Summary
Her beskriver vi metoden for S- ækvurdering af P soralen tværbundet, L igateret og S valgte H ybrids (SPLASH), som muliggør genomgående kortlægning af intramolekylære og intermolekylære RNA-RNA-interaktioner in vivo . SPLASH kan anvendes til at studere RNA-interaktomer af organismer, herunder gær, bakterier og mennesker.
Abstract
At vide, hvordan RNA'er interagerer med sig selv og med andre er nøglen til at forstå RNA-baseret genregulering i cellen. Mens eksempler på RNA-RNA-interaktioner, såsom mikroRNA-mRNA-interaktioner, har vist sig at regulere genekspression, er det fulde omfang, som RNA-interaktioner forekommer i cellen endnu ikke kendt. Tidligere metoder til undersøgelse af RNA-interaktioner har primært fokuseret på delsæt af RNA'er, der interagerer med et bestemt protein eller RNA-species. Her beskriver vi en metode, der hedder S- ækvurdering af P soralen tværbundet, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH), der tillader genomsøgning af RNA-interaktioner in vivo på en upartisk måde. SPLASH udnytter in vivo tværbinding, nærhedsligation og høj gennemstrømningssekvensering for at identificere intramolekylære og intermolekylære RNA baseparingspartnere globalt. SPLASH kan anvendes til forskellige organismer, herunder bakterier, gær og humane celler, samt aS forskellige cellulære betingelser for at lette forståelsen af dynamikken i RNA organisationen under forskellige cellulære sammenhænge. Hele den eksperimentelle SPLASH-protokol tager cirka 5 dage at fuldføre, og den beregningsmæssige arbejdsgang tager cirka 7 dage at fuldføre.
Introduction
At studere, hvordan makromolekyler foldes og interagerer med hinanden er nøglen til at forstå genregulering i cellen. Medens en stor indsats har været fokuseret i det sidste årti om forståelse af, hvordan DNA og proteiner bidrager til genregulering, er relativt mindre kendt om post-transkriptionel regulering af genekspression. RNA bærer information i både sin lineære rækkefølge og i dens sekundære og tertiære struktur 1 . Dens evne til at basere par med sig selv og med andre er vigtigt for dets funktion in vivo . Nylige fremskridt i RNA sekundære strukturundersøgelser med høj gennemstrømning har givet værdifulde indblik i placeringen af dobbelt- og enkeltstrengede regioner i transkriptomet 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer information om parring samspillet partnere mangler stadig stort set. For at bestemme hvilken RNA-sekvens der interagerer med en anden RNA-region i transkriptomet, har vi brug for globale parvisoplysninger.
Kortlægning af parvise RNA-interaktioner på global, upartisk måde har traditionelt været en stor udfordring. Mens tidligere fremgangsmåder, såsom CLASH 9 , hiCLIP 10 og RAP 11 , anvendes til at identificere RNA-interaktioner på stor skala, kartlægger disse teknikker typisk RNA-baseparring for en delmængde af RNA'er, der enten interagerer med et bestemt protein eller RNA-species. Den seneste udvikling i undersøgelsen af globale RNA-interaktioner indbefatter metoden RPL 12 , som ikke stabiliserer RNA-interaktioner in vivo og derfor kun kan opfange en delmængde af in vivo interaktioner. For at overvinde disse udfordringer udviklede vi og andre genomgående, upartiske strategier til maP RNA-interaktomer in vivo ved anvendelse af modificerede versioner af tværbindingspsoralen 13 , 14 , 15 . I denne protokol beskriver vi detaljerne for udførelse af S- ækvurdering af P- sorbundet tværbundet, L igated og S valgte H ybrids (SPLASH), der anvender biotinyleret psoralen til tværbindingsbaseparations-RNA'er in vivo efterfulgt af nærhedsligation og høj gennemstrømningssekvensering til Identificere RNA baseparingspartnere genom-bred ( figur 1 ) 15 .
I dette manuskript beskriver vi trinene til udførelse af SPLASH ved hjælp af dyrkede adhærente celler, i dette tilfælde HeLa-celler. Den samme protokol kan let tilpasses til suspensionspattedyrceller og til gær- og bakterieceller. Kort sagt behandles HeLa-celler med biotinyleret psoralen og bestråles ved 365 nm for at krydsbinde interaktive RNA basepar in vivo.. RNA'erne ekstraheres derefter fra cellerne, fragmenteret og beriget for tværbindingsregioner under anvendelse af streptavidinperler. Interagerende RNA-fragmenter ligeres derefter sammen ved anvendelse af nærhedsligation og fremstilles i et cDNA-bibliotek til dyb sekventering. Efter sekventering kortlægges de kimære RNA'er på transcriptomet / genomet for at identificere de RNA-interagerende regioner, som er parret til hinanden. Vi har med succes udnyttet SPLASH til at identificere tusindvis af RNA-interaktioner in vivo i gær og forskellige humane celler, herunder intramolekylær og intermolekylær RNA-baseparring i forskellige klasser af RNA'er, såsom snoRNA'er, lncRNA'er og mRNA'er, for at se på strukturelle organisations- og interaktionsmønstre Af RNA'er i cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Behandling af HeLa-celler med biotinyleret psoralen og RNA-ekstraktion
- Culture HeLa celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin (PS) i en 10 cm plade.
- Vask HeLa-cellerne to gange med 5 ml 1x PBS. Tøm overskydende PBS helt ud af fadet ved at placere fadet lodret i 1 min.
- Tilsæt 1 ml PBS indeholdende 200 μM biotinyleret psoralen og 0,01% vægt / volumen digitonin, til cellerne ensartet og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter. Mens biotinyleret psoralen kan komme ind i cellen, er dens permeabilitet meget højere, når cellerne udsættes for lave mængder digitonin (0,01%) i 5 minutter
- Fjern låget på den 10 cm plade, der indeholder de behandlede HeLa-celler, og læg fatet fladt på is. Bestrål opskålen indeholdende cellerne med 365 nm UV i 20 minutter på is i en afstand på 3 cm fra UV-pærerne ved anvendelse af UV-tværbinderen.
- Isolér tOtal RNA fra HeLa celler ved guanidinium thiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion efter producentens protokol. Tilsæt 1: 1 volumen isopropanol til udfældning af RNA ved stuetemperatur i 30 minutter.
Pause Point: RNA kan opbevares ved -20 ° C i isopropanol på ubestemt tid. En dot blot kan udføres ved dette trin for at kontrollere, at biotinyleret psoralen succesfuldt har indtastet cellerne og har tværbundne RNA'er in vivo ( Figur 2 ). - Centrifuger det udfældede RNA ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for at genvinde RNA'et. Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml 70% kold ethanol til RNA-pellet for at vaske RNA'et.
- Centrifuger prøverne ved 20.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og lufttør pelleten i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt nucleasefrit vand til RNA-pellet og kvantificer koncentrationen af RNA ved anvendelse af UV-spektrometer.
Pause Point: RNA kan opbevares ved -80 ° C efter fLash fryser i flydende nitrogen.
2. RNA-fragmentering
- Forvarm 15 μl 2x RNA-fragmenteringsbuffer og 10 μl af RNA-prøven (1 μg / μl) individuelt i 0,2 ml PCR-rør ved 95 ° C i 1 min. Bland 10 μl af den opvarmede 2x RNA-fragmenteringsbuffer med 10 μl RNA-prøve ved pipettering op og ned. Inkuber prøven ved 95 ° C i 5 minutter. Stop reaktionen ved snap afkøling af reaktionen på is.
- Overfør og pool de 2 fragmenteringsreaktioner til et 1,5 ml mikrofugerør. Tilsæt 40 μL nukleasefrit vand til reaktionen, 10 μl 3 M natriumacetat, 1 μl glycogen og 300 μl 100% ethanol til fragmenteringsreaktionen. Inkuber RNA'et ved -20 ° C i mindst 1 time for at udfælde RNA'et.
- Centrifuger det udfældede RNA ved 20.000 xg i 30 minutter, fjern supernatanten og vask RNA'et under anvendelse af 1 ml 70% ethanol.
- Centrifuger RNA'et ved 20.000 xg i 15 minutter, remOve supernatanten og opløse RNA i 20 μl nukleasefrit vand.
3. RNA-størrelse udvælgelse og eluering
- Tilsæt 20 μl RNA-fyldstof til det udvundne RNA i mikrofugerøret. Opvarm RNA'et med RNA-fyldstofet ved 95 ° C i 3 minutter og læg det på is i 2 minutter.
- Tilsæt 3 μl RNA-fyldstof til 0,25 μL 10 nt DNA-stige i et mikrofugerør. Opvarm laderen ved 95 ° C i 3 minutter og læg den på is i 2 min.
- Læg den denaturerede stige og prøver på en 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel og størrelsesfraktioneret ved elektroforese i 40 minutter ved 180 V. Blæk gelen i 10 ml TBE buffer indeholdende 1: 10.000 nukleinsyre gel plet i 5 Min i mørket.
- Punkter et rent 0,6 ml mikrofugerør i bunden ved hjælp af en 24 G nål og læg den i et 2 ml mikrofugerør.
- Visualiser båndene på den post-farvede gel ved hjælp af en transilluminator og skære en gelskive svarende til 90-110 nt. Overfør gelskiven i det punkterede 0,6 ml mikrofugerør i 2 ml mikrofugerøret. Dette størrelsesvalg udføres for at tillade de kimære fragmenter at have en minimumslængde for at kortlægge til transkriptomet og at skelne mellem nærliggende ligerede produkter versus unligerede produkter i nedstrøms størrelsesvalgstrin.
- Centrifuger gelskiverne ved 12.000 xg ved stuetemperatur i 2 minutter for at rive gelskiven og samle den i 2 ml mikrofugerøret. Kassér det tomme 0,6 ml mikrofugerør. Tilsæt 700 μL elueringsbuffer til den ristede gelskive i 2 ml mikrofugerøret og inkuber ved 4 ° C natten over med konstant rotation for at tillade diffusion af prøverne i bufferen.
- Overfør gelskiverne og elueringsbufferen til et centrifugerørfilter og centrifuger ved 20.000 xg i 2 minutter. Gelskiverne bliver fanget i filterets øverste rum. Kassér gelskiverne og det øverste rum.
- Tilsæt 1 μl glykogen og 700 μl 100% isopropanol til filtratet i mikrofiberrøret og fæld RNA'en ved -20 ° C i mindst 1 time eller natten over.
Pause Point: RNA kan udfældes i isopropanol på ubestemt tid ved -20 ° C. - Centrifuger det udfældede RNA ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for at genvinde RNA'et. Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml 70% kold ethanol til vask af RNA-pellet. Centrifug den vaskede pellet ved 20.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Fjern vaskebufferen og tilsæt 20 μL nukleasefrit vand for at resuspendere RNA'et. Kvantificere koncentrationen af RNA ved anvendelse af et UV-spektrometer.
Pause Point: RNA kan opbevares ved -80 ° C efter flashfrysning i flydende nitrogen.
4. Berigelse af RNA-tværbindingsregioner
- Vortex streptavidin overtrukne magnetiske perler kraftigt at resuspenge perlerne homogent i røret. Overfør 100 μl perler til et 1,5 ml mikrofugerør og læg det på en magnetIc står i 1 min for at tillade perlerne at holde sig til den magnetiske side af røret. Fjern opbevaringsbufferen fra perlerne forsigtigt og tag røret ud af magnetstativet.
- Tilsæt 1 ml Lysis Buffer til perlerne i mikrofiberrøret og pipetter op og ned. Placer mikrofugen indeholdende perler på magnetisk stativ i 1 min for at adskille perlerne fra vaskebufferen. Gentag dette for i alt 3 vasker.
- Fjern vaskepufferen fra perlerne ved at placere mikrofugen indeholdende perler på magnetstativet i 1 minut. Tilsæt RNase-hæmmer (1: 200) til lysisbufferen og tilsæt 100 μl lysisbuffer til de vaskede perler i mikrofugerøret.
- Tilsæt 2 ml frisklavet hybridiseringsbuffer, 1 ml suppleret lysisbuffer, 1,5 μg størrelsesfraktioneret RNA og 100 μl resuspenderede perler til et 15 ml konisk centrifugerør. Vortex røret forsigtigt.
- Inkuber det 15 ml koniske centrifugerør ved 37 ° C i 30 minutter med ende til ende rotation.Forvarm vaskebufferen ved 37 ° C.
- Anbring de 15 ml koniske centrifugerør på et magnetisk stativ til 15 ml rør i 2 min for at adskille perlerne fra bufferen. Pipetter bufferen forsigtigt ud af røret og kassér den.
- Tilsæt 1 ml forvarmet vaskebuffer til perlerne, pipetter op og ned og overfør perlerne til et 1,5 ml mikrofugerør. Inkubér ved perlerne ved 37 ° C i 5 minutter, med ende til ende rotation.
- Centrifuger kort indholdet af mikrofugerøret. Anbring de 1,5 ml vaskede perler i mikrofugerør på et magnetisk stativ til 2 ml rør i 1 min for at adskille perlerne fra vaskebufferen. Fjern bufferen fra perlerne ved forsigtigt pipettering af bufferen ud af mikrofugerøret.
- Tilsæt 1 ml forvarmet vaskebuffer til perlerne og pipetter op og ned for at gentage vasken. Udfør i alt 5 vasker. Ved slutningen af den 5. vask skal du fjerne vaskepufferen ved at placere de mikrofugleholdige perler på magnetstanden1 min.
5. Nærhedsligering
- Tilsæt 1 ml kold T4 polynukleotidkinase (PNK) puffer til de vaskede perler og inkubér perlerne i 5 minutter ved 4 ° C, med ende til ende rotation. Anbring mikrofugerøret, der indeholder perlerne på magnetstrimlen i 1 minut, og fjern forsigtigt T4 PNK-bufferen. Gentag dette trin for i alt 2 vasker og fjern T4 PNK-bufferen efter den sidste vask.
- Tilsæt buffere til perlerne, ifølge tabel 1 . For at muliggøre at 3'-enderne af RNA-fragmentet kan ligeres til 3'-adaptere nedenfor, inkuberer perlerne i bufferen ved 37 ° C i 4 timer med konstant omrøring for at omdanne den 3'-cykliske phosphatgruppe i slutningen af RNA til 3 'OH.
- Tilsæt buffere til den foregående reaktion ifølge tabel 2 . For at muliggøre 5'-enden af RNA-fragmenterne for at være ligeringskompetente inkuberer reaktionen ved 37 ° C i 1 time med konstant omrøring i nærværelse af ATP, For at omdanne 5'OH på RNA'et til 5'-phosphat.
- Tilsæt buffer til den foregående reaktion for at udføre nærliggende ligering ifølge tabel 3 . Inkuber reaktionen ved 16 ° C i 16 timer med konstant omrøring,
- Placer mikrofugen indeholdende det ligerede RNA på en magnetstand i 1 min. Fjern supernatanten omhyggeligt og tilsæt 1 ml rumtemperaturvaskbuffer til perlerne. Resuspenderes ved pipettering op og ned.
- Placer mikrofugerøret på magnetstanden i 1 minut og fjern vaskbufferen omhyggeligt. Udfør i alt 2 vasker, og fjern vaskebufferen fra perlerne i slutningen af den anden vask.
- Tilsæt 100 μL RNA PK Buffer til perlerne og resuspender ved pipettering op og ned. Opvarm prøverne ved 95 ° C i 10 minutter på en varmeblok.
- Afkøl prøven på is i 1 minut, og tilsæt 500 μL guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform til prøven. Bland ved vortexing kraftigt i 10 s. Inkuber blandingenRe ved stuetemperatur i 10 min.
Pause Point: RNA kan opbevares i guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform ved -80 ° C i et par måneder. - Tilsæt 100 μl chloroform til guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroformekstraherede prøver. Vortex kraftigt i 10 s. Centrifuger prøverne ved 20.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Overfør 400 μl af det vandige lag til et nyt 1,5 ml mikrofugerør. Tilsæt 800 μL (2 volumener) 100% ethanol og bland ved pipettering op og ned.
- Overfør RNA-opløsningen til RNA-oprydningskolonner og genindvind RNA'en som følge af producentens instruktioner, og sørg for, at selv små RNA'er bevares. Eliminer RNA'et i 100 μl nukleasefrit vand.
Pause Point: RNA kan opbevares ved -80 ° C efter flashfrysning i flydende nitrogen.
6. Reverse krydsbinding af biotinyleret psoralen
- Overfør 100 μL af de eluerede prøver til en brønd i en 24 brønd plspiste. Fjern dækslet og bestrål prøven under UV 254 nm, i 5 minutter på is.
- Overfør den omvendte tværbundne prøve til et rent microfuge rør. Tilsæt 10 μl natriumacetat, 1 μl glycogen og 300 μl 100% ethanol og udfæld RNA'et ved -20 ° C i mindst 1 time eller natten over.
Pause Point: RNA kan udfældes i ethanol i ubestemt tid ved -20 ° C. - Centrifuger det udfældede RNA ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for at genvinde RNA'et. Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml 70% kold ethanol til vask af RNA-pellet.
- Centrifug den vaskede pellet ved 20.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern vaskebufferen og tilsæt 4,25 μL nukleasefrit vand til resuspendering af RNA'et. Overfør RNA'et til et 0,2 ml PCR-rør.
Pause Point: RNA kan opbevares ved -80 ° C efter flashfrysning i flydende nitrogen.
7. Reverse transkription og cDNA-cirkularisering
- Tilsæt 0,75 μLAf RNA linker (0,5 μg / μl) til den resuspenderede prøve i PCR-rør og opvarm ved 80 ° C i 90 s. Placer prøven på is i 2 minutter.
- Tilsæt bufferne til den denaturerede prøve til 3'-adapterligation ifølge tabel 4 . Inkuber reaktionen ved 25 ° C i 2,5 timer.
- Overfør reaktionen til et 1,5 ml mikrofugerør. Tilsæt 90 μl nukleasfrit vand til reaktionen efterfulgt af 10 μl natriumacetat, 1 μl glycogen og 300 μl 100% ethanol. Præcipiter RNA'et ved -20 ° C i mindst 1 time eller natten over.
Pause Point: RNA kan udfældes i ethanol i ubestemt tid ved -20 ° C. - Centrifuger det udfældede RNA ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for at genvinde RNA'et. Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml 70% kold ethanol til vask af RNA-pellet.
- Centrifug den vaskede pellet ved 20.000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern vaskebufferen resuspender pelleten i 5 μl nukleasefri water.
- Tilsæt 5 μL RNA-fyldstof til det udvundne RNA i mikrofugerøret. Opvarm RNA'et med RNA-fyldstofet ved 95 ° C i 3 minutter og læg det på is i 2 minutter.
- Tilsæt 3 μl RNA-fyldstof til 0,25 μL 10 nt DNA-stige i et mikrofugerør. Opvarm laderen ved 95 ° C i 3 minutter og læg den på is i 2 min.
- Udfør størrelsesfraktionering med 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel som i trin 3.3 og 3.4.
- Visualiser gelen farvet med nukleinsyrefarvning ved hjælp af transilluminator og skær en gelskive svarende til 110-140 nt på stigen. Overfør gelskiven i det punkterede 0,6 ml mikrofugerør i 2 ml mikrofugerøret, og følg protokollen fra trin 3.6 - 3.9.
- Tilsæt 5 μL nukleasefrit vand til resuspendering af RNA-pellet. Overfør RNA'et til et 0,2 ml PCR-rør.
Pause Point: RNA kan opbevares ved -80 ° C efter flashfrysning i flydende nitrogen. - Tilsæt 1 μL RT primer ved 1,2581; M til RNA i PCR-rør og opvarmning ved 80 ° C i 2 minutter. Placer prøven på is i 2 minutter.
- Tilføj bufferne til revers transkription ifølge tabel 5 . Inkuber reaktionen ved 50 ° C i 30 minutter.
- Tilsæt 1,1 μL 1 N NaOH til reaktionen og opvarm ved 98 ° C i 20 minutter. Anbring reaktionen på is.
- Overfør reaktionen til et 1,5 ml mikrofugerør. Tilsæt 90 μl nukleasfrit vand til reaktionen efterfulgt af 10 μl natriumacetat, 1 μl glycogen og 300 μl 100% ethanol. Præcipiter DNA'et ved -20 ° C i mindst 1 time eller natten over.
Pause Point: DNA kan udfældes i ethanol i ubestemt tid ved -20 ° C. - Centrifuger det udfældede DNA ved 20.000 g i 30 minutter ved 4 ° C for at genvinde DNA'et. Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml 70% kold ethanol til vask af DNA-pellet. Centrifug den vaskede pellet ved 20.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern vaskebufferen resuspenge pelLad 5 μl nukleasefrit vand.
- Udfør størrelsesfraktionering med 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel som i trin 3.3 og 3.4.
- Visualiser den post-farvede gel ved hjælp af transilluminator og skær en gelskive svarende til 200-240 nt på stigen. Det omvendte transkriberede cDNA er nu 96 baser længere end RNA-fragmentet på grund af tilsætningen af den 96 basiske RT-primer. Overfør gelskiven i det punkterede 0,6 ml mikrofugerør i 2 ml mikrofugerøret.
- Centrifuger gelskiverne ved 12.000 xg ved stuetemperatur i 2 minutter for at rive gelskiven og samle den i 2 ml mikrofugerøret. Kassér det tomme 0,6 ml mikrofugerør.
- Tilsæt 700 μL elueringsbuffer til den ristede gelskive i 2 ml mikrofugerøret og inkuber ved 37 ° C i 2 timer med konstant rotation. Følg protokollen som beskrevet i trin 3.7-3.8.
- Tilsæt 6 μL nukleasefrit vand til resuspendering af DNA-pellet. Overfør DNA'et til et 0,2 ml PCR-rør.
- Tilsæt bufferne til reaktionen for cDNA-cirkularisering, ifølge tabel 6 . Inkuber reaktionen ved 60 ° C i 1 time og opvarm ved 80 ° C i 10 minutter for at inaktivere reaktionen.
- Overfør reaktionen til et 1,5 ml mikrofugerør. Rens det cirkulære cDNA ved hjælp af en DNA-oprydningskolonne efter producentens anvisninger. Tilsæt 20 μL nukleasefrit vand til søjlen for at eluere det oprensede cDNA.
Pause Point: DNA kan opbevares ved -20 ° C i et par måneder.
8. PCR Amplification (Small Scale PCR)
- Tilsæt bufferne til reaktionen ifølge tabel 7 til PCR-amplifikation for at teste det minimale antal cykler, der er nødvendige for bibliotekets amplifikation.
- Konfigurer PCR-cyklussen i henhold til tabel 8 . Pause reaktionen og overfør 5 μLPCR-reaktionen ved 10, 15 og 20 cyklusser i separate 1,5 ml mikrofugerør.
- Tilsæt 1 μl 6x DNA gelindladningsfarvestof til hver af 5 μl PCR-reaktionen ved de forskellige cyklusser. Udfør gelelektroforese på en 3% agarosegel ved 120 V i 1 time for at visualisere PCR-produkterne.
- Brug det laveste antal PCR-cyklusser (Y), der viser amplifikation ved ca. 250 baser (I figur 3 er der et stærkt bånd ved 15 cyklusser af amplifikation og et svagt bånd på 10 cyklusser. 12 cykler med storskala PCR-amplifikation er sandsynligt at Generere nok materiale til dyb sekventering, idet mængden af cDNA anvendt er 10 gange så stor som for PCR-amplifikation i små skalaer).
9. PCR Amplification (Large Scale PCR) og oprensning
- Tilsæt bufferne til reaktionen ifølge tabel 9 til PCR amplifikation til storskala PCR.
- Indstil PCR cykliske forhold i henhold tilTabel 10 .
- Tilsæt 5 μl 6x DNA gelpåfyldningsfarvestof til 25 μl PCR-reaktionen og indlæs i en brønd i en 3% agarosegel. Indsæt 1 kb plus DNA stige i en separat brønd. Udfør gelelektroforese ved 100 V, i 1,5 timer.
- Visualiser den færdige gel ved hjælp af en UV Transilluminator.
- Mål ekstrakt en gelskive, der indeholder PCR-produkter fra 200 til 300 baser, og overfør gelen til et rent 2 ml mikrofugerør.
- Tilsæt 1 ml gelopløselighedspuffer fra et DNA-gelekstraktionskit til gelskiven og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter eller indtil gelen opløses ved konstant omrøring.
- Tilsæt 200 μl isopropanol til den opløste gel og bland godt ved pipettering. Overfør 700 μL af prøven til en DNA gelekstraktionsoprensningskolonne og centrifuge ved 13.000 xg i 30 s. Fortsæt overførsel af den opløste prøve til søjlen, indtil hele prøven er læst på søjlen.
- Tilsæt 500 μl gelopløselighedspuffer,Efterfulgt af 700 μl søjlevaskebuffer til søjlen ifølge producentens protokol. Tilsæt 12 μL nukleasefrit vand til midten af søjlen for at fjerne DNA'et. Pause Point: DNA kan opbevares ved -20 ° C.
- Kvantificer koncentrationen af DNA'et under anvendelse af fluorometrisk kvantificering. Hvis flere biblioteker er konstrueret og samlet sammen til sekventering, skal du tilføje lige mængder af hver prøve til puljen, til høj gennemstrømningssekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser skematisk af SPLASH-arbejdsgangen. Ved tilsætning af biotinyleret psoralen i nærvær af 0,01% digitonin og UV-tværbinding ekstraheres totalt RNA fra cellerne, og en dot blot udføres for at sikre, at tværbinding af biotinyleret til RNA'et er sket effektivt ( figur 2 ). Vi bruger biotinylerede 20 base oligos som positive kontroller til titrering af mængden af biotinyleret psoralen, der skal tilsættes til cellerne, således at ca. 1 ud af hver 150 baser tværbindes.
Da flere PCR-duplikationshændelser har tendens til at forekomme med forøgede PCR-amplifikationscykler, udfører vi en lille skala PCR-amplifikation ved hjælp af forskellige PCR-cyklusser for at bestemme det laveste antal amplifikationscykler, der vil tilvejebringe tilstrækkeligt materiale til dyb sekventering. I en effektiv forberedelse af biblioteket er viKunne amplificere et cDNA-sekventeringsbibliotek fra en 1,5 μg størrelse valgt RNA-indgang i mindre end 15 cykler af PCR-amplifikation ( figur 3 ). Biblioteket sekventeres derefter under anvendelse af 2x 150 basepar læser på en høj gennemstrømningssekvenseringsmaskine, og sekvenseringslæsningerne behandles derefter i overensstemmelse med beregningsrørledningen i figur 4 . Slutresultatet er en liste over filtrerede kimære interaktioner, der indbefatter både intramolekylære og intermolekylære RNA-RNA-interaktioner i transkriptomet ( tabel 11 ).
Figur 1 : Skematisk af den eksperimentelle arbejdsgang af SPLASH 15 . Parvis RNA-interaktioner inde i cellen krydsbindes under anvendelse af biotinyleret psoralen under UV-lys ved 365 nm. Tværbundet RNA er thEn ekstraheret og fragmenteret til omkring 100 baser. Interagerende regioner, som indeholder de biotinylerede psoralen tværbindinger, beriges ved binding til streptavidinperler og ligeres sammen. Ved omvendt tværbinding under UV-lys ved 265 nm klones de kimære RNA'er derefter i et cDNA-bibliotek til dyb sekventering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Testning af biotinyleret tværbindingseffektivitet ved prikkestik 15 . Dot blot af biotinyleret psoralen tværbundet RNA in vivo i nærvær af 1% digitonin. Forskellige koncentrationer af tværbundet RNA (20-2000 ng) ses på membranen. Forskellige koncentrationer af biotinyleret 20 baseOligo er opfattet som positive kontroller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Småskala bibliotek forstærkning til SPLASH. 1 μl cDNA fra RT-reaktionen anvendes til småskala PCR. Reaktioner udtages ved 10, 15 og 20 cyklusser og køres på en 3% agarosegel for at bestemme det minimale antal amplifikationscykler, der kræves til generering af bibliotek. I dette specifikke eksempel vil 10 cyklusser af amplifikation ved anvendelse af 10 μl cDNA i en storskala PCR-reaktion generere nok amplikoner til dyb sekventering.
| Reagenser | Volumen (μL) | Final |
| Nukleasefrit vand | 64 | |
| 10x T4 PNK buffer | 8 | 1x |
| Rnase inhibitor (20 U / μl) | 4 | 1 U / μl |
| T4 PNK (10 U / μl) | 4 | 0,5 U / μl |
| Total | 80 |
Tabel 1: Reagenser til 3'-ende reparation.
| Reagenser | Volumen (μL) | Final |
| PNK reaktion | 80 | |
| Nukleasefrit vand | 3 | |
| 10x T4 PNK buffer | 2 | 1x |
| 10 mM ATP | 10 | 1 mM |
| T4 PNK (10 U / μl) | 5 | 0,5 U / μl |
| Total | 100 |
Tabel 2: Reagenser til 5'-ende reparation.
| Reagenser | Volumen (μL) | Final |
| PNK reaktion | 100 | |
| 10x T4 RNA ligase buffer | 6 | 1x |
| 10 mM ATP | 6 | 1 mM |
| Rnase inhibitor (20 U / μl) | 4 | 0,5 U / μl |
| T4Rnl1 (10 U / μl) | 40 | 2,5 U / μl |
| Nuclease freE vand | 4 | |
| Total | 160 |
Tabel 3: Reagenser til nærhedsligation.
| Komponent | Mængde pr. Reaktion (μL) | Final |
| RNA og linker | 5 | |
| T4 Rnl2 buffer (10x) | 1 | 1x |
| PEG 8000 (50%, vægt / volumen) | 3 | 15% (vægt / volumen) |
| Rnase inhibitor (20 U / μl) | 0,5 | 1 U / μl |
| T4Rnl2 (tr) (200U / μl) | 0,5 | 10 U / μL |
| Total | 10 |
Tabel 4: Reagenser til adapterligation.
| Komponent | Mængde pr. Reaktion (μL) | Final |
| Ligation og primer | 6 | |
| Første streng buffer (5x) | 2 | 1x |
| DNTP'er (10 mM) | 0,5 | 0,5 mM |
| DTT (0,1 M) | 0,5 | 5 mM |
| Rnase inhibitor (20 U / μl) | 0,5 | 1 U / μl |
| Omvendt transkriptase (200 U / μl) | 0,5 | 10 U / μl |
| Total | 10 |
Tabel 5: Reagenser til revers transkription.
| Komponent | Mængde pr. Reaktion (μL) | Final |
| First-strand cDNA | 6 | |
| Enkeltstreng DNA ligase buffer (10x) | 1 | 1x |
| Betaine (5 M) | 2 | 1 M |
| MnCl2 (50 mM) | 0,5 | 2,5 mM |
| Enkeltstreng DNA ligase (100 U / μl) | 0,5 | 5U / pl |
| Total | 10 |
Tabel 6: Reagenser til cirkulærisering af cDNA.
| Komponent | Mængde pr. Reaktion (μL) | Final |
| Ligeret DNA-produkt | 1 | |
| Nukleasefri vand | 10.5 | |
| High-Fidelity DNA polymerase 2x master mix | 12.5 | 1x |
| Universal PCR Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 μM |
| Indeks (X) Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 μM |
| Total | 25 |
Tabel 7: Reagenser anvendt til småskala PCR.
| Trin | Temperatur | Tid | Cykler |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| denaturering | 98 ° C | 10 s | |
| annealing | 65 ° C | 30 s | 25 |
| Forlængelse | 72 ° C | 30 s | |
| Endelig forlængelse | 72 ° C | 5 min | |
| Holde | 4 ° C | ∞ |
Tabel 8: Betingelser anvendt til småskala PCR.
| Komponent | Mængde pr. Reaktion (μL) | Final |
| Ligeret DNA-produkt | 5 | |
| Nukleasefri vand | 6.5 | |
| High-Fidelity DNA polymerase 2x master mix | 12.5 | 1x |
| Universal PCR Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 μM |
| Indeks (X) Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 μM |
| Total | 25 |
Tabel 9: Reagenser anvendt til storskala PCR.
| Trin | Temperatur | Tid | Cykler |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| denaturering | 98 ° C | 10 s | |
| annealing | 65 ° C | 30 s | Y |
| Forlængelse | 72 ° C | 30 s | |
| Endelig forlængelse | 72 ° C | 5 min | |
| Holde | 4 ° C | ∞ |
Tabel 10: Betingelser anvendt til storskala PCR.
Tabel 11: Analyseudgang af beregningsrørledningen. "SAM flag splittet læs 1" = 0 indikerer at læsningen er kortlagt til transcriptomets positive streng. "RNA 1-identitet" henviser til identiteten af RNA'et til venstre for kimæren. "RNA 1 startposition" refererer til startpositionen, som læsningen er kortlagt langs RNA 1. "RNA 1-slutposition" refererer til slutpositionen, som læsningen er kortlagt langs RNA 1. "Kortlægningstest delt læs 1" refererer til Til mapping score af den læsning, der blev kortlagt til RNA 1. "Cigar split split 1"Angiver antallet af baser, der blev klippet ud af læsningen "S" og antallet af baser, der blev kortlagt til læsningen "M". "Split read 1" angiver den sekvens, der blev kortlagt til RNA 1. Den samme nomenklatur blev brugt til højre side af kimæren, der hedder RNA 2. Klik venligst her for at se en større version af denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi i detaljer den eksperimentelle og beregningsmæssige arbejdsgang for SPLASH, en metode, der giver os mulighed for at identificere parvise RNA-interaktioner på en genomgående måde. Vi har med succes udnyttet SPLASH i bakterielle, gær- og menneskelige kulturer og forudser, at strategien kan anvendes bredt til forskellige organismer under forskellige cellulære tilstande. Et af de kritiske trin i protokollen er at starte med mindst 20 μg tværbundet RNA for at have tilstrækkeligt materiale til nedstrøms processer. RNA'et fragmenteres derefter til 100 baser og PAGE-størrelsesvalg. Disse trin er vigtige for os at fortrinsvis berige for ligerede kimærer, snarere end monomerer under bibliotekets generationsproces. Vi genvinder typisk ca. 1,5 μg RNA efter fragmentering og det første størrelsesvalg, og RNA'en omdannes derefter til et cDNA-bibliotek ifølge SPLASH-arbejdsgangen. Vi finder, at denne mængde start RNA tillader os at generere nok materiale til hIgh-gennemløbssekvensering under anvendelse af mindre end 15 cyklusser af PCR-amplifikation. Da antallet af PCR-duplikationshændelser øges dramatisk med øgede PCR-cyklusser, er det vigtigt at holde antallet af amplifikationscykler lavt for at kunne udtrække nyttige og unikke chimærer i nedstrømsanalysen.
I modsætning til de andre genom-brede psoralenbaserede strategier udnytter SPLASH en biotinyleret version af psoralen til tværbinding af base-parrede RNA-fragmenter til hinanden. Da vi titrerede mængden af tværbinding til ca. en tværbinding pr. Hundrede og halvtreds baser, kan vi berige for tværbundne RNA-regioner ved anvendelse af streptavidinperler efter RNA-fragmentering. Endvidere tillod udførelse af enzymatiske reaktioner, mens RNA'erne er bundet på perler også os at udføre bufferudvekslinger og vasker bekvemt. En af begrænsningerne i strategien er imidlertid, at biotinyleret psoralen er mindre effektiv ved at trænge ind i celler end psoralen eller 4'-aminomethyl-triOxsalen (AMT). Som sådan er det kritisk at sikre, at biotinyleret psoralen har trængt ind i cellerne og tværbundet RNA'erne effektivt. Vi udfører rutinemæssigt prikblots på tværbundne, ekstraherede RNA'er sammen med biotinylerede oligos som positive kontroller for at sikre, at vores RNA'er er korrekt tværbundet. I tilfælde af at tværbinding er svag, kan strategier til gennemtrængning af den cellulære membran, såsom at tilføje lave koncentrationer af digitonin (til 0,01%) i 5 minutter, anvendes til at tillade biotinyleret psoralen at komme ind i cellerne effektivt. Da psoralen absorberer med samme bølgelængde som nukleinsyrer (UV 260 nm), bruger vi typisk fluorometriske kvantificeringssystemer, snarere end UV-absorption til kvantificering af tværbundne RNA'er.
En begrænsning af psoralenbaserede tværbindingsstrategier er, at psoralen fortrinsvis tværbindes ved uridiner (U). Som sådan kan baseparringsområder, der er U fattige, blive savnet under tværbinding. Således, mens der opdages en tværbindingshændelse bMellem to tråde giver bevis for, at der opstår en interaktion, er mangel på tværbinding ikke lig med manglende interaktion. I vores SPLASH-protokol fanger vi meget små mikroRNA-mRNA-interaktioner og lave mængder lncRNA-interaktioner. Da mikroRNA-bundne mRNA'er sandsynligvis bliver nedreguleret i genekspression og lncRNA'er typisk er lavt udtrykt, er deres dårlige repræsentation i vores data primært på grund af utilstrækkelig sekventeringsdybde. Vi typisk sekvens mindst 200 millioner parrede ende læser pr. Humant transkriptom bibliotek for hver replikat. På denne dybde læser det meste af vores sekventering falder på temmelig rigelige RNA'er. Vi forventer, at brugen af berigelsesstrategier for specifikke populationer af RNA'er i høj grad vil forbedre signalet for disse relativt lave rigelige RNA'er. En anden udfordring, som vi observerede ved analysering af kimære data, er at skelne mellem ægte interaktive kimære hændelser versus kimærer, som genereres fra splejsning. For at forhindre forurening oF splicing læser i vores kimæriske liste, filtrerer vi væk alle læses, der er tæt på kendte annoterede splejsningssteder i transkriptomet. Vi forventer, at den endelige liste over chimærer bliver mere præcis med mere komplette splitsningsannotationer.
Forskellige fra tidligere strategier, der fokuserede på RNA-interaktioner, der er specifikke for en enkelt RNA-art eller et enkelt RNA-bindende protein, muliggør SPLASH's evne til at kortlægge RNA-RNA-interaktioner på en genom-bred måde for alle RNA'er, at vi kan studere storskala RNA Interaktionsnetværk og for første gang at identificere nye intramolekylære og intermolekylære RNA-interaktioner. Ved hjælp af SPLASH opnåede vi tusindvis af intramolekylære og intermolekylære interaktioner i human- og gærtranskriptomerne, hvilket tillader os at se på organisationen og dynamikken i RNA interactome in vivo . Fremskridt med at integrere disse lange række RNA-interaktionsdata i RNA-strukturmodelleringsalgoritmer vil sandsynligvisForfine vores nuværende modeller af RNA organisation in vivo . Inddragelse af SPLASH i intermolekylære RNA-forudsigelsesalgoritmer, såsom snoRNA-forudsigelsesprogrammer, kan også forbedre nøjagtigheden af disse forudsigelser. Vi forventer, at fremtidige anvendelser af SPLASH på andre komplekse organismer og dynamiske systemer vil fortsætte med at kaste lys over indviklingen af RNA-baseret genregulering i biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer af Wan lab og Nagarajan lab for informative diskussioner. N.Nagarajan understøttes af finansiering fra A * STAR. Y.Wan understøttes af finansiering fra A * STAR og Society i Science-Branco Weiss Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20% SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2x RNA fragmentation buffer | |||
| 18 mM MgCl2 | |||
| 450 mM KCl | |||
| 300 mM Tris-Cl pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC |
|||
| RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
|||
References
- Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
- Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
- Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
- Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
- Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
- Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
- Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
- Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
- Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).
