Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55255
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

Summary

هنا، ونحن بالتفصيل طريقة S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجينة (سبلاش)، والتي تمكن رسم الخرائط على نطاق الجينوم التفاعلات داخل الجزيئات وبين الجزيئات رنا-رنا في الجسم الحي . سبلاش يمكن تطبيقها لدراسة رنا تفاعلات الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة والبكتيريا والبشر.

Abstract

معرفة كيفية تفاعل الحمض النووي الريبي مع أنفسهم ومع الآخرين هو المفتاح لفهم تنظيم الجينات رنا على أساس في الخلية. في حين أظهرت أمثلة على التفاعلات الحمض النووي الريبي رنا مثل التفاعلات الرنا الميكروي-مرنا لتنظيم التعبير الجيني، والمدى الكامل لتفاعلات الحمض النووي الريبي تحدث في الخلية لا يزال مجهولا. الأساليب السابقة لدراسة التفاعلات الحمض النووي الريبي ركزت في المقام الأول على مجموعات فرعية من الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع بروتين معين أو أنواع الحمض النووي الريبي. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة اسمها S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجين (سبلاش) التي تسمح التقاط الجينوم واسعة من التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي بطريقة غير منحازة. سبلاش يستخدم في الجسم الحي كروسلينكينغ، ربط القرب، وارتفاع تسلسل الإنتاجية لتحديد الجزيئات داخل الجزيئات و بين الجزيئات شركاء الاقتران على الصعيد العالمي. سبلاش يمكن تطبيقها على الكائنات الحية المختلفة بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية، وكذلكs الظروف الخلوية المتنوعة لتسهيل فهم ديناميات منظمة رنا تحت السياقات الخلوية المتنوعة. كامل بروتوكول سبلاش التجريبية يستغرق حوالي 5 أيام لإكمال وسير العمل الحسابي يستغرق حوالي 7 أيام لإكمال.

Introduction

دراسة كيفية جزيئات أضعاف وتفاعل مع بعضها البعض هو المفتاح لفهم تنظيم الجينات في الخلية. في حين تم تركيز الكثير من الجهد في العقد الماضي على فهم كيفية مساهمة الحمض النووي والبروتينات في تنظيم الجينات، أقل نسبيا هو معروف عن تنظيم ما بعد النسخي التعبير الجيني. الحمض النووي الريبي يحمل المعلومات في كل من تسلسلها الخطي وفي هيكلها الثانوي والثالث 1 . قدرتها على قاعدة الزوج مع نفسها ومع الآخرين مهم لوظيفتها في الجسم الحي . وقد وفرت التطورات الأخيرة في إنتاجية عالية رنا التحقيق هيكل الثانوي رؤى قيمة في مواقع المناطق مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل في ترانسكريبتوم 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، هاولا تزال المعلومات المتعلقة بشركاء التفاعل المقترن مفقودة إلى حد كبير. لتحديد تسلسل الحمض النووي الريبي الذي يتفاعل مع منطقة رنا أخرى في ترانسكريبتوم، نحن بحاجة إلى المعلومات العالمية الحكمة.

إن رسم خرائط تفاعلات الحمض الريبي النووي (رنا) بين الزوجين بطريقة عالمية وغير منحازة كان تقليديا تحديا كبيرا. في حين أن النهج السابقة، مثل كلاش 9 ، هيكليب 10 و راب 11 ، وتستخدم لتحديد تفاعلات الحمض النووي الريبي على نطاق واسع، وهذه التقنيات عادة رسم الاقتران قاعدة الحمض النووي الريبي لمجموعة فرعية من الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع بروتين معين أو أنواع الحمض النووي الريبي. وتشمل التطورات الأخيرة في دراسة التفاعلات رنا العالمية طريقة ربل 12 ، والتي لا استقرار التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي ، وبالتالي قد التقاط فقط مجموعة فرعية من التفاعلات في الجسم الحي . وللتغلب على هذه التحديات، طورنا نحن وغيرهم استراتيجيات غير متحيزة على نطاق الجينومp رنا إنتيراكتوميس في الجسم الحي ، وذلك باستخدام إصدارات معدلة من سبورالين كروسلينكر 13 ، 14 ، 15 . في هذا البروتوكول، ونحن تصف تفاصيل لأداء S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجين (سبلاش)، والذي يستخدم السورالين البيروكسيديز لربط كروتينك قاعدة رنا في الجسم الحي ، تليها ربط القرب وارتفاع تسلسل الإنتاجية إلى تحديد الحمض النووي الريبي قاعدة الاقتران الشركاء الجينوم واسعة ( الشكل 1 ) 15 .

في هذه المخطوطة، ونحن تصف الخطوات لأداء سبلاش باستخدام الخلايا الملتصقة مثقف، في هذه الحالة خلايا هيلا. نفس البروتوكول يمكن أن تتكيف بسهولة لخلايا الثدييات تعليق والخميرة والبكتيريا الخلايا. لفترة وجيزة، يتم معالجة الخلايا هيلا مع السورالين البيروكسيديز والأشعة في 365 نانومتر إلى كروسلينك التفاعل أزواج قاعدة الحمض النووي الريبي في الجسم الحي. ثم يتم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا، مجزأة وإثراء لمناطق تشابك الارتباط باستخدام الخرز ستريبتافيدين. ثم يتم ربط ليغاتد شظايا التفاعل الحمض النووي الريبي معا باستخدام ربط القرب وجعلها إلى مكتبة [كدنا] لتسلسل عميق. عند التسلسل، يتم تعيين رنا الخيميري على ترانسكريبتوم / الجينوم لتحديد المناطق التفاعلية رنا التي يتم إقرانها مع بعضها البعض. لقد استخدمت بنجاح سبلاش لتحديد الآلاف من التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي في الخميرة والخلايا البشرية المختلفة، بما في ذلك الجزيئات داخل الجزيئات و بينا الجزيئات الاقتران في فئات متنوعة من الحمض النووي الريبي، مثل سنورناس، لكرناس و مرناس، لمحة عن التنظيم الهيكلي وأنماط التفاعل من رنا في الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. علاج خلايا هيلا مع السورالين بيوتينيلاتد واستخراج الحمض النووي الريبي

  1. ثقافة خلايا هيلا في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تستكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس) و 1٪ البنسلين الستربتومايسين (بس) في لوحة 10 سم.
  2. غسل خلايا هيلا مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. استنزاف بس الزائدة تماما من الطبق عن طريق وضع الطبق عموديا لمدة 1 دقيقة.
  3. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 200 ميكرومتر من السورالين البيروكسيديز و 0.01٪ ث / د ديجيتونين، إلى الخلايا بشكل موحد واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. في حين أن السورالين البيروكسيديز يمكن أن يدخل الخلية، نفاذية له هو أعلى بكثير عندما تتعرض الخلايا لكميات قليلة من ديجيتونين (0.01٪) لمدة 5 دقائق
  4. إزالة غطاء لوحة 10 سم تحتوي على خلايا هيلا المعالجة ووضع الطبق شقة على الجليد. إشعاع طبق يحتوي على الخلايا مع 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة على الجليد، على مسافة 3 سم من لمبات الأشعة فوق البنفسجية، وذلك باستخدام كروسلينكر الأشعة فوق البنفسجية.
  5. عزل tرنا أوتل من خلايا هيلا بواسطة غوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-الكلوروفورم استخراج بعد بروتوكول الشركة المصنعة. إضافة 1: 1 حجم الأيزوبروبانول لترسب الحمض النووي الريبي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية في الأيزوبروبانول إلى أجل غير مسمى. لا يمكن أن يؤديها لطخة نقطة في هذه الخطوة للتحقق من أن السورالين البيروكسيديز قد دخلت بنجاح الخلايا ولها رنا كروسلينكد في الجسم الحي ( الشكل 2 ).
  6. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ إلى بيليه رنا لغسل الحمض النووي الريبي.
  7. الطرد المركزي العينات في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. إضافة نوكليس خالية من المياه إلى بيليه رنا وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد ولاش تجميد في النيتروجين السائل.

2. تجزئة الحمض النووي الريبي

  1. سخن 15 ميكرولتر من 2X رنا العازلة تجزئة و 10 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام / ميكرولتر) بشكل فردي في أنابيب 0.2 مل ير، في 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. مزيج 10 ميكرولتر من ساخنة 2X رنا العازلة تجزئة مع 10 ميكرولتر عينة الحمض النووي الريبي التي بيبتينغ صعودا وهبوطا. احتضان العينة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وقف رد فعل من قبل المفاجئة تبريد رد فعل على الجليد.
  2. نقل وتجميع ردود الفعل 2 تجزئة إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. إضافة 40 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى رد فعل، 10 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الايثانول 100٪ إلى رد فعل تجزئة. احتضان الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل لترسيب الحمض النووي الريبي.
  3. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة، وإزالة طاف وغسل الحمض النووي الريبي باستخدام 1 مل من الايثانول 70٪.
  4. الطرد المركزي رنا في 20،000 زغ لمدة 15 دقيقة، ريمفوق طاف وحل رنا في 20 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس.

3. الحمض النووي الريبي حجم اختيار وشطف

  1. إضافة 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى الحمض النووي الريبي المستردة في أنبوب ميكروفوج. تسخين الحمض النووي الريبي مع صبغ تحميل الحمض النووي الريبي في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  2. إضافة 3 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى 0.25 ميكرولتر من 10 نت سلم الحمض النووي في أنبوب ميكروفوج. تسخين السلم في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  3. تحميل سلم التشويه والتحريف على 8.6 سم × 6.8 سم 6٪ تب اليوريا هلام وحجم تجزئ بواسطة الكهربائي لمدة 40 دقيقة في 180 V. وصمة عار هلام في 10 مل من العازلة تب تحتوي على 1: 10،000 من حمض هلام وصمة عار لمدة 5 دقيقة في الظلام.
  4. ثقب نظيفة 0.6 مل أنبوب ميكروفوج في الجزء السفلي باستخدام إبرة 24 G ووضعه في أنبوب ميكروفوج 2 مل.
  5. تصور العصابات على هلام ما بعد الملون باستخدام ترانزيلوميناتور وقطع شريحة هلام المقابلة ل 90-110 نت. نقل شريحة هلام في أنبوب مثقب 0.6 مل ميكروفوج في أنبوب ميكروفوج 2 مل. يتم تنفيذ هذا التحديد حجم للسماح للشظايا الخيميري أن يكون الحد الأدنى لطول لخريطة ل ترانسكريبتوم والتمييز بين المنتجات ليغاتد القرب مقابل المنتجات أونليغاتد في الخطوات اختيار حجم المصب.
  6. أجهزة الطرد المركزي شرائح هلام في 12000 زغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة لتمزيق شريحة هلام وجمعه في أنبوب ميكروفوج 2 مل. تجاهل فارغة 0.6 مل ميكروفوج أنبوب. إضافة 700 ميكرولتر من العازلة شطف لشريحة هلام تمزيقه في أنبوب ميكروفوج 2 مل واحتضان عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع دوران مستمر، للسماح نشر العينات في المخزن المؤقت.
  7. نقل شرائح هلام والعازلة شطف لتصفية أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 2 دقيقة. سيتم حبس شرائح هلام في الجزء العلوي من مرشح. تجاهل شرائح هلام وأعلى المقصورة.
  8. إضافة 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 700 ميكرولتر من الأيزوبروبانول 100٪ إلى الترشيح في أنبوب ميكروفوج وترسب الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: يمكن أن يعجل الحمض النووي الريبي في الأيزوبروبانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  9. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه رنا. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  10. إزالة غسل العازلة وإضافة 20 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند رنا. كوانتيتات تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.

4. إثراء المناطق المتشابكة رنا

  1. دوامة ستريبتافيدين المغلفة الخرز المغناطيسي بقوة ل ريسوسبيند الخرز متجانسة في الأنبوب. نقل 100 ميكرولتر من الخرز إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل ووضعه على المغناطيسإيك الوقوف لمدة 1 دقيقة للسماح الخرز التمسك الجانب المغناطيسي من الأنبوب. إزالة المخزن المؤقت التخزين من الخرز بعناية واتخاذ أنبوب من موقف المغناطيس.
  2. إضافة 1 مل تحلل العازلة إلى الخرز في أنبوب ميكروفوج وماصة صعودا وهبوطا. وضع الخرز ميكروفوج التي تحتوي على موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة لفصل الخرز من غسل العازلة. كرر هذا لما مجموعه 3 يغسل.
  3. إزالة غسل العازلة من الخرز عن طريق وضع الخرز ميكروفوج تحتوي على موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. إضافة المانع ريبونوكلياز (1: 200) إلى العازلة تحلل وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى الخرز غسلها في أنبوب ميكروفوج.
  4. إضافة 2 مل من العازلة التهجين الطازجة، 1 مل من العازلة تحلل تستكمل، 1.5 ميكروغرام من حجم رنا مجزأة و 100 ميكرولتر من الخرز معلق إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية. دوامة الأنبوب بلطف.
  5. احتضان أنبوب الطرد المركزي المخروطية 15 مل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع نهاية إلى نهاية التناوب.قبل الحارة غسل العازلة عند 37 درجة مئوية.
  6. وضع 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية على موقف المغناطيسي لمدة 15 مل أنابيب لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من المخزن المؤقت. ماصة العازلة بعناية من الأنبوب وتجاهل ذلك.
  7. إضافة 1 مل من قبل غسلها العازلة غسل إلى الخرز، ماصة صعودا وهبوطا ونقل الخرز إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. احتضان في الخرز عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، مع نهاية إلى نهاية التناوب.
  8. طرد مركزي لفترة وجيزة أسفل محتويات أنبوب ميكروفوج. وضع 1.5 مل غسلها الخرز في أنابيب ميكروفوج على موقف المغناطيسي لمدة 2 مل أنابيب لمدة 1 دقيقة، لفصل الخرز من غسل العازلة. إزالة المخزن المؤقت من الخرز عن طريق بيبتينغ بلطف المخزن المؤقت للخروج من أنبوب ميكروفوج.
  9. إضافة 1 مل من قبل غسلها العازلة غسل إلى الخرز وماصة صعودا وهبوطا لتكرار غسل. إجراء ما مجموعه 5 يغسل. في نهاية غسل ال 5، إزالة العازلة غسل عن طريق وضع الخرز ميكروفوج التي تحتوي على موقف المغناطيس ل1 دقيقة.

5. ربط القرب

  1. إضافة 1 مل من الباردة T4 بولينوكليوتيد كيناز (بنك) العازلة إلى الخرز غسلها واحتضان الخرز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، مع نهاية إلى نهاية التناوب. وضع أنبوب ميكروفوج تحتوي على الخرز على الشريط المغناطيسي لمدة 1 دقيقة وإزالة بلطف العازلة T4 بنك. كرر هذه الخطوة لما مجموعه 2 يغسل وإزالة العازلة T4 بنك بعد غسل الماضي.
  2. إضافة المخازن المؤقتة إلى الخرز، وفقا للجدول 1 . لتمكين 3 'ينتهي من جزء رنا ليغاتد إلى 3' محولات أدناه، احتضان الخرز في المخزن المؤقت في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع التحريض المستمر لتحويل 3 'مجموعة الفوسفات الحلقية في نهاية الحمض النووي الريبي إلى 3 'أوه.
  3. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد الفعل السابق، وفقا للجدول 2 . لتمكين 5 'نهاية شظايا الحمض النووي الريبي لتكون ربط المختصة، احتضان رد فعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريض المستمر في وجود أتب، لتحويل 5 'أوه على الحمض النووي الريبي إلى 5' الفوسفات.
  4. إضافة المخزن المؤقت إلى رد الفعل السابق لأداء ربط القرب، وفقا للجدول 3 . احتضان رد فعل في 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، مع التحريض المستمر،
  5. وضع ميكروفوج تحتوي على رنا ليغاتد على موقف المغناطيس لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف بعناية وإضافة 1 مل من الغرفة درجة حرارة غسل العازلة إلى الخرز. ريسوسبيند التي كتبها بيبتينغ صعودا وهبوطا.
  6. وضع أنبوب ميكروفوج على موقف المغناطيس لمدة 1 دقيقة وإزالة العازلة غسل بعناية. إجراء ما مجموعه 2 يغسل، وإزالة العازلة غسل من الخرز في نهاية الغسيل الثاني.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من رنا بيكاي العازلة إلى الخرز و ريسوسبيند التي بيبتينغ صعودا وهبوطا. تسخين العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على كتلة الحرارة.
  8. البرد العينة على الجليد لمدة 1 دقيقة وإضافة 500 ميكرولتر من غوانيدينيوم ثيوسيانات الفينول الكلوروفورم إلى العينة. مزيج بواسطة فورتيكسينغ بقوة لمدة 10 ثانية. احتضان ميكستوإعادة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في غوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-الكلوروفورم في -80 درجة مئوية لبضعة أشهر.
  9. إضافة 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى غوانيدينيوم ثيوسيانات الفينول الكلوروفورم العينات المستخرجة. دوامة بقوة لمدة 10 ثانية. الطرد المركزي العينات في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  10. نقل 400 ميكرولتر من طبقة مائي إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل جديد. إضافة 800 ميكرولتر (2 مجلدات) من الايثانول بنسبة 100٪ وتخلط بيبتينغ صعودا وهبوطا.
  11. نقل حل الحمض النووي الريبي لأعمدة تنظيف الحمض النووي الريبي واستعادة رنا تعليمات الشركة المصنعة التالية، وضمان أن يتم الاحتفاظ حتى رنا صغيرة. أزل الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر من نوكليس خالية من المياه.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.

6. عكس كروسلينكينغ من السورالين البيروكسيديز

  1. نقل 100 ميكرولتر من عينات إلوتد في بئر من 24 بل جيداأكل. إزالة الغطاء وإشعاع العينة تحت الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر، لمدة 5 دقائق على الجليد.
  2. نقل عينة كروسلينكد العكسي إلى أنبوب ميكروفوج نظيفة. إضافة 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الايثانول 100٪ ويعجل الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: يمكن أن يعجل الحمض النووي الريبي في الإيثانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  3. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه رنا.
  4. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة العازلة غسل وإضافة 4.25 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند رنا. نقل الحمض النووي الريبي إلى أنبوب 0.2 مل ير.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.

7. النسخ العكسي و [كدنا] التعميم

  1. إضافة 0.75 ميكرولترمن رنا رابط (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى العينة معلق في أنبوب ير والحرارة في 80 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. وضع العينة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  2. إضافة المخازن المؤقتة إلى العينة التشويه والتحريف ل 3 'ربط محول، وفقا للجدول 4 . احتضان رد فعل عند 25 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة.
  3. نقل رد فعل إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. إضافة 90 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى رد فعل، تليها 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. يعجل الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: يمكن أن يعجل الحمض النووي الريبي في الإيثانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  4. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه رنا.
  5. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة غسل ريسوسبيند العازلة بيليه في 5 ميكرولتر من نوكليس مجانا ثالعاطر.
  6. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى الحمض النووي الريبي المستردة في أنبوب ميكروفوج. تسخين الحمض النووي الريبي مع صبغ تحميل الحمض النووي الريبي في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  7. إضافة 3 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى 0.25 ميكرولتر من 10 نت سلم الحمض النووي في أنبوب ميكروفوج. تسخين السلم في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  8. أداء تجزئة حجم باستخدام 8.6 سم × 6.8 سم 6٪ تب اليوريا هلام كما في الخطوات 3.3 و 3.4.
  9. تصور هلام ملطخة مع وصمة عار حمض النووي باستخدام ترانزيلوميناتور وقطع شريحة هلام المقابلة ل 110-140 نت على سلم. نقل شريحة هلام في أنبوب ثقب 0.6 مل ميكروفوج في أنبوب ميكروفوج 2 مل واتبع بروتوكول من الخطوات 3.6- 3.9.
  10. إضافة 5 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند بيليه الحمض النووي الريبي. نقل الحمض النووي الريبي إلى أنبوب 0.2 مل ير.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.
  11. إضافة 1 ميكرولتر من التمهيدي رت في 1.2581؛ M إلى الحمض النووي الريبي في أنبوب ير والحرارة في 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. وضع العينة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  12. إضافة المخازن المؤقتة للنسخ العكسي وفقا للجدول 5 . احتضان رد فعل عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  13. إضافة 1.1 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم إلى التفاعل والحرارة في 98 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. وضع رد فعل على الجليد.
  14. نقل رد فعل إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. إضافة 90 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى رد فعل، تليها 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. يعجل الحمض النووي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: الحمض النووي يمكن عجلت في الإيثانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  15. الطرد المركزي الحمض النووي عجلت في 20،000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه الحمض النووي. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة غسل ريسوسبيند العازلة بيلواسمحوا في 5 ميكرولتر من نوكليس المياه مجانا.
  16. أداء تجزئة حجم باستخدام 8.6 سم × 6.8 سم 6٪ تب اليوريا هلام كما في الخطوات 3.3 و 3.4.
  17. تصور هلام ما بعد الملون باستخدام ترانزيلوميناتور وقطع شريحة هلام المقابلة ل 200-240 نت على سلم. و كدنا المكتوبة العكسية الآن 96 قواعد أطول من جزء رنا بسبب إضافة 96 قاعدة رت التمهيدي. نقل شريحة هلام في أنبوب مثقب 0.6 مل ميكروفوج في أنبوب ميكروفوج 2 مل.
  18. أجهزة الطرد المركزي شرائح هلام في 12000 زغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة لتمزيق شريحة هلام وجمعه في أنبوب ميكروفوج 2 مل. تجاهل فارغة 0.6 مل ميكروفوج أنبوب.
  19. إضافة 700 ميكرولتر من العازلة شطف لشريحة هلام تمزيقه في أنبوب ميكروفوج 2 مل واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع دوران مستمر. اتبع البروتوكول كما هو موضح في الخطوات 3.7- 3.8.
  20. إضافة 6 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند بيليه الحمض النووي. نقل الحمض النووي إلى أنبوب 0.2 مل ير.
  21. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد فعل لتعميم [كدنا]، وفقا للجدول 6 . احتضان رد فعل في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة والحرارة في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتعطيل التفاعل.
  22. نقل رد فعل إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. تنقية كدنا دائرية باستخدام عمود تنظيف الحمض النووي التالية تعليمات الشركة الصانعة. إضافة 20 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى العمود إلى أزل كدنا المنقى.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية لبضعة أشهر.

8. ير التضخيم (مقياس صغير ير)

  1. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد فعل وفقا للجدول 7 ل ير التضخيم لاختبار الحد الأدنى من دورات تحتاج إلى تضخيم المكتبة.
  2. إعداد ظروف الدراجات ير وفقا للجدول 8 . وقفة رد فعل ونقل 5 ميكرولتر منتفاعل ير في 10 و 15 و 20 دورات، في أنابيب 1.5 مل ميكروفوج منفصلة.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من 6X دنا هلام صبغ التحميل لكل من 5 ميكرولتر تفاعل ير في دورات مختلفة. أداء الكهربائي هلام على هلام الاغاروز 3٪، في 120 V، لمدة 1 ساعة لتصور المنتجات ير.
    1. استخدام أقل عدد من دورات ير (Y) التي تظهر التضخيم في حوالي 250 قواعد (في الشكل 3 ، هناك فرقة قوية في 15 دورات من التضخيم وحزمة خافتة في 10 دورات.من المرجح أن دورات 12 من التضخيم ير يرتكز على توليد ما يكفي من المواد لتسلسل عميق كما كمية من [كدنا] المستخدمة هو 10 أضعاف ذلك على نطاق صغير ير التضخيم).

9. ير التضخيم (ير مقياس كبير) وتنقية

  1. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد فعل وفقا للجدول 9 ل ير التضخيم ل ير على نطاق واسع.
  2. إعداد ظروف الدراجات ير وفقا لالجدول 10 .
  3. إضافة 5 ميكرولتر من 6X دنا هلام صبغ التحميل إلى 25 ميكرولتر من تفاعل ير وتحميلها في بئر من هلام الاغاروز 3٪. تحميل 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي في بئر منفصل. أداء الكهربائي هلام في 100 V، لمدة 1.5 ساعة.
  4. تصور هلام الانتهاء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية ترانزيلوميناتور.
  5. حجم استخراج شريحة هلام تحتوي على المنتجات ير من 200-300 قواعد ونقل هلام إلى نظيفة 2 مل أنبوب ميكروفوج.
  6. إضافة 1 مل من العازلة للذوبان هلام، من مجموعة استخراج هلام الحمض النووي، إلى شريحة هلام واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، أو حتى هلام يذوب، مع التحريض المستمر.
  7. إضافة 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى هلام المذاب وتخلط جيدا عن طريق بيبتينغ. نقل 700 ميكرولتر من العينة إلى الحمض النووي استخراج هلام تنظيف العمود وأجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 30 ثانية. إبقاء نقل العينة المذابة إلى العمود حتى يتم تحميل كل من العينة على العمود.
  8. إضافة 500 ميكرولتر العازلة للذوبان هلام،تليها 700 ميكرولتر من العازلة غسل العمود، إلى العمود، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إضافة 12 ميكرولتر من نوكليس خالية من المياه إلى وسط العمود لاستباق الحمض النووي. نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
  9. كوانتيتات تركيز الحمض النووي باستخدام القياس الكمي فلوروميتريك. إذا تم إنشاء مكتبات متعددة وتجميعها معا للتسلسل، إضافة كمية متساوية من كل عينة إلى التجمع، لارتفاع تسلسل الإنتاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1 يصور التخطيطي لسير العمل سبلاش. على إضافة السورالين البيروكسيديز في وجود 0.01٪ ديجيتونين، والأشعة فوق البنفسجية يشابك، يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا ويتم تنفيذ نقطة لطخة لضمان أن يشابك من البيروكسيديز إلى الحمض النووي الريبي قد حدث بكفاءة ( الشكل 2 ). نحن نستخدم أوليغوس قاعدة البيروكسيديز 20 كما ضوابط إيجابية ل معايرة كمية من السورالين البيروكسيديز إلى أن تضاف إلى الخلايا، بحيث أن ما يقرب من 1 في كل 150 قواعد كروسلينكد.

كما أن المزيد من أحداث الازدواج ير تميل إلى أن تحدث مع زيادة دورات التضخيم ير، ونحن إجراء التضخيم ير ير على نطاق صغير باستخدام دورات ير مختلفة لتحديد أقل عدد من دورات التضخيم من شأنها أن توفر ما يكفي من المواد لتسلسل عميق. نحن في عملية إعداد مكتبة فعالةقادرة على تضخيم مكتبة تسلسل [كدنا] من 1.5 ميكروغرام من حجم المدخلات المحددة الحمض النووي الريبي في أقل من 15 دورات من التضخيم ير ( الشكل 3 ). ثم يتم تسلسل المكتبة باستخدام 2x 150 زوج قاعدة يقرأ على آلة تسلسل إنتاجية عالية ويتم بعد ذلك قراءة تسلسل وفقا لخط الأنابيب الحسابية في الشكل 4 . والنتيجة النهائية هي قائمة من التفاعلات الخيميائية التي تمت تصفيتها التي تشمل التفاعلات داخل الجزيئات و بين الجزيئات رنا-رنا في ترانسكريبتوم ( الجدول 11 ).

شكل 1
الشكل 1 : تخطيطي لسير العمل التجريبي من سبلاش 15 . زوجا الحكيم التفاعلات رنا داخل الخلية كروسلينكد باستخدام السورالين البيروكسيديز تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر. رنا كروسلينكد هو ثأر استخراجها ومجزأة إلى حوالي 100 قواعد. يتم إثراء المناطق التفاعل التي تحتوي على كروسلينكس السورالين البيروكسيديز البيروكسيديز ملزمة من قبل الخرز ل ستريبتافيدين و ليغاتد معا. على عكس يشابك تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 265 نانومتر، ثم استنساخ رنا الخيميري في مكتبة [كدنا] لتسلسل عميق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2 : اختبار كفاءة التشابك البيروكسيديز من نقطة نشاف 15 . نقطة وصمة عار من البوروكسيديز السورالين كروسلينكد رنا في الجسم الحي في وجود 1٪ ديجيتونين. يتم رصد تركيزات مختلفة من الحمض النووي الريبي كروسلينكد (20-2،000 نغ) على الغشاء. تركيزات مختلفة من قاعدة البيروكسيديز 20يتم رصد قليل كما الضوابط الإيجابية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: صغيرة الحجم مكتبة التضخيم ل سبلاش. يستخدم 1 ميكرولتر من [كدنا] من رد الفعل رت ل ير على نطاق صغير. يتم أخذ ردود الفعل في 10 و 15 و 20 دورات وتشغيل على هلام الاغاروز 3٪ لتحديد الحد الأدنى لعدد دورات التضخيم اللازمة لتوليد المكتبة. في هذا المثال المحدد، 10 دورات من التضخيم باستخدام 10 ميكرولتر من [كدنا] في تفاعل ير واسع النطاق سيولد ما يكفي من أمبليكونس لتسلسل عميق.

الشكل 4
تخطيطي لسير العمل الحسابي ل سبلاش. تسلسل يقرأ من تسلسل الإنتاجية العالية يتم تعيينها إلى ترانسكريبتوم وتصفيتها ضد نوعية سيئة يقرأ، ير المكررة، ورسم الخرائط مكررة وتقاطع تقاطع يقرأ باستخدام خط أنابيب التحليل. الإخراج النهائي هو قائمة من الشمرات التي تمثل كل من التفاعلات داخل الجزيئات داخل ترانسكريبتوم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكواشف حجم (ميكرولتر) نهائي
نوكليس المياه مجانا 64
10x T4 بنك الاحتياطي المؤقت 8 1X
مزيل الأنزيم20 U / ميكرولتر) 4 1 U / ميكرولتر
T4 بنك (10 U / ميكرولتر) 4 0.5 U / ميكرولتر
مجموع 80

الجدول 1: الكواشف لمدة 3 'نهاية إصلاح.

الكواشف حجم (ميكرولتر) نهائي
رد فعل بنك 80
نوكليس المياه مجانا 3
10x T4 بنك الاحتياطي المؤقت 2 1X
10 ملي أتب 10 1 ملم
T4 بنك (10 U / ميكرولتر) 5 0.5 U / ميكرولتر
مجموع 100

الجدول 2: الكواشف لإصلاح نهاية 5 '.

الكواشف حجم (ميكرولتر) نهائي
رد فعل بنك 100
10x T4 رنا ليغاز العازلة 6 1X
10 ملي أتب 6 1 ملم
المانع للزنز (20 U / ميكرولتر) 4 0.5 U / ميكرولتر
T4 Rnl1 (10 U / ميكرولتر) 40 2.5 U / ميكرولتر
نوكليس الحرةه المياه 4
مجموع 160

الجدول 3: الكواشف لربط القرب.

مكون المبلغ لكل رد فعل (μL) نهائي
الحمض النووي الريبي والرابط 5
T4 Rnl2 العازلة (10x) 1 1X
بيج 8000 (50٪، وزن بالوزن / فول) 3 15٪ (وزن / حجم)
المانع للزنز (20 U / ميكرولتر) 0.5 1 U / ميكرولتر
T4 Rnl2 (تر) (200U / ميكرولتر) 0.5 10 U / μ. L
مجموع 10

الجدول 4: الكواشف لربط المحول.

مكون المبلغ لكل رد فعل (μL) نهائي
ربط والتمهيدي 6
العازلة الأولى حبلا (5X) 2 1X
دنتبس (10 ملم) 0.5 0.5 ملي
دت (0.1 م) 0.5 5 ملي
المانع للزنز (20 U / ميكرولتر) 0.5 1 U / ميكرولتر
عكس ترانسكريبتاس (200 U / ميكرولتر) 0.5 10 U / ميكرولتر
مجموع 10

الجدول 5: الكواشف للنسخ العكسي.

مكون المبلغ لكل رد فعل (μL) نهائي
أول حبلا [كدنا] 6
واحد حبلا الحمض النووي يغاز العازلة (10X) 1 1X
البيتين (5 م) 2 1 م
منكل 2 (50 ملي) 0.5 2.5 ملي
واحد حبلا الحمض النووي ليغاز (100U / ميكرولتر) 0.5 5U / ميكرولتر
مجموع 10

الجدول 6: الكواشف لتعميم [كدنا].

مكون المبلغ لكل رد فعل (μL) نهائي
ليغاتد الحمض النووي المنتج 1
نوكليس المياه مجانا 10.5
عالية الدقة الحمض النووي البلمرة 2X مزيج الرئيسي 12.5 1X
العالمي ير التمهيدي (10 ميكرومتر) 0.5 0.02 ميكرومتر
مؤشر (X) التمهيدي (10 ميكرومتر) 0.5 0.02 ميكرومتر
مجموع 25

الجدول 7: الكواشف المستخدمة في ير الصغيرة.

خطوة درجة الحرارة زمن دورات
تمسخ الأولي 98 درجة مئوية 30 ثانية 1
تمسخ 98 درجة مئوية 10 ثوان
الصلب 65 درجة مئوية 30 ثانية 25
تمديد 72 درجة مئوية 30 ثانية
التمديد النهائي 72 درجة مئوية 5 دقائق
معلق 4 درجة مئوية ∞

الجدول 8: الشروط المستخدمة في تقییم تفاعل البولیمیر المتسلسل.

مكون المبلغ لكل رد فعل (μL) نهائي
ليغاتد الحمض النووي المنتج 5
نوكليس المياه مجانا 6.5
عالية الدقة الحمض النووي البلمرة 2X مزيج الرئيسي 12.5 1X
العالمي ير التمهيدي (10 ميكرومتر) 0.5 0.02 ميكرومتر
مؤشر (X) التمهيدي (10 ميكرومتر) 0.5 0.02 ميكرومتر
مجموع 25

الجدول 9: الكواشف المستخدمة في ير واسع النطاق.

خطوة درجة الحرارة زمن دورات
تمسخ الأولي 98 درجة مئوية 30 ثانية 1
تمسخ 98 درجة مئوية 10 ثوان
الصلب 65 درجة مئوية 30 ثانية Y
تمديد 72 درجة مئوية 30 ثانية
التمديد النهائي 72 درجة مئوية 5 دقائق
معلق 4 درجة مئوية ∞

الجدول 10: الشروط المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل على نطاق واسع.

الجدول 11
الجدول 11: مخرجات تحليل خط الأنابيب الحسابي. "سام العلم انقسام قراءة 1" = 0 يشير إلى أن يتم تعيين القراءة إلى حبلا موجبا من ترانسكريبتوم. "الهوية 1 الحمض النووي الريبي" يشير إلى هوية الحمض النووي الريبي من يسار الوهم. "رنا 1 بداية موقف" يشير إلى موقف البداية التي يتم تعيين قراءة على طول الحمض النووي الريبي 1. "الحمض النووي الريبي 1 موقف نهاية" يشير إلى الموقف النهائي الذي يتم تعيين قراءة على طول رنا 1. "رسم خريطة تقسيم قراءة 1" يشير إلى درجة رسم الخرائط للقراءة التي تم تعيينها إلى الحمض النووي الريبي 1. "السيجار الانقسام قراءة 1"يشير إلى عدد القواعد التي تم قصها من قراءة "S" وعدد القواعد التي تم تعيينها إلى قراءة "M". "انقسام قراءة 1" يشير إلى التسلسل الذي تم تعيينه إلى الحمض النووي الريبي 1. تم استخدام نفس التسميات للجانب الأيمن من الكيميرا، والذي يدعى رنا 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نحن تصف بالتفصيل سير العمل التجريبي والحسابي ل سبلاش، وهي الطريقة التي تسمح لنا لتحديد التفاعلات الحمض النووي الريبي الزوجين الحكمة في طريقة الجينوم واسعة. لقد استخدمنا بنجاح سبلاش في الثقافات البكتيرية والخميرة والثقافات البشرية، وتوقع أن الاستراتيجية يمكن تطبيقها على نطاق واسع على الكائنات الحية المختلفة في حالات الخلوية المختلفة. واحدة من الخطوات الحاسمة في البروتوكول هو أن تبدأ مع ما لا يقل عن 20 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي كروسلينكد أن يكون المواد الكافية لعمليات المصب. ثم يتم تقسيم رنا إلى 100 قواعد و بادج حجم مختارة. هذه الخطوات هي مهمة بالنسبة لنا لإثراء تفضيلية ل تشيميراس ليغاتد، بدلا من مونومرات خلال عملية توليد المكتبة. نحن عادة استعادة حوالي 1.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي بعد تجزئة واختيار الحجم الأول، ثم يتم تحويل الحمض النووي الريبي إلى مكتبة [كدنا] وفقا لسير العمل سبلاش. نجد أن هذا المبلغ من بدء الحمض النووي الريبي يسمح لنا لتوليد ما يكفي من المواد ل hإيغ تسلسل الإنتاجية باستخدام أقل من 15 دورات من التضخيم ير. كما يزيد عدد أحداث ازدواج ير بشكل كبير مع زيادة دورات ير، والحفاظ على عدد دورات التضخيم منخفضة أمر بالغ الأهمية لتكون قادرة على استخراج مفيدة، وفريدة من نوعها الوهم في تحليل المصب.

على النقيض من غيرها من الاستراتيجيات على أساس الجورال على أساس الجينوم على أساس، سبلاش يستخدم نسخة البيروكسيديز من السورالين لشابك قاعدة شظايا الحمض النووي الريبي المقترنة لبعضها البعض. كما نحن معايرة كمية من كروسلينكينغ إلى ما يقرب من كروسلينك لكل مائة وخمسين قواعد، يمكننا إثراء لمناطق رنا كروسلينكد باستخدام الخرز ستريبتافيدين بعد تجزئة الحمض النووي الريبي. وعلاوة على ذلك، وأداء ردود الفعل الأنزيمية في حين أن رنا ملزمة على الخرز كما سمح لنا لإجراء التبادلات عازلة ويغسل مريح. ومع ذلك، واحدة من القيود المفروضة على الاستراتيجية هي أن السورالين البيروكسيديز أقل كفاءة في اختراق الخلايا من السورالين أو 4'أمينوميثيل ثلاثيأوكسالين (أمت). على هذا النحو، فمن الأهمية بمكان لضمان أن السورالين البيروكسيديز قد دخلت الخلايا و كروسلينكد رنا بكفاءة. نحن بشكل روتيني أداء البقع نقطة على كروسلينكد، المستخرجة رنا، جنبا إلى جنب مع أوليغوس البيروكسيديز كضوابط إيجابية، لضمان أن رنا لدينا كروسلينكد بشكل صحيح. في حالة أن يشابك ضعيف، استراتيجيات لتخلل الغشاء الخلوي، مثل إضافة تركيزات منخفضة من ديجيتونين (إلى 0.01٪) لمدة 5 دقائق، ويمكن استخدامها للسماح السورالين البيروكسيديز للدخول الخلايا بكفاءة. كما يمتص السورالين في نفس الطول الموجي للأحماض النووية (الأشعة فوق البنفسجية 260 نانومتر)، ونحن عادة استخدام أنظمة القياس الكمي فلوروميتريك، بدلا من امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لتحديد الكميات من رنا كروسلينكد.

واحد الحد من السورالين استراتيجيات التشابك القائم هو أن السورالين كروسلينكس تفضيلي في اليريدين (U). وعلى هذا النحو، قد تفوت مناطق الاقتران الأساسية التي هي U الفقراء أثناء التشابك. وبالتالي أثناء الكشف عن الحدث يشابك ببين اثنين من فروع توفر دليلا على أن التفاعل يحدث، وعدم وجود تشابك لا يساوي نقص التفاعل. في بروتوكول سبلاش لدينا، ونحن التقاط القليل جدا التفاعلات ميكرورنا-مرنا، وكميات قليلة من التفاعلات ليرنا. كما ميكرورنا ملزمة مرناس من المرجح أن يكون دونريغولاتد في التعبير الجيني وعادة ما أعرب لكرناس منخفضا، ضعف تمثيلها في بياناتنا يرجع في المقام الأول إلى عدم كفاية عمق التسلسل. نحن عادة تسلسل ما لا يقل عن 200 مليون نهاية يقترن يقرأ في مكتبة ترانسكريبتوم الإنسان لكل تكرار. في هذا العمق، معظم تسلسلنا يقرأ تقع على رنا وفيرة إلى حد ما. ونحن نتوقع أن استخدام استراتيجيات التخصيب لسكان معين من الحمض النووي الريبي سيعزز كثيرا من إشارة لهذه الرنا منخفضة نسبيا وفيرة. أحد التحديات الأخرى التي لاحظناها في تحليل البيانات خيالية هو التمييز بين الأحداث الحقيقية تشيميريك التفاعل مقابل الكيميرا التي يتم إنشاؤها من الربط. لمنع التلوث oو الربط يقرأ في قائمتنا خيالية، ونحن تصفية بعيدا يقرأ التي هي قريبة من مواقع الربط المشروح المعروفة في ترانسكريبتوم. ونحن نتوقع أنه مع الشروح الربط أكثر اكتمالا، فإن القائمة النهائية من الشمرات تصبح أكثر دقة.

تختلف عن الاستراتيجيات السابقة التي تركز على التفاعلات الحمض النووي الريبي التي هي محددة لأنواع رنا واحدة أو بروتين واحد رنا ملزمة، وقدرة سبلاش لتخطيط التفاعلات الحمض النووي الريبي رنا على نطاق الجينوم على نطاق الطريقة لجميع رنا تمكننا من دراسة الحمض النووي الريبي على نطاق واسع وشبكات التفاعل وتحديد تفاعلات رنا الجزيئات بين الجزيئات والتفاعلات بين الجزيئات الجديدة للمرة الأولى. باستخدام سبلاش، حصلنا على الآلاف من التفاعلات داخل الجزيئات وبين الجزيئات في ترانسكريبتومس الإنسان والخميرة، مما يتيح لنا لمحة عن تنظيم وديناميات الحمض النووي الريبي إنتيراكتوم في الجسم الحي . من المرجح أن التقدم في دمج هذه البيانات التفاعل رنا طويلة المدى في خوارزميات بنية هيكل الحمض النووي الريبيصقل لدينا نماذج الحالية من منظمة الحمض النووي الريبي في الجسم الحي . دمج سبلاش في خوارزميات التنبؤ الجزيئات الحمض النووي الريبي، مثل برامج التنبؤ سنورنا، ويمكن أيضا تحسين دقة هذه التنبؤات. ونحن نتوقع أن الاستخدامات المستقبلية لل سبلاش على الكائنات الحية المعقدة الأخرى والنظم الحيوية سوف تستمر في تسليط الضوء على تعقيدات التنظيم الجيني القائم على الحمض النووي الريبي في علم الأحياء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نشكر أعضاء مختبر وان ومختبر ناغاراجان للمناقشات بالمعلومات. ويدعم N.Nagarajan بتمويل من A * ستار. يتم دعم Y.Wan بتمويل من A * ستار والمجتمع في العلوم-برانكو فايس الزمالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Plus DNA Ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10787026 DNA ladder
10 bp DNA ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10821-015 DNA ladder
20% SDS solution First BASE BUF-2052-1L  
20x SSC First BASE BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution First BASE BUF-1151-1L-pH5.2   Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 Bio-Rad 1610145 TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit Life Technologies Holdings Pte Ltd AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade   Promega V3131  TBE Urea gel component
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Chloroform Merck 1.02445.1000 RNA extraction
Single strand DNA ligase Epicentre CL9025K CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters Sigma-Aldrich CLS8160-96EA Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE Sigma-Aldrich D5628-1G For cell treatment
Dark Reader Transilluminator  Clare Chemical Research Dark Reader DR89X Transilluminator Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x) Life Technologies Holdings Pte Ltd R0611 Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium Pan BioTech P04-03500 For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads Life Technologies Holdings Pte Ltd 65002 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetic stand for 15 mL tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd 12301D DynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd 12321D DynaMag-2
ThermoMixer Eppendorf 5382 000.015 Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen Life Technologies Holdings Pte Ltd 29986 EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL  Hitachi F8T5/BL  365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum Life Technologies Holdings Pte Ltd 10270106   Components of Hela medium
Formamide Promega H5052   Component in hybridization buffer
G8T5 Sankyo-Denki G8T5 254 nm UV bulb
Glycogen Life Technologies Holdings Pte Ltd 10814010 Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop Life Technologies Holdings Pte Ltd Nanodrop 2000 Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water  First BASE BUF-1180-500ml  
Penicillin Streptomycin   Life Technologies Holdings Pte Ltd 15140122   Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x) Life Technologies Holdings Pte Ltd F531L  Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1 New England Biolabs E7335L  PCR primers
DNA Gel Extraction Kit QIAgen 28106 QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit Life Technologies Holdings Pte Ltd Q32854 Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit Qiagen 74106 RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor Life Technologies Holdings Pte Ltd AM2696 SUPERase In
Reverse transcriptase Life Technologies Holdings Pte Ltd 18080400 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies Holdings Pte Ltd S11494 SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs M0204L Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373L Enzyme for adaptor ligation
Temed Bio-Rad 1610801 TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform Life Technologies Holdings Pte Ltd 15596018 TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea First BASE BIO-2070-5kg  
UV crosslinker Stratagene 400072 UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator UVP 95-0417-01 For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich X4126-10G
DNA cleanup it Zymo Research  D4004 Zymo DNA concentrator-5 
List of software required
FastQC software 0.11.4 http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software 1.0.7 https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software 0.7.12 http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software 1.2.1 http://www.htslib.org/
PULLSEQ software 1.0.2 https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software 2.5.0c https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script AWK GNU 4.1.2 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence:
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Tags

علم الوراثة، العدد 123، رنا، علم الجينوم، إنتيراكتوم، التسلسل، هيكل، الإنسان
رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan,… More

Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen. J. Vis. Exp. (123), e55255, doi:10.3791/55255 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter