Summary
Levende konfokal billedbehandling giver biologer med et kraftfuldt værktøj til at studere udviklingen. Her præsenteres en detaljeret protokol for live konfokal billedbehandling for at udvikle Arabidopsis blomster.
Abstract
Studiet af planters vækst og udvikling har længe påberåbt eksperimentelle teknikker under anvendelse døde, fikserede væv og med dårlig cellulær opløsning. Nylige fremskridt i konfokalmikroskopi, kombineret med udviklingen af en lang række fluoroforer, har overvundet disse problemer og åbnede mulighed for at undersøge ekspressionen af flere gener samtidigt, med en god cellulær opløsning, i levende prøver. Levende konfokal billedbehandling giver plantebiologer med et kraftfuldt værktøj til at studere udviklingen, og har været flittigt brugt til at studere rodvækst og dannelsen af laterale organer på flankerne af skuddet apikale meristem. Men det har ikke været almindeligt anvendt til studiet af blomsten udvikling, dels på grund af udfordringer, der er specifikke for billeddannelse blomster, såsom bægerbladene, der vokser over blomsten meristem, og bortfiltrere fluorescens fra underliggende væv. Her præsenteres en detaljeret protokol til at optræde live konfokal billedbehandling på live, udvikling arabiskeidopsis blomsterknopper, der bruger enten en opretstående eller et omvendt mikroskop.
Introduction
Meste af plantelegemet danner post-embryonically fra grupper af stamceller beliggende ved eller i nærheden af spidsen - eller apikale meristemer - af skud og rødder. Alle overjordiske strukturer i voksen plante stammer fra skuddet apikale meristem (SAM), der kontinuerligt producerer laterale organer på dens flanker: blade i den vegetative fase, og blomster meristemerne (FMS) efter det overgange til den reproduktive fase. FM-stationer til gengæld udvikler sig til blomster. Mens Arabidopsis SAM producerer laterale organer én ad gangen, i en iterativ, spiralmønster, FM-stationer producere fire typer blomsterorganer inden for fire hvirvler, i en delvist synkron måde, med flere udviklingsprogrammer unraveling samtidigt. De genetiske netværk ligger til grund for specifikation af identiteten af de forskellige blomster organer er blevet delvist tydet (til anmeldelser, se referencer 1, 2), men mange aspekter af blomst development, såsom blomster organ positionering og definitionen af grænserne mellem hvirvler, forbliver dårligt forstået.
Tidlige molekylærgenetiske studier af plantens udvikling hovedsagelig påberåbt teknikker såsom in situ hybridisering og GUS reportere til at analysere genekspression. Mens disse metoder har givet et væld af oplysninger og i høj grad bidraget til vores forståelse af planters vækst og blomst udvikling, er der vigtige begrænsninger: de mangler god cellulære opløsning, ikke giver mulighed for let observation af udtrykket mønster af flere gener i den samme prøver, og vigtigere er, kan kun anvendes på døde, fikserede væv. Nylige fremskridt i konfokalmikroskopi har overvinde disse begrænsninger, og give udviklingsmæssige biologer med et kraftfuldt værktøj til at undersøge de processer underliggende plante morfogenese. Især konfokalmikroskopi giver mulighed for observation af levende væv og organer i hele deres dannelse, hvilket er critical til fuldt ud at forstå en indbegrebet dynamisk proces såsom udvikling.
Levende konfokal billeddannelse er blevet grundigt anvendt til at analysere antenne vækst af planter og produktionen af laterale organer ved SAM (f.eks referencer 3, 4, 5, 6), men med undtagelse af nogle få rapporter (f.eks referencer 7, 8, 9, 10), det har ikke været almindeligt anvendt til studiet af blomsten udvikling. Protokoller for levende konfokal billeddannelse af SAM er tilgængelige (fx referencer 11, 12), og giver et godt udgangspunkt for, hvordan til billedet udviklingslandene blomsterknopper, der omgiver SAM. Men billedbehandling blomsterknopper præsenterer særlige udfordringer: for eksempel,blomsterknopper hurtigt blive større end SAM, og i trin 4, bægerblade starte dækker FM (faser som beskrevet i reference 13), og dæmpning fluorescensen fra underliggende væv (figur 2A). Her giver vi en detaljeret protokol forklarer, hvordan at optræde live konfokal billedbehandling på at udvikle Arabidopsis blomsterknopper ved hjælp af enten en opretstående eller et omvendt mikroskop og en vand-dypning linse. Vi har tidligere udgivet denne protokol i henvisning 14.
Protocol
1. Medier og Retter Forberedelse
- Forberede dissekere retter ved at fylde runde plastkasser (ca. 6 cm bred, 2 cm dyb) til 0,5 cm med 2% agarose.
- Forbered billeddannelse retter.
- For en opretstående konfokalmikroskop, fylde rektangulære plast hængslede kasser (ca. 7 cm lang, 4,5 cm bred, 3 cm dyb) til 0,5 cm med billeddannende medie (se afsnit 1.3, "Imaging medium", figur 1F).
- For et omvendt konfokalt mikroskop: fylde lille petriskål (ca. 3,5 cm bred, 1 cm dyb) nøjagtigt til randen med billeddannende medie (se afsnit 1.3, "Imaging medium", figur 1G).
- Forberede billeddannende medie.
- For enkelt punkt billeddannelse, anvendes 1% agarose.
- Til tidsforskudte eksperimenter bruge apex vækstmedium (0,5x Murashige og Skoog basal saltblanding uden vitamin, 1% saccharose, 0,8% agarose, pH 5,8 med kalium- hydroxide opløsning, tilsat vitamin [0,01% myo-inositol, 0,0001% nicotinsyre, 0,0001% pyridoxinhydrochlorid, 0,001% thiamin-hydrochlorid, 0,0002% glycin] og cytokinin [500 nM N6-benzyladenin]) 15.
2. Plant Growth
- Sow steriliserede frø på MS-plader (0,5 eller 1x Murashige og Skoog basal saltblanding uden vitamin, 0,8% agar, pH 5,8 med kaliumhydroxidopløsning) med passende udvælgelse. Place plader i lang dag (16 timer lys) eller kontinuerlig dag, 16-22 ° C Betingelser for to uger.
- Stiklingerne udplantes på jord med tilstrækkelig afstand til at tillade robust udvikling. Placer planter i kort dag, 16-22 ° C betingelser for tre uger.
BEMÆRK: Dyrkning planter i lang dag eller kontinuerlig dag betingelser direkte efter omplantning resultater i tidlig blomstring og blomsterstande, der er mindre kraftig, og meget sværere at dissekere. Tilsvarende forlader planter under kort dag conditioner i mere end tre uger resulterer i daglængde-uafhængig blomstring og blomsterstande, der er mindre kraftig. - Overfør planter til lang dag (16 timer lys) eller kontinuerlig dag, 16-22 ° C betingelser, indtil de blomstrer. Shoot spidser er lettest at dissekere når blomsterstanden er 2-10 cm lang.
3. Dissektion af Shoot Apex
- Valgfrit: Ved hjælp af en fin skarphed sten og en dråbe let olie, skærpe pincet under stereomikroskop for at gøre dem klinge-lignende, ikke pege-lignende.
- Fjern langskulpe, ældre blomsterknopper og sekundære blomsterstande fra den primære blomsterstand ved at skubbe bunden af stilke med pincet, indtil de knækker. Fjerne så mange blomster som muligt uden forstørrelse (figur 1, sammenlign A og B).
- Med pincet, gennembore et lodret hul i agarose af en dissekere skålen, afbrød de sidste 0,5 cm af blomsterstanden og holde det lodret i agarose. Det resterendeblomsterknopper skal være over agarose overflade.
- Fyld imaging fad med sterilt, deioniseret vand, så skudspidsen er fuldt nedsænket. Placer dissekere skålen under stereomikroskop, og fjerne luften klemme ved skudspidsen ved at skabe vandstråler med en 1.000 pi pipette (figur 1, sammenlign C og D).
- Under stereomikroskop, bruge tangen til at fjerne blomsterknopper, der ikke skal afbildes ved at skubbe på bunden af stilken eller toppen af knop indtil Skaftet pauser (figur 1E). Det er vigtigt, at stilke bryde rent ved krydset med stammen, som efterladenskaber stilke hindrer fjernelsen af unge blomsterknopper.
- Hvis imaging kun blomsterknopper stage 5 og yngre (figur 2A), fjerne vandet før dissekere trin 6-8 blomsterknopper. Hvis billedbehandling blomsterknopper stadie 5 og ældre, fortsæt til bægerblad ablation (se afsnit 5.1). Ellers proCEED til trin 3.7.
- Ved hjælp af pincet, gennembore et lodret hul i mediet af en billeddannende fad, og holde det dissekerede spidsen oprejst i mediet, så kun skyde apikale meristem og de omkringliggende blomsterknopper er over overfladen af mediet. Afhængigt af hvilken blomsterknop (e), der skal afbildes, kan det være nødvendigt med en mindre vippe prøven, som blomsterknopper ikke nødvendigvis orienteret nøjagtigt ligesom skaftet (figur 2A).
- Fortsæt til farvning af prøven, hvis nødvendigt. Hvis ikke farvning og / eller billeddannelse af prøven med det samme, tilsæt vand og luk billedbehandling parabol for at undgå dehydrering. Hvis du bruger et omvendt mikroskop, placere den billeddannende fadet i en gennemsigtig plast kasse og lukke den.
Figur 1: Fremstilling af skudspidser for levende konfokal billeddannelse. (A - E) Dissektion af enskyde apex til billeddannelse. Blomsterstand før (A) og efter (B) fjernelse af langskulpe og ældre blomster. (C - D) Shoot apex nedsænket i vand i dissekere fad, med en luftboble fanget på spidsen (C) og efter fjernelse af luftboblen (D). (E) Shoot apex i dissekere fad, efter dissektion af blomsterknopper ældre end stadie 5. (F - G) Udsigt over skudspidser i billedbehandling fad, på scenen af en opretstående (F) og omvendt (G) konfokalmikroskop . I (F), er en 40X vand-dypning linse placeret over en af toppunkterne, med spidsen af linsen nedsænket i vand. I (G), er skudspidsen placeret på hovedet over 40X vand-dypning linse, med en vandsøjle forbinder det billeddannende medie til spidsen af linsen. Den mindre panel i (F) viser en HIGhendes forstørrelse udsigt over området i det røde rektangel, med en skudspidsen indsat i billeddannende medie; røde og blå linjer angiver overfladen af mediet og vand hhv. (H - I) Eksempler på skræddersyede enheder, der giver tilføje mere vand ved spidsen af vand-dypning linse: en silikonegummi muffe fremstillet af en tændrørsmuffen (H), og en improviseret muffe fremstillet fra fingeren af en pulverfrit latexhandske (G). Skalapanelerne = 0,5 cm i (A) og (B), 0,1 cm i (C) og (D) og 100 um i (E). Dette tal blev oprindeligt offentliggjort i henvisning 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Farvning
BEMÆRK: Cell vægge eller plasmamembraner kan farves med propidiumiodid eller FM4-64 henholdsvis at opnå cellulære beslutningunder afbildning. Alternativt kan reporter linjer med fluorescerende proteiner tagget til plasmamembranen anvendes 6, 16.
- Fjern vand fra imaging fad, og sikre overfladen af mediet er tør at undgå fortynding af farvestoffet.
- Under stereomikroskop, anvende 20 til 30 pi af enten 1 mg / ml propidiumiodid opløsning eller 80 pg / ml FM4-64 opløsning til det dissekerede toppunkt med en 10 pi pipette. Sørg for, at hele prøven er dækket i farvestof for at sikre en homogen farvning.
- Farvning for 2 min, hvis anvendelse propidiumiodid, eller 20 min hvis anvendelse FM4-64.
- Skylles to gange med sterilt, deioniseret vand.
5. Sepal Ablation
BEMÆRK: På scenen 4, bægerblad primordier starte dækker FM. Som de vokser, de bortfiltrere fluorescensen fra underliggende væv, og hindre den billeddannende proces. Bægerblade kan enten fjernes manuelt med en metalstift Mounted på en pin-skruestik, eller forhindres at vokse ved hjælp af laser ablation om nye bægerblad primordier. Alternativt er det muligt i visse tilfælde at anvende mutanter, såsom apetala1-1, hvor bægerblade mangler eller erstattet med bladlignende organer, som ikke dækker FM mens den centrale del af blomsten udvikler normalt (figur 2F) 17.
- Bægerblad ablation på blomsterknopper stage 5 og ældre med en nål-skruestik holder en lige metalnål (figur 2, E1-E2)
- Placer dissekere fad med det dissekerede spidsen under stereomikroskop, og indstille forstørrelsen til maksimum. Fordybe skudspidsen i sterilt, deioniseret vand, eller alternativt anvende en 1.000 pi pipette til at anvende vand til skudspidsen regelmæssigt, mens dissekere bægerbladene.
- Med pin-skruestik, placere stiften på toppen af abaxial bægerblad, tangentielt i forhold til skudspidsen. Skub forsigtigt bægerblad væk fra skudspidsen indtil det bryder vækfra blomsterknop.
- Fortsæt på samme måde med den adaxial bægerblad, men skubbe bægerblad mod skudspidsen.
- Fortsæt på samme måde med de laterale bægerblade, men positionere stiften radialt i forhold til skudspidsen, og skub bægerblade til siden, bort fra blomsterknop.
- Fordyb skudspidsen i sterilt, deioniseret vand i et par minutter for at undgå dehydrering.
- Laser ablation af bægerblad primordier i trin 3-4 (figur 2, C5-D5)
- Placer imaging skål med plettet, dissekeret spids på konfokalmikroskop scenen. Find og fokusere på spidsen, som om at forberede til billedet det (se afsnit 6, "imaging setup").
- Brug af laser-ablation systemsoftware, definere ablationszonen, hvilket svarer til toppen og spidsen af spirende bægerblad primordier før de begynder at dække blomsten meristem (typisk på trin 3 for abaxial og adaxial bægerblade, og på sene stadie 3 / tidlig trin 4 til lateral sevenner).
- Indstil laser magt og bolig tid til passende parametre til ablation nok celler uden at påføre for meget skade på det underliggende væv. Typisk, afhængigt af laserablationssystem anvendes, passende parametre i første omgang skal identificeres gennem en trial-and-error proces at sikre, at tilstrækkeligt mange celler fjernes for at forhindre bægerbladene efterfølgende at vokse over FM, uden at påvirke resten af blomsten knop. Brug for meget laser magt og bolig tid resulterer i skader på midten af blomsten, der påvirker dens vækst og / eller overlevelse. Når de rette parametre er blevet identificeret, kan de genbruges til efterfølgende eksperimenter.
BEMÆRK: Hvis den oprindelige ablation viser sig utilstrækkelig, er det muligt at gå videre til en anden ablation på følgende dage (figur 2, C4 og D2).
6. Imaging Setup
- Brug en opretstående mikroskop.
BEMÆRK: Når billeddannelse med en opretstående mikroskop kan flere spidser placeres i samme billedbehandling fad. Men hvis den billeddannende proces varer mere end en time, propidiumiodid tendens, der skal fortyndes, og nogle prøver kan have behov re-farvning før billeddannelse. - Placer billeddannende skålen på mikroskopbordet (figur 1F). Sænk vand-dypning linse og løfte bordet, således at spidsen af linsen dips i vandet. Gå forsigtigt for ikke at knuse dissekerede spidserne eller dyppe linsen i det billeddannende medie.
- Hvis en luftboble er fanget på spidsen af linsen, gør vandstråler med en 1.000 pi pipette for at fjerne det.
- Under epifluorescensbelysning, position en af de dissekerede spidser ind i linsen felt ved hjælp af XY controller. Kig gennem okularerne og fokusere på prøven ved hjælp af Z-controller. Gå forsigtigt for ikke at knuse prøven.
- Brug af konfokalmikroskop software, zoome på blomsterknop, der skal afbildes, og gå videre til imaging din prøve.
- Ved anvendelse af en 1.000 pi pipette, sætte en dråbe sterilt, deioniseret vand på spidsen af linsen.
- Hold imaging parabol på hovedet, og med en 1000 uL pipette, tilsættes en dråbe sterilt, deioniseret vand til det dissekerede spidsen.
- Placer billeddannende skålen på hovedet på mikroskopbordet (figur 1G). Gå forsigtigt for ikke at knuse prøven.
- Under epifluorescensbelysning, placere det dissekerede apex over spidsen af linsen ved hjælp XY controller. Med Z controller, omhyggeligt sænke bordet, indtil prøven når den dråbe vand på spidsen af linsen. En vandsøjlen bør udgøre between spidsen af linsen og mediet.
- Hvis vandsøjlen ikke danner, tilsættes forsigtigt en dråbe vand til prøven med en 1.000 pi pipette. Tilføje interimistiske muffer til linsen for at tilføje mere vand ved sin spids, hvilket letter etablering og vedligeholdelse af vandsøjlen (figur 1H og 1I).
- Under epifluorescensbelysning, se gennem okularerne og fokusere på prøven ved hjælp af Z-controller. Gå forsigtigt for ikke at knuse prøven.
- Brug af konfokalmikroskop software, zoome på blomsterknop, der skal afbildes, og fortsæt til billeddannelse prøven.
BEMÆRK: Mens celler i udvikping blomster organer kan opdele hurtigere, celler i blomstret meristem kløft én eller to gange hver anden dag, og cellelinier er let at spore med tidspunkter hver 24 timer. Men hvis det bliver nødvendigt, er det muligt at billedet prøverne hver sjette time.
7. Overvejelser om Imaging Parametre
BEMÆRK: Sådan opsættes de billeddannende parametre afhænger meget af den konfokal system, der anvendes. Nedenfor er forslag til nogle af disse parametre, der kan bruges med enhver konfokalmikroskop. For flere overvejelser om de billeddannende parametre, se afsnittet Diskussion og referere 14.
- For XY opløsning: bruge 1.024 x 1.024 for en god cellulær opløsning. Alternativt, brug 512 x 512 for at reducere afbildningstiden, på bekostning af beslutningen.
- For Z opløsning: indstil trin-størrelse til 0,5-1,5 um. Sænkning af trin-størrelse øger Z opløsning, men også afbildningstiden.
8. Visualisering af Konfokal data
- Drej stillbilleder af tidspunkter af blomsten udvikling til en film.
- Åbn stillbilleder (i JPEG eller TIF-format) i softwaren (fx, Fiji).
- Gå til Billede> Stakke> Billeder til Stack. De åbne billeder vil blive grupperet i en stak.
- Hvis rækkefølgen af billederne i stakken ikke svarer til den kronologiske rækkefølge, skal du bruge Stack Sorter plugin (Plugins> Stakke> Stak Sorter) for at omorganisere dem.
- For at vende stakken til en film, gå til Filer> Gem som> AVI.
Representative Results
Figur 2 viser forskellige visninger af konfokal Z-stakke af levende Arabidopsis blomsterknopper udtrykker forskellige fluorescerende reportergener og farvet med enten propidiumiodid (figur 2, A-C5 og G) eller FM4-64 (figur 2, E1-F) til giver et klart cellulær opløsning. Fleste konfokale systemer giver mulighed for billeddannelse af to fluorophorer med ikke-overlappende emissionsspektre såsom GFP eller YFP sammen med enten propidiumiodid eller FM4-64 (figur 2A - 2F). De bedste konfokale systemer er også i stand til at adskille flere fluoroforer med delvis overlappende emissionsspektre i de samme prøver, såsom GFP og YFP, og dsRed og propidiumiodid (fig 2G).
Tre eksempler på tidsforskudte forsøg er vist i figur2 og viser blomsterknopper udvikler sig normalt efter bægerblad ablation blev udført enten med en laser ablation (figur 2, C1-C5 og D1-D5) eller manuelt med en tap-skruestik og en metalstift (figur 2, E1-E2). Bemærk, at blomsterknop vist i figur 2, E1-E2 er fra en superman-1 mutant plante, hvilket er grunden til frugtbladsklapper primordier ikke overholdes i midten af opløbet på scenen 7. Laser ablation af nye bægerblad primordier af blomsterknop vist i figur 2, C1-C5 forhindrer dem i at dække FM, som stadig kan afbildes på trin 5 (figur 2, C5). Omvendt er det i tilfælde af blomsterknop vist i figur 2, D1-D5, laserablation kun forsinket bægerblad vækst, men bægerblade sidste ende voksede til at dække det meste af FM ved trin 5 (figur 2, D5
Figur 2: Visualisering af konfokale Z-stakke af levende blomsterknopper. A og B2 er udsigt gennemsigtighed; B1 og B4-G er maksimale intensitet fremspring; B3 er et ortogonalt skive visning. (A - E2) blomster udtrykker et Venus reporter for apetala3 genet (grøn); cellevægge blev farvet med propidiumiodid (rød, bortset B4, grøn). (A) Blomsterstand; tal angiver blomsteragtige etaper; bægerblade i trin 4 og 5 blomster bortfiltrere fluorescensen af Venus reporter, som normalt forms en ring. Bemærk, at nogle blomsterknopper synes vippes i forhold til blomsterstanden. (B1 - B4) Fire forskellige visninger af samme konfokal Z-stabel af en fase 5 blomsterknop: maksimale projektioner intensitet (B1 og B4) med Venus signalintensiteten kodet med pixel intensitet i grøn farve (B1) eller med ild farvekode (B4; farvekode er vist ved bunden af panelet); gennemsigtighed visning (B2) og ortogonale skive visning (B3, XY, XZ og YZ orientering af skiverne er angivet i panel). (C1 - C5) 4-dages tidsforløb af en individuel blomsterknop fra trin 3 til trin 5; laserablationer (markeret som hvide træk) udført på dag 1 og dag 3 var tilstrækkelig til at forhindre de bægerblade fra dækker midten af blomsterknop i trin 5. (D1 - D5) 4-dages tidsforløb af en individuel blomsterknop fra scene3 til trin 5; laserablationer udført på dag 1, 2 og 3 var utilstrækkelige til at forhindre bægerblade fra dækker midten af blomsterknop. (E1 - E2) Individuel blomsterknop efter manuel fjernelse af abaxial og adaxial bægerblade (E1), og af alle bægerblade (E2); hvide pilespidser angiver resterende bægerblade; hvide stjerner angiver ar følge af fjernelsen af bægerblade. (F) trin 7 apetala1-1 blomst udtrykker et DR5-3xVenusN7 reporter 18 (grøn); plasmamembraner blev farvet med FM4-64 (rød); blå pilespidser angiver blad-lignende strukturer, som erstatter bægerblade og ikke dækker blomsterknop. (G) Trin 4 blomsterknop udtrykker et fluorescerende GFP reporter for Dornröschen-LIGNENDE 7 (grøn), en Venus reporter for SUPERMAN (rød) og en dsRed reporter for CLAVATA3 19 (cyan); cellervægge blev farvet med propidiumiodid (grå). d: dag; st: fase. Målestok = 25 um; skala er identisk i B1, B2 og B4, i C1-C5 og D1-D5. Dette tal blev modificeret fra henvisningen 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her giver vi en protokol for billeddannelse af levende, udvikling Arabidopsis blomsterknopper med en konfokal mikroskop og en vand-dypning linse. Selv om dette kan gøres med enten en opretstående eller et omvendt mikroskop, er det nemmere og hurtigere at bruge den tidligere. Det er også værd at bemærke, at forskellige konfokale systemer varierer betydeligt med hensyn til hastighed, følsomhed og evne til at adskille bølgelængder. De bedste konfokale mikroskoper tillader nu at afbilde flere forskellige kanaler (f.eks GFP, YFP, dsRed og propidiumiodid; Figur 2G) i de samme prøver. Nogle konfokale mikroskoper er udstyret med en spektral detektor, som kan opsamle fluorescens fra flere fluorophorer samtidig og adskille dem bagefter. Ved brug af en almindelig detektor, men et sæt af lasere og filtre skal bruges til at begejstre og adskille fluorescens fra forskellige fluoroforer. Nogle fluoroforer har fuldt distinkt emission spektre (f.eks FFP etd YFP), og kan afbildes samtidigt. Andre fluorophorer har delvist overlappende emissionsspektre (f.eks GFP og YFP), og som regel skal afbildes separat, hvilket øger afbildningstiden. Billeddannelse nære fluorophorer ofte kræver også begrænse hvor meget af spektret opsamles for hver kanal for at forhindre fluorescens fra en fluorofor i at lække ind i en anden kanal. Dette forårsager et tab af intensitet af det opsamlede signal, som kan kompenseres ved en stigning i lasereffekt og forstærkning. forlænget afbildningstiden og øget lasereffekt kan dog blege og / eller beskadige prøven. Øget laser magt og / eller gevinst kan også øge baggrundsstøj. Optimering af signalintensiteten, opløsning og billeddannelse tid for hver prøve sker gennem en trial-and-error proces og involverer permanente kompromisser.
Denne protokol forklarer, hvordan at optræde live konfokal billeddannelse af blomsterknopper udvikler på flankerne af en dissekeret skudspidsen. Detkan argumenteres, at det forhold, at skudspidsen ikke er forbundet med resten af anlægget og vokser i et medium, der indeholder cytokininer kan påvirke SAM og blomster udvikling. Imidlertid blev dette medium designet empirisk gennem en trial-and-error proces for at sikre det dissekerede skyde apikale dannelsesvæv producere nye blomsterknopper ved den normale plastochron, og at disse blomsterknopper udvikle sig normalt 15. Heller ikke bægerblad dissektion ikke at påvirke genekspressionsmønstre eller udvikling af resten af blomsten. Andre protokoller detaljer, hvordan at optræde live konfokal billeddannelse af SAM stadig fastgjort til resten af planten (f.eks referere 11). Sådanne protokoller kunne tilpasses til, og tilbyder et nyttigt alternativ til billeddannelse udvikle blomster, især når studerer cytokinin-relaterede processer. De præsenterer adskillige ulemper dog: stilken elongates og drejninger, og ændrer orienteringen af blomsterknopper; -ennd mens billeddannelse en skudspidsen knyttet til resten af planten fungerer godt med en opretstående mikroskop, er det langt mere kompliceret at gøre det med et omvendt mikroskop.
Nedsænkning linser har en bedre numerisk åbning (NA) end "tørre" linser (dvs. linser, der er adskilt fra prøven ved luft), og giver derfor en finere opløsning af prøven, hvilket er kritisk, når der anvendes et konfokalt mikroskop. Ved hjælp af en vand-dypning linse giver således en meget bedre NA end en tør linse, og samtidig forhindre skudspidsen fra dehydrering under billedbehandling processen. Mens glycerin og olie linser har en endnu højere NA end vand linser, de kræver brug af et dækglas, hvilket er meget upraktisk med en prøve på størrelse med en skudspidsen, som også fortsætter med at vokse under tidsforskudt eksperimenter. Givet størrelsen af prøverne (afhængig af blomster stadier, kan stakke være over 150 um tyk), er det også vigtigt at anvende en linse med en lang arbejdsafstand. Vi bruger typisk en 20 eller 40X objektiv med en NA på 1 og en arbejdsafstand på 1,7-2,5 mm.
Konfokal mikroskop software tilbyder flere måder at visualisere konfokale data, herunder tredimensionelle rekonstruktioner (Figur 2, B1, B2 og B4) og udsigt skive (Figur 2, B3). Mens de mest almindeligt anvendte tredimensionale synspunkter er maksimale projektioner af konfokal Z-stakke (figur 2, B1 og B4), noget software intensitet (f.eks ZEN og Imaris) har også udsigt gennemsigtighed som filtrerer signalet fra de dybere dele af prøven (figur 2, B2), hvilket kan være nyttigt, når man ser på processer, der finder sted, eller gener udtrykt i det epidermale lag. Signalintensitet kan enten være kodet med en enkelt farve (figur 2, B1) ved anvendelse pixel intensity, eller under anvendelse af en farvekode (figur 2, B4).
Levende konfokal imaging tilbyder ikke kun værdifuld kvalitative indsigter i blomst udvikling, det også potentielt giver udviklingsmæssige biologer med et væld af kvantitative data. Forskellige software (f.eks Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) giver mulighed for kvantificering af antallet eller volumenet af celler, der udtrykker et eller flere reportere, eller niveauet af ekspression af et reporter i forskellige celler. Sådan software kan også bruges til at udføre automatisk celle segmentering, spore cellelinjer og kvantificere vækst. Denne forskellige software tilbyder lignende værktøjer, men også adskiller sig på mange måder. MARS-ALT og MorphoGraphX blev designet specielt til planter 15, 20, 21, i modsætning Imaris ennd Fiji. MorphoGraphX kun tillader segmentering og analyse af det epidermale lag, mens Imaris og MARS-ALT muliggøre segmentering og analyse af hele prøven. Men MARS-ALT kræver forudgående billeddannelse af samme prøve fra tre forskellige vinkler 15, og Imaris kun kræver en enkelt stak. Adgang til kvantitative oplysninger er afgørende for at fremme vores forståelse af blomst udvikling.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatteren vil gerne takke professor Elliot M. Meyerowitz for hans støtte, og kommentarer til manuskriptet, samt Ann Lavanway på Dartmouth College og Dr. Andres Collazo på Biologisk Imaging Facility på Caltech for deres hjælp til at løse tekniske problemer med den levende konfokal billeddannelse. Nathanaël Prunet arbejde er støttet af det amerikanske National Institutes of Health gennem Grant R01 GM104244 til Elliot M. Meyerowitz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90X maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40X water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
References
- Prunet, N., Jack, T. P. Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs. Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).
- Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development. FEBS J. , (2016).
- Heisler, M. G., et al. Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).
- Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex. Science. 310 (5748), 663-667 (2005).
- Yadav, R. K., et al. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex. Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).
- Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima. Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).
- Urbanus, S. L., et al. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 9, (2009).
- Hong, L., et al. Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging. Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).
- Roeder, A. H., et al. Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem. Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Dev. Biol. , (2016).
- Fernandez, R., et al. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. , (2010).
- Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).
- Irish, V. F., Sussex, I. M. Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development. Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).
- Vernoux, T., et al. The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex. Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX. Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).
