile altta yatan bitki morfogenetiğine araştırmak için güçlü bir araç ile gelişimsel biyologlar sağlamak var. Özellikle, konfokal mikroskopi c bunların oluşum boyunca canlı doku ve organların gözlem sağlarTamamen böyle bir gelişme olarak bir özünde dinamik süreci anlamak için ritical.
Canlı konfokal görüntüleme yoğun, (mesela referanslar 7, 8 (örneğin 3 başvuran 4, 5, 6), ancak birkaç raporların haricinde SAM tarafından bitkilerin havadan büyüme ve yanal organlarının üretimini analiz etmek için kullanılmıştır 9, 10), bu yaygın çiçek gelişimini çalışmaya uygulanmamıştır. SAM canlı eş odaklı görüntüleme için protokoller (örneğin 12 11 başvuran) kullanılabilir ve SAM çevreleyen nasıl görüntüye gelişmekte çiçek tomurcukları için iyi bir temel sağlar. Ancak, görüntüleme çiçek tomurcukları belirli zorluklar ortaya: Örneğin,Çiçek tomurcukları hızlı SAM daha büyük hale gelir ve aşama 4'te, çanak yaprakları (referans 13'de tarif edildiği gibi aşamaları), FM kapsayan ve bu dokular (Şekil 2A) altta yatan floresans karartma başlar. Burada, dik ya da ters bir mikroskop ve bir su-daldırma lens kullanarak Arabidopsis çiçek tomurcukları geliştirmeye canlı eş odaklı görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl açıklayan ayrıntılı bir protokol sağlar. Daha önce referans 14'de bu protokolü yayınladı.
Protocol
1. Medya ve Tabaklar Hazırlık
- % 2 agaroz ile 0.5 cm (2 cm derinliğinde, yaklaşık 6 cm genişliğinde) yuvarlak plastik kutular doldurarak yemekler kesme hazırlayın.
- Bulaşıkları görüntüleme hazırlayın.
- Dik konfokal mikroskop için, dikdörtgen plastik görüntüleme ortamıyla 0.5 cm (3 cm derinliğinde, 4.5 cm genişliğinde, yaklaşık 7 cm uzunluğunda) kutuları menteşeli doldurun (bakınız Bölüm 1.3, "Görüntüleme ortamı"; Şekil 1F).
- Ters bir konfokal mikroskop için: tam görüntüleme ortamı ile ağzına kadar (yaklaşık 3.5 cm genişliğinde 1 cm derinliğinde) küçük bir petri doldurun (bakınız Bölüm 1.3, "Görüntüleme ortamı", Şekil 1G).
- Görüntüleme ortamı hazırlayın.
- tek noktalı görüntüleme için,% 1 agaroz kullanın.
- zaman atlamalı deneyleri için, potasyum hydroxid ile apeks büyüme ortamı (vitamin olmayan 0.5x Murashige ve Skoog bazal tuz karışımı,% 1 sükroz,% 0.8 agaroz pH 5.8 kullanımıvitamin [% 0.01 miyo-inositol,% 0.0001, nikotinik asit,% 0.0001, piridoksin hidroklorür,% 0.001 tiamin hidroklorür,% 0.0002 glisin] ve sitokinin [500 nM N6-benziladenin]) 15 ile takviye e çözeltisi.
2. Bitki Büyüme
- Uygun bir seçim ile MS plakaları (vitamin olmayan 0.5 ya da 1 x Murashige ve Skoog bazal tuz karışımı,% 0.8 ağar, potasyum hidroksit çözeltisi ile pH 5.8) ile sterilize edilmiş tohum ekmek. Uzun gün (16 saat ışık) ya da sürekli günde yer plakaları, iki hafta boyunca 16-22 ° C koşulları.
- yeterli aralık ile toprak üzerine nakli fideleri sağlam gelişimine izin vermek için. kısa günde Yeri bitkileri, üç hafta boyunca 16-22 ° C koşulları.
NOT: Doğrudan prematüre çiçeklenme ve daha az kuvvetli ve teşrih çok zor olan inflorescences sonuçları dikimden sonra uzun bir gün veya sürekli gün koşullarında bitkilerin yetiştirilmesi. Benzer şekilde, kısa gün iklimlendirme altında bitkiler bırakaraküç haftadan fazla gün boyu bağımsız çiçeklenme sonuçlar ve daha az şiddetlidir inflorescences için iyonları. - Uzun gün (16 saat ışık) ya da sürekli bir gün transfer bitkiler, çiçek kadar 16-22 ° C koşulları. çiçeklenme 2-10 cm uzunluğunda olduğunda sürgün ucu teşrih en kolay olanlardır.
Atış apeksinin 3. Diseksiyon
- İsteğe bağlı: ince keskinleştirme taş ve hafif petrol bir damla kullanarak, işaret benzeri olmayan, onları bıçak benzeri yapmak için stereomicroscope altında forseps keskinleştirmek.
- kırılıncaya kadar forseps ile pedinküllerin tabanını iterek birincil çiçek durumundan silikvalar, eski çiçek tomurcukları ve ikincil salkımına çıkarın. (A ve B karşılaştırma, Şekil 1) büyütme olmadan mümkün olduğu kadar çok çiçek çıkarın.
- forseps, bir ayırma kabı agaroz delmek dikey delik kullanarak, çiçeklenme son 0.5 cm kesilir ve agaroz dikey olarak yapıştırın. KalanÇiçek tomurcukları, agaroz yüzeyi üzerinde olması gerekir.
- Sürgün ucu tamamen dalmış, böylece steril, de-iyonize su ile görüntüleme çanak doldurun. (C ve D karşılaştırın, Şekil 1) bir stereomikroskop altında kesme tabağına yerleştirin ve 1000 uL pipetle su jetleri oluşturarak sürgün ucuna çevresinde kalan havayı çıkarmak.
- Stereomikroskop altında, sapı tabanında veya peduncle sonları (Şekil 1E) kadar tomurcuk üstüne iterek yansıması değildir çiçek tomurcukları kaldırmak için forseps kullanabilir. Artık pedinküller genç çiçek tomurcukları kaldırılmasını engelleyen olarak pedinküller sapı ile kavşakta temiz kırmak önemlidir.
- Görüntüleme sadece çiçek tomurcukları evre 5 ve daha küçük (Şekil 2A), sahne 6-8 çiçek tomurcukları diseksiyon önce suyu uzaklaştırmak edin. görüntüleme çiçek tomurcukları evre 5 ve üzeri, çanak yaprağı ablasyon devam ederse (bakınız bölüm 5.1). Aksi halde, pro3.7 adıma karışmaya bırakıldı.
- forseps kullanarak, bir görüntüleme yemeğin orta dikey delik delmek ve orta disseke apeks dik sopa sadece sürgün apikal meristem ve çevresindeki çiçek tomurcukları ortamın yüzeyi üzerinde olacak şekilde. Bu çiçek tomurcuğu (ler), görüntülenecek olan bağlı olarak, çiçek tomurcukları mutlaka tam olarak sap (Şekil 2A) gibi yönlendirilmiş değildir gibi hafif, örnek yatırmak için gerekli olabilir.
- Gerekirse numune boyama geçin. boyama ve / veya hemen numuneyi görüntüleme Değilse, su ekleyin ve su kaybını önlemek için görüntüleme tabak kapatın. Devrik bir mikroskop kullanarak ise şeffaf bir plastik kutu içinde görüntüleme tabak yerleştirin ve kapatın.
Şekil 1: Canlı eş odaklı görüntüleme için sürgün uçları hazırlanması. (A - E) arasında Diseksiyongörüntüleme için apeks ateş. Çiçek önce (A) ve siliklerden ve yaşlı çiçekler (B) çıkarıldıktan sonra. (Cı - D) sürgün ucuna ucunun (C) sıkışmış bir hava kabarcığı ile, diseksiyon çanak içinde suya daldırılır ve hava kabarcığı (D) çıkarılmasından sonra. Bir (G) (F) dik ve ters çevrilmiş odaklı mikroskobun üzerinde, görüntüleme tabak sürgün uçları arasında Görünüm - (E) evre 5. (G F) daha eski çiçek tomurcukları diseksiyon sonra, diseksiyon çanak içinde apeks vur . (F) 'de, bir 40X suda daldırma objektif suya batırılmış objektif ucuyla, fidanların biri üzerine yerleştirilir. (G) 'de, Sürgün ucu lensin ucuna görüntüleme ortamının bağlayan bir su sütunu ile, ters 40X suda daldırma objektif üstünde konumlandırılmıştır. (F) daha küçük panel HIG göstermektedirgörüntüleme ortamında yerleştirilen bir sürgün ucuna kırmızı dikdörtgen alanın, onu büyütme görünümü; Kırmızı ve mavi hatları sırasıyla orta ve su yüzeyini göstermektedir. (H - I) 'su daldırma objektif ucundaki su ekleyerek izin ısmarlama cihazların örnekleri: a parmak yapılmış bir buji önyükleme (H) hazırlanan bir silikon kauçuk kovan ve geçici bir manşon tozsuz lateks eldiven (G) gösterir. Ölçek çubukları = 0.5 (A) cm ve (B), (C) 'de 0.1 cm ve (D), ve 100 um (E). Bu şekil, ilk olarak referans 14 yayınlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
4. Boyama
Not: hücre duvarları veya plazma membranları propidyum iyodür veya FM4-64 ile boyanmış olabilir, sırasıyla hücre çözünürlük elde etmek içingörüntüleme sırasında. Alternatif olarak, plazma membranı etiketli floresan proteinleri ile raportör hatları, 16 6 kullanılabilir.
- Görüntüleme çanak su çıkarın ve orta boya seyreltilmesi önlemek için kuru bir yüzey sağlamak.
- stereomikroskop altında, 20, 10 uL pipetle kesilmiştir apekse ya 1 mg / ml propidyum iyodid solüsyonu boyalı ya da 80 ug / ml FM4-64 çözeltisi uL 30 için de geçerlidir. Bütün numune homojen bir lekeleme sağlamak için boya kaplı olduğundan emin olun.
- FM4-64 kullanılıyorsa propidyum iyodür, ya da 20 dk kullanılarak halinde 2 dakika boyunca leke.
- Steril, deiyonize su ile iki kez durulayın.
5. Sepal Ablasyon
NOT: evre 4 anda, çanak yaprağı taslakları FM kapsayan başlar. bunlar büyüdükçe, altta uzanan doku floresans filtre ve görüntüleme işlemi engellemektedir. Çanak bir metal pim Mounte kullanılarak el ile çıkarılabilirBir pin mengene d veya çanak yaprağı Primordia yükselen üzerine lazer ablasyon kullanarak büyümeye engelledi. Bazı durumlarda, çanak eksik veya çiçeğin merkezi kısmı, normal olarak (Şekil 2F) 17 gelişirken FM örtmeyen yaprak benzeri organları ile ikame edildiği, böyle apetala1-1 gibi mutantların, kullanmak için Alternatif olarak, mümkündür.
- Çiçek tomurcuklarının aşama 5 ve daha büyük bir düz metal iğne tutan bir pim-mengene ile ilgili Sepal ablasyon (Şekil 2, E1-E2)
- stereomikroskop altında disseke apeks ile diseksiyon tabağına yerleştirin ve maksimum büyütme ayarlayın. sepals diseksiyon sırasında düzenli sürgün ucuna kadar su uygulamak için 1.000 mcL pipet kullanın alternatif steril, deiyonize su içinde tepe sürgünü batırın ya.
- pin mengene ile, sürgün ucuna kadar teğet şekilde abaxial sepal üstündeki pimi, yerleştirin. uzak kopana kadar yavaşça sürgün ucuna uzak sepal itmekçiçek tomurcuğundan.
- adaxial sepal ile benzer Devam fakat sürgün ucuna doğru sepal itin.
- Yanal sepals ile benzer Devam fakat sürgün ucuna kadar radyal nispi pimini konumlandırmak ve çiçek tomurcuğu uzak, yanına sepals itin.
- su kaybını önlemek için birkaç dakika için steril, deiyonize su içinde tepe sürgünü batırın.
- Aşama 3-4 de çanak yaprağı primordia lazerli ablasyon (Şekil 2, C5-D5)
- konfokal mikroskop sahnede lekeli dissekte tepe noktası ile görüntüleme tabağına yerleştirin. Bulun ve görüntünün o (bölüm 6, "görüntüleme ayarları" bölümüne bakınız) hazırlanıyor sanki apeks odaklanır.
- Lazer ablasyon sistemi yazılımı kullanarak, eksen dışı ve maddede aks çanak yaprakları için evre 3, tepesi ve gelişmekte olan çanak yaprağı primordia ucu tipik olarak çiçek meristemi (kaplama başlamadan önce tekabül ablasyon bölgesini tanımlar ve geç evre 3 / erken de yan se aşama 4sarsak).
- Set lazer güç ve uygun parametrelere bekleme süresi alttaki dokulara çok fazla hasar verir olmadan da yeterince hücreleri çıkarmak için. Tipik olarak, kullanılan lazer ablasyon sistemine bağlı olarak uygun parametreler başlangıçta çiçeğin geri kalanını etkilemeden, daha sonra FM üzerinde büyümeye sepals önlenmesi amacıyla kaldırılmıştır yeterli hücrelerini sağlamak için bir deneme-yanılma süreci içerisinde tanımlanmalı gerekir tomurcuk. Çok fazla lazer gücünü kullanarak ve büyümesini ve / veya hayatta kalmasını etkileyen, çiçeğin merkezinde zararın süresi sonuçlarını konut. Uygun parametreler belirlendikten sonra, bunlar daha sonraki deneyler için yeniden kullanılabilir.
Not: ilk ablasyon yetersiz olursa, bu takip eden günlerde ikinci ablasyonu (Şekil 2, C4 ve D2) devam etmek mümkündür.
6. Görüntüleme Kur
- Dik bir mikroskop kullanın.
NOT: dik bir mikroskop ile görüntüleme, çeşitli uçları aynı görüntüleme çanak yerleştirilebilir. Görüntüleme işlemi, bir saat daha devam eder, ancak, propidyum iyodür seyreltilerek eğilimindedir ve bazı örnekler görüntüleme öncesi yeniden lekeleme gerekebilir. - Bir mikroskop kademesine (Şekil 1F) ile görüntüleme tabağına yerleştirin. Su daldırma lens indirin ve lens ucu suya dalan böylece sahne yükseltmek. disseke dorukları ezmek veya görüntüleme ortamı içine lens daldırma etmemek için dikkatli devam edin.
- bir hava kabarcığı lensin ucunda sıkıştırılmazsa, 1000 uL pipetle su jetleri çıkarmak için olun.
- Epifloresans aydınlatma, pozisyon altında mercek alanına disseke fidanların biri XY con kullanaraktroller. eyepieces bakın ve Z kumandasını kullanarak numunenin odaklanır. örneği parçalamak vermemek için dikkatli hareket edin.
- konfokal mikroskop yazılımı kullanarak, görüntülenecek çiçek tomurcuğu yakınlaştırma, ve numune görüntüleme geçin.
- 1.000 mcL pipet kullanarak lensin ucunda steril, deiyonize su bir damla koymak.
- görüntüleme çanak alt üst tutun ve 1.000 mcL pipet ile, disseke apeksine steril deiyonize su bir damla ekleyin.
- Bir mikroskop kademesine (Şekil 1G) ile görüntüleme bulaşık baş aşağı yerleştirin. örneği parçalamak etmemek için dikkatli devam edin.
- epifloresans aydınlatma altında, XY denetleyicisi kullanarak lens ucu üzerinde disekte tepe pozisyon. örnek lens ucundaki su damla ulaşıncaya kadar, Z kontrolör ile dikkatli bir şekilde evresini. Bir su sütunu betw oluşturmalıdırlens ve ortamın ucu een.
- Su sütunu oluşturmadığı takdirde, dikkatle 1.000 mcL pipet ile örnek bir damla su ekleyin. Su sütunu (Şekil 1 H ve 1 H) oluşturulması ve sürdürülmesi için kolaylaştırmaktadır ucunda, daha fazla su ilave etmek için lens geçici kovanları ekleyin.
- Epifloresans aydınlatma altında, göz mercekleri ile bakmak ve Z kumandasını kullanarak numunenin odaklanır. örneği parçalamak etmemek için dikkatli devam edin.
- konfokal mikroskop yazılımı kullanarak, görüntülenecek çiçek tomurcuğu yakınlaştırma ve örnek görüntüleme geçin.
NOT: iken develo hücrelerping çiçek organları iki günde bir veya iki kez çiçek meristem bölmek, daha hızlı hücrelerini bölebilirsiniz ve hücre soyları zaman noktalarında her 24 saat ile izlemek kolaydır. eğer gerekirse Ancak, görüntüye altı saatte numuneler mümkündür.
Görüntüleme Parametreleri 7. Hususlar
NOT: görüntüleme parametrelerini ayarlamak için nasıl kullanılır konfokal sistemine çok bağlıdır. Aşağıda herhangi konfokal mikroskop ile kullanılabilen bu parametrelerin bazıları için öneriler. Görüntüleme parametreleri üzerine daha değerlendirmeler için, Tartışma bölümüne bakın ve 14 referans.
- XY çözüm için: iyi bir hücresel çözünürlük için x 1,024 1.024 kullanın. Alternatif olarak, çözünürlük pahasına, görüntüleme süresini azaltmak için 512 x 512 kullanın.
- Z, çözünürlük için: 0.5-1.5 um adım boyutunu ayarlamak. üvey boyutunu düşürmek de Z çözünürlüğü ancak görüntüleme süresi artar.
Konfokal Verilerin 8. Görselleştirme
- Filme hala çiçek gelişiminin zaman noktalarının görüntüleri çevirin.
- Yazılımın (örneğin, Fiji) içinde (jpeg ya tif formatında) hareketsiz görüntüleri açın.
- Stack Görüntü> Yığınlar> Görüntüler gidin. açık görüntüleri yığınında gruplandırılır.
- yığınında görüntülerin sırası kronolojik karşılık vermezse, bunları yeniden düzenlemek için Yığın Sıralayıcısı eklentisi (Eklentiler> Yığınlar> Yığın Sorter) kullanın.
- Filme yığını açmak için> Farklı Kaydet> AVI Dosya gidin.
Representative Results
Şekil 2, farklı floresan haberci genleri ifade canlı Arabidopsis çiçek tomurcuklarının konfokal Z yığınlarının farklı görünümlerini göstermektedir, ve ya da propidyum iodid (Şekil 2, A-C5 ve G) ya da FM4-64 (Şekil 2, E1-F) ile boyanmıştır net bir hücresel çözünürlük sağlamaktadır. En konfokal sistemleri propidyum iyodür veya FM4-64 (- 2F Şekil 2A) ile birlikte ya GFP ya da YFP çakışmayan emisyon spektrumu ile iki florofor görüntüleme için izin verir. En iyi konfokal sistemleri, aynı zamanda, GFP ve YFP ve DsRed ve propidyum iyodür (Şekil 2G) ile aynı numunelerde kısmen üst üste binen emisyon spektrumları, birden fazla fluorophores ayırmak mümkündür.
Zaman atlamalı deneylerin üç örnek Şekil sunulmuştur2 ve çanak yaprağı eritme lazer ablasyon sistemi ile ya da gerçekleştirilmiştir sonra çiçek tomurcukları normal gelişim göstermektedir (Şekil 2, C1-C5 ve D1-D5) ya da el ile bir pim-mengene ve bir metal pim ile (Şekil 2, E1-E2). Şekil 2'de gösterilen çiçek tomurcuğu, E1-E2 karpel primordia çiçek tomurcuğu çıkan çanak yaprağı primordia aşama 7. lazer ablasyonunun de tomurcuk merkezinde gözlenmez nedenle Süpermen-1 mutant bitkiden olduğuna dikkat edin Şekil 2'de gösterilen, C1-C5 yine aşama 5 (Şekil 2, C5) görüntülenebilir FM, kaplama engeller. Tersine, Şekil 2'de gösterilen çiçek tomurcuk halinde, D1-D5, lazer ablasyon sadece çanak yaprağı büyüme gecikmiş, ancak çanak sonunda sahneye 5 (Şekil 2, D5 tarafından FM çoğunu kapsayacak şekilde büyüdü
Şekil 2: canlı çiçek tomurcuklarının konfokal Z-yığınlarının Görselleştirme. A ve B2 şeffaflık görüntülerdir; B1 ve B4-G, maksimum yoğunluk tahminleridir; B3 ortogonal bir dilim görünüşüdür. (A - E2) APETALA3 geni (yeşil) için Venüs muhabiri ifade eden çiçekler; Hücre duvarları (yeşil, B4 haricinde kırmızı) propidyum iyodid ile boyanmıştır. (A) Çiçek; sayılar çiçek aşamalarını göstermektedir; 4. aşamada çanak yaprakları ve 5 çiçek normal fo Venüs habercisinin floresan, filtrebir halka rms. Bazı çiçek tomurcukları çiçeklenme kıyasla eğik görünen unutmayın. (B1 - B4), bir aşama 5 çiçek tomurcuğu aynı konfokal Z yığının Dört farklı görünümler: azami kesafetin çıkıntılar yeşil renkte (B1), piksel şiddeti ile kodlanmış Venüs sinyal yoğunluğu (B1 ve B4) veya yangın renk kodu ile (B4; renk kodu panelin alt kısmında gösterilir); saydamlık görünüşüdür (B2) ve dik kesit görünüşüdür (B3, dilimlerin XY XZ ve YZ yönlendirme paneli belirtilir). (C1-- C5) aşaması 5'e aşama 3'ten bağımsız bir çiçek tomurcuğu 4 günlük bir zaman atlamalı; (beyaz özellikleri olarak işaretlenmiş), lazer ablasyonlar gün 1 üzerinde gerçekleştirilen ve 3. günde 5 kademesine (D1 - D5) de çiçek tomurcuğu merkezi kapsayan gelen çanak yaprakları önlemek için yeterli olan bir tek çiçek tomurcuğu 4 günlük bir zaman-yanılmasından evreaşama 5-3; günde 1, 2 ve 3 üzerinde yapılan lazer ablasyonlar çiçek tomurcuğu merkezi kapsayan gelen çanak yaprakları önlemek için yetersizdir. (E1 - E2) abaxial ve adaxial sepals (E1) elle çıkarılması sonrasında Bireysel çiçek tomurcuğu ve tüm sepals (E2); beyaz ok başları kalan çanak yaprakları göstermektedir; Beyaz yıldız çanak yaprakları uzaklaştırılması sonucu izleri gösterir. (F) aşaması bir DR5-3xVenusN7 Reporter 18 (yeşil) eksprese eden 7 apetala1-1 çiçek; plazma membranları FM4-64 (kırmızı) ile boyanmıştır; mavi ok başları sepals yerini ve çiçek tomurcuğu örtmeyen yaprak benzeri yapılar göstermektedir. (G) Dornröschen-7 gibi (yeşil), SUPERMAN (kırmızı) için bir Venüs raportör bir floresan GFP raportör ifade Aşama 4 çiçek tomurcuğu ve CLAVATA3 19 (mavi) bir DsRed muhabir; hücrelerDuvarlar propidyum iyodür (gri) ile boyanmıştır. D: gün; st: aşama. Ölçek çubukları 25 um =; ölçek C1-C5 ve D1-D5, B1, B2 ve B4 aynıdır. Bu şekil, başvuru 14 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Discussion
Burada, bir konfokal mikroskop ve bir su-daldırma lens ile canlı, gelişmekte Arabidopsis çiçek tomurcukları görüntüleme için bir protokol sağlar. Bu dik veya ters bir mikroskop ya ile yapılabilir iken, daha kolay ve eski kullanımı hızlıdır. Farklı konfokal sistemleri dalga boylarını ayırmak için hız, hassasiyet ve yetenek açısından anlamlı farklılıklar gösterdiğini belirtmek gerekir. Aynı örneklerde, en iyi konfokal mikroskop artık görüntü birkaç farklı kanallar (Şekil 2G örneğin, GFP, YFP, DsRed ve propidyum iyodür) izin verir. Bazı konfokal mikroskop aynı anda birkaç fluorophores floresans toplamak ve daha sonra bunları ayırmak için bir spektral dedektörü ile donatılmıştır. normal bir detektör kullanılarak, ancak, lazerler ve bir filtre grubu heyecan ve farklı flüorofor floresans ayırmak için kullanılmalıdır. Bazı floroforlar tamamen farklı emisyon spektrumları (örn CFP bird YFP), ve aynı zamanda görüntülenebilir. Başka fluoroforlar, kısmen üst üste emisyon spektrumunu (örneğin, GFP ve YFP) olabilir ve genellikle görüntüleme süresini arttırır, ayrıca görüntülü gerekir. yakın florofor Görüntüleme aynı zamanda sık sık bir kanal içine sızmasını bir florofor floresans önlemek için, her bir kanal için toplanır ne spektrumunun çok kısıtlayıcı gerektirir. Bu lazer güç ve kazanç bir artışla telafi edilebilir toplanan sinyalin, yoğunluğu kaybına neden olur. Bununla birlikte, uzun süreli görüntüleme zamanı ve daha yüksek lazer gücü ağartıcı ve / veya örnek zarar verebilir. Artan lazer güç ve / veya kazanç da arka plan gürültüsünü artabilir. Sinyal yoğunluğu, çözünürlük ve her bir numune için görüntüleme sürelerini kısaltıyor deneme-yanılma sürecinden yapılır ve kalıcı dengeler müdahalesi içermez.
Bu protokol bir disseke sürgün ucuna yamaçlarında gelişen çiçek tomurcukları canlı konfokal görüntüleme gerçekleştirmek açıklar. OSürgün ucu bitkinin geri kalanına bağlı olan ve olmayan olması SAM ve çiçek gelişimini etkileyebilecek cytokinins içeren bir ortamda yetişen iddia edilebilir. Ancak, bu orta apikal meristemler, normal plastochron yeni çiçek tomurcukları üretmek ve bu çiçek tomurcukları normalde 15 geliştirdiğini disseke ateş sağlamak için bir deneme-yanılma süreci ile ampirik olarak tasarlanmıştır. Benzer şekilde, çanak yaprağı diseksiyon gen ekspresyonu veya çiçeğin kalanı gelişimini etkilediği görünmüyor. SAM canlı confocal görüntüleme gerçekleştirme başka protokoller detaylı halen (örneğin 11 referans) bitkinin geri kalanına bağlanmış. Bu protokoller üzere uyarlanmış ve özellikle oksinle ilgili süreçler üzerinde çalışılması sırasında, çiçek geliştirme görüntüleme için yararlı bir alternatif sunmaktadır edilebilir. kök uzayarak katlanmış, ve çiçek tomurcuklarının yönünü değiştirir;: Bunlar çeşitli dezavantajları mevcut birbitkinin geri kalanına bağlı bir tepe sürgünü görüntüleme dik bir mikroskop ile iyi çalışır iken nd, bir ters mikroskop ile bunu çok daha karmaşıktır.
Daldırma lensler "kuru" lens sistemi (hava ile numuneden ayrılır yani lensler) daha iyi bir sayısal açıklık (NA) sahiptir ve bu yüzden bir konfokal mikroskop kullanılarak zaman kritik numune, daha ince bir çözünürlüğü sağlar. Görüntüleme işlemi sırasında dehidrasyon gelen tepe sürgünü önlerken su daldırma lens kullanarak böylece kuru lens çok daha iyi NA sağlar. gliserin ve yağ lensler su lensler daha da yüksek NA sahip olsa da, bir numunede de zaman atlamalı deneyler sırasında büyüyen tutan bir sürgün ucuna, büyüklüğü ile çok kullanışsız olduğu bir lamel, kullanımını gerektirebilir. Numunelerin boyutu göz önüne alındığında, uzun bir çalışma mesafesi olan bir lens kullanmak da önemlidir (çiçek kademelerine bağlı olarak, yığın boyunca 150 um kalınlığında olabilir). Bu tipik olarak 1 bir NA ve 1.7-2.5 mm arasında bir çalışma mesafesi ile bir 20 ya da 40 kat lens kullanımı.
Konfokal mikroskop yazılım üç boyutlu rekonstrüksiyon (Şekil 2, B1, B2 ve B4) ve dilim görüntüleme (Şekil 2, B3) de dahil olmak üzere konfokal verileri görselleştirmek için çeşitli yöntemler sunar. En yaygın olarak kullanılan üç boyutlu görüntüleme konfokal Z yığınlar (Şekil 2, B1 ve B4) bazı yazılım maksimum yoğunluğu çıkıntıları iken (örneğin, Zen ve Imaris), aynı zamanda, derin kısımlarında sinyali süzer şeffaflığı manzarası sunar epidermal tabaka olarak ifade yer alan süreçlerin veya gen bakarken yararlı olabilir numunesi (Şekil 2, B2). Sinyal yoğunluğu, ya piksel inte kullanılarak, tek bir renk (Şekil 2, B1) ile kodlanabilirnsity ya da bir renk kodu (Şekil 2, B4) kullanılarak.
Canlı konfokal görüntüleme sadece çiçek gelişimi için değerli kalitatif irdeliyoruz, aynı zamanda potansiyel olarak nicel veri zenginliği ile gelişimsel biyologlar sağlar. Farklı yazılım (örneğin Imaris, Fiji, Mars-ALT, MorphographX 15, 20, 21) sayısına ya da bir ya da daha muhabir ya da farklı hücrelerde bir raportör ekspresyon seviyesini gösteren hücrelerin hacim ölçümü için izin verir. Bu tür yazılımlar da, otomatik hücre segmentasyon gerçekleştirme hücre soylarından izlemek ve büyümeyi ölçmek için kullanılabilir. Bu, farklı yazılım benzer araçlar sunar, aynı zamanda birçok yönden farklıdır. Mars-ALT MorphoGraphX Imaris a farklı olarak, bitki 15, 20, 21 için özel olarak tasarlanmıştırnd Fiji. Imaris ve Mars-ALT bütün örneğin bölümlere ve analiz için izin verirken MorphoGraphX sadece epidermal tabakasının parçalara ve analiz edilmesine izin vermektedir. Bununla birlikte, Mars ALT üç farklı açılardan 15 aynı örnek önceden görüntüleme gerektirir ve Imaris yalnızca tek bir yığın gerektirir. nicel bilgiye erişim çiçek gelişiminin anlayışımızı ilerletmek için kritik öneme sahiptir.
Disclosures
Yazar ifşa hiçbir şey vardır.
Acknowledgments
Yazar, desteğinden ötürü Prof. Elliot M. Meyerowitz teşekkür etmek istiyorum ve teknik sorunları çözmede yardım için Caltech'te Biyolojik Görüntüleme Tesisinde Dartmouth Koleji ve Dr Andres Collazo de el yazması üzerinde yorum, hem de Ann Lavanway canlı eş odaklı görüntüleme. Nathanaël Prunet çalışmaları Elliot M. Meyerowitz Grant R01 GM104244 aracılığıyla Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90X maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40X water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
References
- Prunet, N., Jack, T. P. Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs. Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).
- Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development. FEBS J. , (2016).
- Heisler, M. G., et al. Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).
- Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex. Science. 310 (5748), 663-667 (2005).
- Yadav, R. K., et al. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex. Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).
- Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima. Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).
- Urbanus, S. L., et al. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 9, (2009).
- Hong, L., et al. Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging. Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).
- Roeder, A. H., et al. Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem. Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Dev. Biol. , (2016).
- Fernandez, R., et al. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. , (2010).
- Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).
- Irish, V. F., Sussex, I. M. Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development. Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).
- Vernoux, T., et al. The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex. Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX. Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).
