Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55255
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

Summary

כאן, אנו מפרטים את השיטה של S equen של P סורלן crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH), אשר מאפשר מיפוי גנום רחב של interramolecular ו intermolecular RNA-RNA אינטראקציות in vivo . SPLASH ניתן ליישם את המחקר RNA אינטראקציות של אורגניזמים כולל שמרים, חיידקים ובני אדם.

Abstract

לדעת איך RNAs אינטראקציה עם עצמם ועם אחרים היא המפתח להבנת RNA הרגולציה הגן בתא. בעוד דוגמאות של אינטראקציות RNA-RNA כגון אינטראקציות microRNA-mRNA הוכחו כדי להסדיר ביטוי גנים, את מלוא היקף שבו אינטראקציות RNA להתרחש בתא עדיין לא ידוע. שיטות קודמות כדי לחקור אינטראקציות RNA התמקדו בעיקר על תת קבוצות של RNAs כי הם אינטראקציה עם חלבון מסוים או מינים RNA. כאן, אנו מפרטים שיטה בשם S equencing של P סורלן crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH) המאפשר לכידת גנום רחב של אינטראקציות רנ"א in vivo בצורה משוחדת. SPLASH מנצל ב crosslinking vivo , קשירת הקרבה, רצף התפוקה גבוהה לזהות intramolecular ו intermolecular RNA בסיס זוגות שותפים ברחבי העולם. SPLASH ניתן ליישם אורגניזמים שונים, כולל חיידקים, שמרים ותאי אדם, כמו גםS תנאים מגוונים הסלולר כדי להקל על ההבנה של הדינמיקה של ארגון רנ"א תחת הקשרים הסלולר מגוונים. כל פרוטוקול SPLASH ניסיוני לוקח בערך 5 ימים כדי להשלים את העבודה חישובית לוקח בערך 7 ימים כדי להשלים.

Introduction

ללמוד כיצד מקרומולקולות לקפל וליצור אינטראקציה זה עם זה הוא המפתח להבנת רגולציה גנטית בתא. בעוד שמאמצים רבים התמקדו בעשור האחרון בהבנת האופן שבו דנ"א וחלבונים תורמים לרגולציה גנטית, ידוע פחות פחות על תקנה פוסט-תעתיקית של ביטוי גנים. RNA נושאת מידע הן ברצף הליניארי שלה והן במבנה המשני שלה ושלישוני 1 . היכולת שלה בסיס זוג עם עצמו ועם אחרים חשוב לתפקידה in vivo . ההתקדמות האחרונה בתפוקה גבוהה RNA מבנה משני בדיקה חיישן סיפק תובנות ערך למיקומים של אזורים בודדים כפול בודד transcriptome 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , Howeמידע על השותפים לאינטראקציה של זוגות עדיין חסר במידה רבה. כדי לקבוע איזה רצף RNA הוא אינטראקציה עם אזור RNA אחר transcriptome, אנחנו צריכים מידע גלובלי זוג חכם.

מיפוי זוגי אינטראקציות RNA חכם באופן גלובלי, ללא דעות מוקדמות באופן מסורתי היה אתגר גדול. בעוד גישות קודמות, כגון CLASH 9 , hiCLIP 10 ו RAP 11 , משמשות לזיהוי אינטראקציות רנ"א בקנה מידה גדול, טכניקות אלה בדרך כלל מפתבות צימוד בסיס RNA עבור קבוצת משנה של RNAs או אינטראקציה עם חלבון מסוים או מינים RNA. ההתפתחויות האחרונות בחקר אינטראקציות RNA העולמי כוללים את השיטה RPL 12 , אשר אינו מייצב אינטראקציות RNA in vivo ולכן יכול רק ללכוד תת קבוצה של אינטראקציות vivo . כדי להתגבר על האתגרים הללו, אנו ואחרים פיתחנו אסטרטגיות גנומיות רחבות ובלתי מוטותP רנ"א אינטראקציה ב vivo , באמצעות גרסאות שונה של crosslinker psoralen 13 , 14 , 15 . בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הפרטים עבור ביצוע S S השוואות של Sorsen crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH), אשר מנצל psoralen biotinylated כדי crosslink בסיס זיווג RNAs ב vivo , ואחריו קשירת הקרבה ותפוקה גבוהה התפוקה כדי לזהות RNA בסיס זיווג שותפים גנום רחב ( איור 1 ) 15 .

בכתב יד זה, אנו מתארים את השלבים לביצוע SPLASH באמצעות תאים חסיד תרבותי, במקרה זה תאים הלה. פרוטוקול זהה ניתן להתאים בקלות תאים יונקים ההשעיה כדי שמרים תאים חיידקים. בקצרה, תאים Hella מטופלים עם psoralen biotinylated ו מוקרן ב 365 ננומטר כדי crosslink אינטראקציות RNA זוגות זוג in vivo. RNAs מחולצים מכן מן התאים, מקוטע מועשר על אזורים crosslinking באמצעות חרוזים streptavidin. אינטראקציה שברי RNA אז ligated יחד באמצעות קשירת הקרבה והפך לספריית cDNA עבור רצף עמוק. על רצף, RNAs chimeric ממופים על transcriptome / הגנום כדי לזהות את אזורי RNA אינטראקציה מותאמים זה לזה. יש לנו בהצלחה לנצל SPLASH לזהות אלפי אינטראקציות רנ"א in vivo בשמרים ותאים אנושיים שונים, כולל intramolecular ו intermolecular RNA בסיס צימוד בשיעורים שונים של RNAs, כגון snoRNAs, lncRNAs ו mRNAs, להציץ לתוך הארגון המבני דפוסי אינטראקציה של RNAs בתא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טיפול בתאים Hella עם Psoralen Psoralen Biotinated ו RNA

  1. התרבות תאים Hella ב Dulbecco שונה של הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין סטרפטומיצין (PS) בצלחת 10 ס"מ.
  2. לשטוף את התאים הלה פעמיים עם 5 מ"ל של 1x PBS. מסננים עודף PBS לחלוטין מן המנה על ידי הנחת צלחת אנכית במשך 1 דקות.
  3. הוסף 1 מ"ל של PBS המכיל 200 מיקרומטר של psoralen biotinylated ו 0.01% w / v digitonin, לתאים באופן אחיד ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בעוד psoralen biotinylated יכול להזין את התא, החדירות שלו הוא הרבה יותר גבוה כאשר התאים חשופים כמויות נמוכות של digitonin (0.01%) במשך 5 דקות
  4. הסר את המכסה של צלחת 10 ס"מ המכיל את התאים HeLa מטופלים ומניחים את צלחת שטוחה על הקרח. מסננים את התבנית המכילה את התאים עם UV 365 ננומטר במשך 20 דקות על הקרח, במרחק של 3 ס"מ מן נורות UV, באמצעות crosslinker UV.
  5. בידוד tRNA otal מ תאים Hella על ידי guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform החילוץ בעקבות פרוטוקול של היצרן. הוסף 1: 1 נפח של isopropanol לזרז את הרנ"א בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב isopropanol ללא הגבלת זמן. נקודה כתם יכול להתבצע בשלב זה כדי לבדוק כי psoralen biotinylated בהצלחה נכנסו לתאים ויש לו crosslinked RNAs ב vivo ( איור 2 ).
  6. צנטריפוגה RNA זירז ב XG 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לשחזר את רנ"א. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של אתנול קר 70% כדי רנ"א גלולה לשטוף את רנ"א.
  7. צנטריפוגה דגימות ב XG 20,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ואוויר יבש את גלולה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. הוסף מים nuclease חינם לגלולה RNA ו לכמת את הריכוז של RNA באמצעות ספקטרומטר UV.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר Fמקפיא חנקן נוזלי.

2. פיצול רנ"א

  1. מחממים 15 μL של חיץ פירוק 2x RNA ו 10 μL של מדגם RNA (1 מיקרוגרם / μL) בנפרד צינורות 0.2 מ"ל PCR, ב 95 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות. מערבבים 10 μL של חיץ מחומם 2x RNA חיץ עם 10 מדגם RNA μL ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה המדגם על 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. עצור את התגובה על ידי הצמד לקרר את התגובה על הקרח.
  2. העברה ובריכה את התגובות 2 פיצול לצינור microfuge 1.5 מ"ל. הוסף 40 μL של מים nuclease חינם לתגובה, 10 μL של 3 M אצטט נתרן, 1 μL של גליקוגן ו 300 μL של אתנול 100% לתגובה פיצול. דגירה של רנ"א ב -20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 שעות כדי להאיץ את רנ"א.
  3. צנטריפוגה RNA זירז ב XG 20,000 במשך 30 דקות, להסיר את supernatant ולשטוף את רנ"א באמצעות 1 מ"ל של אתנול 70%.
  4. צנטריפוגה רנ"א ב 20,000 xg במשך 15 דקות, remOve supernatant ו לפזר את רנ"א 20 μL של מים חינם nuclease.

3. בחירה גודל RNA ו elution

  1. הוסף 20 μL של צבע RNA טעינה כדי RNA התאושש בצינור microfuge. מחממים את RNA עם צבע RNA טעינה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ומניחים אותו על הקרח במשך 2 דקות.
  2. הוסף 3 μL של צבע RNA טוען μL 0.25 של סולם 10 DNA DNA בצינור microfuge. מחממים את הסולם על 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ומניחים אותו על הקרח במשך 2 דקות.
  3. טען את הסולם denatured ודגימות על גבי 8.6 ס"מ x 6.8 ס"מ 6% TBE ג'ל אוריאה ואת גודל הפיצול על ידי אלקטרופורזה במשך 40 דקות ב 180 V. הכתם הג'ל ב 10 מ"ל של חיץ TBE המכיל 1: 10,000 של ג'ל חומצה גרעין כתם עבור 5 דקות בחושך.
  4. לנקב צינור נקי 0.6 מ"ל microfuge בתחתית באמצעות מחט G 24 ומניחים אותו בצינור 2 microfuge מ"ל.
  5. דמיינו את להקות על ג'ל פוסט מוכתם באמצעות transilluminator לחתוך פרוסה ג'ל המתאים 90-110 nt. מעבירים את פרוסת ג'ל לתוך צינור ניקוד microfuge 0.6 מ"ל בצינור microfuge 2 מ"ל. בחירת גודל זה מבוצעת על מנת לאפשר את שברי chimeric יש אורך מינימלי כדי למפות את transcriptome ולהבחין בין מוצרים ligated הקרבה לעומת מוצרים לא מסודרים במדרגות הבחירה במורד הזרם.
  6. צנטריפוגה פרוסות ג'ל ב XG 12,000 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות לגרוס את פרוסת ג'ל ולאסוף אותו בצינור microfuge 2 מ"ל. מחק את צינור ריק 0.6 מ"ל microfuge. הוסף 700 μL של חיץ elution על פרוסת ג'ל shredded בצינור microfuge 2 מ"ל ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה עם סיבוב קבוע, כדי לאפשר דיפוזיה של דגימות למאגר.
  7. מעבירים את פרוסות ג'ל ואת חיץ elution כדי צנטריפוגה מסנן צינור צנטריפוגות ב XG 20,000 במשך 2 דקות. פרוסות הג'ל יילכדו בתא העליון של המסנן. מחק את פרוסות הג 'ל ואת התא העליון.
  8. הוסף 1 μL של גליקוגן ו 700 μL של isopropanol 100% לתסנין בצינור microfuge ו להאיץ את RNA ב -20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 שעות או לילה.
    השהה נקודה: RNA יכול להיות זירז ב isopropanol ללא הגבלת ב -20 מעלות צלזיוס.
  9. צנטריפוגה RNA זירז ב XG 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לשחזר את רנ"א. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול קר לשטוף את גלולה RNA. צנטריפוגה גלולה שטף ב XG 20,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  10. הסר את החיץ לשטוף ולהוסיף 20 μL של מים nuclease חינם resuspend RNA. לכמת את הריכוז של רנ"א באמצעות ספקטרומטר UV.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת פלאש בחנקן נוזלי.

4. העשרת RNA אזורים crosslinking

  1. וורטקס streptavidin מצופה חרוזים מגנטיים במרץ כדי resuspend חרוזים homogenously בצינור. העברת 100 μL של חרוזים לצינור 1.5 microfuge מ"ל ומניחים אותו על מגנטמעמד IC דקות 1 כדי לאפשר את החרוזים לדבוק בצד המגנטי של הצינור. הסר את המאגר אחסון מן החרוזים בזהירות לקחת את הצינור מתוך מעמד מגנט.
  2. הוסף מאגר 1 תמוגה מ"ל לחרוזים בצינור microfuge ופיפטה למעלה ולמטה. מניחים את microfuge המכיל חרוזים על מעמד מגנטי עבור 1 דקות להפריד את החרוזים מן החיץ לשטוף. חזור על זה עבור סך של 3 שוטף.
  3. הסר את חיץ לשטוף מן החרוזים על ידי הצבת חרוזים microfuge המכילים על מעמד מגנטי במשך 1 דקות. הוסף מעכב RNase (1: 200) למאגר תמוגה ולהוסיף 100 μL של חיץ תמוגה כדי חרוזים שטף בצינור microfuge.
  4. הוסף 2 מ"ל של חיץ הכלאה שהוכן טרי, 1 מ"ל של חיץ תמוגה בתוספת, 1.5 מיקרוגרם של RNA Rractated בגודל ו 100 μL של חרוזים resuspended לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל חרוטי. וורטקס הצינור בעדינות.
  5. דגירה צינור צנטריפוגה 15 מ"ל חרוטי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם סיבוב סוף לסיבוב.טרום לחמם את החיץ לשטוף ב 37 מעלות צלזיוס.
  6. מניחים את צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל חרוטי על מעמד מגנטי עבור צינורות 15 מ"ל במשך 2 דקות להפריד את החרוזים מן המאגר. פיפטה את המאגר בזהירות מתוך הצינור וזורקים אותו.
  7. הוסף 1 מ"ל של חיץ לשטוף מראש חימם את חרוזים, פיפטה למעלה ולמטה ולהעביר את החרוזים לצינור microfuge 1.5 מ"ל. לדגור על חרוזים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, עם סיבוב סוף הסיום.
  8. צנטריפוגות בקצרה את התוכן של הצינור microfuge. מניחים את החרוזים 1.5 מ"ל שטף צינורות microfuge על מעמד מגנטי עבור צינורות 2 מ"ל במשך 1 דקות, להפריד את החרוזים מן החיץ לשטוף. הסר את המאגר מן החרוזים על ידי pipetting בעדינות את המאגר מתוך הצינור microfuge.
  9. הוסף 1 מ"ל של חיץ לשטוף מראש לחימום חרוזים פיפטה למעלה ולמטה לחזור על לשטוף. לבצע סך של 5 שוטף. בסוף לשטוף 5, להסיר את חיץ לשטוף ידי הצבת microfuge המכילים חרוזים על מגנט לעמוד עבורדקה 1.

5. קשירת קשירת

  1. הוסף 1 מ"ל של חיץ k4ase polynucleotide T4 קר (PNK) חיץ כדי חרוזים שטף דגירה חרוזים במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, עם סיבוב הסיום. מניחים את הצינור microfuge המכיל את החרוזים על רצועת מגנטי במשך 1 דקות בעדינות להסיר את המאגר PN4 TK. חזור על שלב זה עבור סך של 2 שוטף ולהסיר את חיץ PNK T4 לאחר לשטוף האחרון.
  2. הוסף חוצצים לחרוזים, לפי טבלה 1 . כדי לאפשר את הקצוות 3 'של קטע רנ"א להיות ligated ל 3' מתאמים להלן, דגירה החרוזים במאגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות עם תסיסה מתמדת להמיר את 3 "מחזורי פוספט הקבוצה בסוף RNA כדי 3 'אה.
  3. הוסף למאגרים את התגובה הקודמת, לפי טבלה 2 . כדי לאפשר את הקצה 5 'של שברי רנ"א להיות קשירת המוסמכת, דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות עם תסיסה מתמדת בנוכחות ATP, כדי להמיר 5 'OH על רנ"א כדי 5' פוספט.
  4. הוסף חיץ לתגובה הקודמת לביצוע קשירת הקרבה, על פי טבלה 3 . דגירה התגובה ב 16 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות, עם תסיסה מתמדת,
  5. מניחים את microfuge המכיל את הרנ"א ligated על מעמד מגנט במשך 1 דקות. הסר את supernatant בזהירות ולהוסיף 1 מ"ל של טמפרטורת החדר לשטוף טמפרטורה החרוזים. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה.
  6. מניחים את הצינור microfuge על מגנט לעמוד דקות 1 ולהסיר את החיץ לשטוף בזהירות. לבצע סך של 2 שוטף, ולהסיר את חיץ לשטוף מן חרוזים בסוף לשטוף את השני.
  7. הוסף 100 μL של חיץ PK RNA כדי חרוזים resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה. מחממים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על בלוק חום.
  8. צינת המדגם על הקרח דקות 1 ולהוסיף 500 μL של guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform למדגם. מערבבים על ידי vortexing במרץ עבור 10 s. דגירה mixtuמחדש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
  9. הוסף 100 μL של כלורופורם כדי guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform חילוץ דגימות. וורטקס במרץ עבור 10 s. צנטריפוגה דגימות ב XG 20,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  10. העברת 400 μL של השכבה מימית צינור חדש 1.5 מ"ל microfuge. הוסף 800 μL (2 כרכים) של אתנול 100% ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  11. מעבירים את הפתרון RNA לעמודי ניקוי RNA ולשחזר את ההוראות הבאות של היצרן רנ"א, להבטיח כי גם RNAs קטנים נשמרים. Elute RNA ב μL 100 של מים ללא nuclease.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת פלאש בחנקן נוזלי.

6. היפוך crosslinking של Psoralen Biotinylated

  1. מעבירים את μL 100 של דגימות eluted לתוך באר של 24 גםאכלתי. הסר את המכסה להקרין את המדגם תחת 254 ננומטר UV, במשך 5 דקות על הקרח.
  2. מעבירים את המדגם crosslinked הפוך לצינור microfuge נקי. הוסף 10 μL של אצטט נתרן, 1 μL של גליקוגן ו 300 μL של אתנול 100% ו להאיץ את RNA ב -20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 שעות או לילה.
    השהה נקודה: RNA יכול להיות זירז אתנול ללא הגבלת ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. צנטריפוגה RNA זירז ב XG 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לשחזר את רנ"א. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול קר לשטוף את גלולה RNA.
  4. צנטריפוגה גלולה שטף ב XG 20,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את חיץ לשטוף ולהוסיף 4.25 μL של מים nuclease חינם resuspend RNA. מעבירים את RNA לצינור 0.2 מ"ל PCR.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת פלאש בחנקן נוזלי.

7. הפוך שעתוק ו cDNA Circularization

  1. הוסף 0.75 μLשל מקשר RNA (0.5 מיקרוגרם / μL) למדגם resuspended ב צינור PCR וחום על 80 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. מניחים את המדגם על הקרח במשך 2 דקות.
  2. הוסף את המאגרים למדגם מפוגל עבור קשירת 3 מתאם, על פי טבלה 4 . דגירה התגובה ב 25 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות.
  3. מעבירים את התגובה לצינור microfuge 1.5 מ"ל. הוסף 90 μL של מים nuclease חינם לתגובה, ואחריו μL 10 של אצטט נתרן, 1 μL של גליקוגן ו 300 μL של אתנול 100%. להאיץ את רנ"א ב -20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 שעות או לילה.
    השהה נקודה: RNA יכול להיות זירז אתנול ללא הגבלת ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. צנטריפוגה RNA זירז ב XG 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לשחזר את רנ"א. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול קר לשטוף את גלולה RNA.
  5. צנטריפוגה גלולה שטף ב 20,000 גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את החיץ לשטוף resuspend גלולה μL 5 של nuclease חינם WAter.
  6. הוסף 5 μL של צבע RNA טעינה כדי RNA התאושש בצינור microfuge. מחממים את RNA עם צבע RNA טעינה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ומניחים אותו על הקרח במשך 2 דקות.
  7. הוסף 3 μL של צבע RNA טוען μL 0.25 של סולם 10 DNA DNA בצינור microfuge. מחממים את הסולם על 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ומניחים אותו על הקרח במשך 2 דקות.
  8. ביצוע החלוקה גודל באמצעות 8.6 ס"מ x 6.8 ס"מ 6% TBE אוריאה ג'ל כמו בשלבים 3.3 ו -3.4.
  9. דמיינו את הג 'ל מוכתם כתם חומצה גרעין באמצעות transilluminator וחותכים פרוסה ג'ל המתאים 110-140 nt על הסולם. מעבירים את פרוסת ג'ל לתוך צינור microctuge 0.6 מ"מ microfuge בצינור microfuge 2 מ"ל ופעל בפרוטוקול מ 3.6-3.9.
  10. הוסף 5 μL של מים nuclease חינם resuspend גלולה RNA. מעבירים את RNA לצינור 0.2 מ"ל PCR.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת פלאש בחנקן נוזלי.
  11. הוסף 1 μL של תחל RT ב 1.2581, M כדי RNA ב צינור PCR וחום על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מניחים את המדגם על הקרח במשך 2 דקות.
  12. הוסף את המאגרים לתעתיק הפוך בהתאם לטבלה 5 . לדגור את התגובה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  13. הוסף 1.1 μL של 1 NaOH N לתגובה וחום ב 98 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מניחים את התגובה על הקרח.
  14. מעבירים את התגובה לצינור microfuge 1.5 מ"ל. הוסף 90 μL של מים nuclease חינם לתגובה, ואחריו μL 10 של אצטט נתרן, 1 μL של גליקוגן ו 300 μL של אתנול 100%. להאיץ את ה- DNA ב -20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 או לילה.
    השהה נקודה: ה- DNA יכול להיות זירז אתנול ללא הגבלת ב -20 מעלות צלזיוס.
  15. צנטריפוגות ה- DNA זירז ב 20,000 גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לשחזר את ה- DNA. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול קר לשטוף את גלולה דנ"א. צנטריפוגה גלולה שטף ב XG 20,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את לשטוף את הכביסה resuspend pelלתת 5 μL של מים חינם nuclease.
  16. ביצוע החלוקה גודל באמצעות 8.6 ס"מ x 6.8 ס"מ 6% TBE אוריאה ג'ל כמו בשלבים 3.3 ו -3.4.
  17. דמיינו את הג 'ל פוסט מוכתם באמצעות transilluminator לחתוך פרוסה ג'ל המתאים 200-240 nt על הסולם. הפוך transcribed cDNA עכשיו 96 בסיסים יותר מאשר קטע RNA בשל תוספת של 96 בסיס RT תחל. מעבירים את פרוסת ג'ל לתוך צינור ניקוד microfuge 0.6 מ"ל בצינור microfuge 2 מ"ל.
  18. צנטריפוגה פרוסות ג'ל ב XG 12,000 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות לגרוס את פרוסת ג'ל ולאסוף אותו בצינור microfuge 2 מ"ל. מחק את צינור ריק 0.6 מ"ל microfuge.
  19. הוסף 700 μL של חיץ elution על פרוסת ג'ל shredded בצינור 2 microfuge מ"ל ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם סיבוב קבוע. בצע את הפרוטוקול כפי שמתואר בשלבים 3.7-8.8.
  20. הוסף 6 μL של מים nuclease חינם resuspend גלולה דנ"א. מעבירים את ה- DNA צינור 0.2 מ"ל PCR.
  21. הוסף את המאגרים לתגובה עבור מעגלי cDNA, על פי טבלה 6 . לדגור את התגובה ב 60 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות וחום על 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להשבית את התגובה.
  22. מעבירים את התגובה לצינור microfuge 1.5 מ"ל. לטהר את cDNA מעגלית באמצעות עמודה ניקוי DNA בעקבות הוראות היצרן. הוסף 20 μL של מים nuclease חינם לעמוד כדי elute מטוהרים cDNA.
    השהה נקודה: DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.

8. הגברה PCR (קנה מידה קטן PCR)

  1. הוסף את המאגרים לתגובה על פי טבלה 7 עבור הגברה PCR לבדוק את מספר מינימלי של מחזורים צריך הגברה הספריה.
  2. הגדר את תנאי רכיבה על PCR על פי לוח 8 . להשהות את התגובה ולהעביר 5 μL שלהתגובה PCR ב 10, 15 ו - 20 מחזורים, לתוך צינורות נפרדים 1.5 מ"ל microfuge.
  3. הוסף 1 μL של 6x DNA ג'ל טוען צבע לכל אחד 5 תגובה μL PCR במחזורים שונים. בצע ג'ל אלקטרופורזה על ג'ל agarose 3%, ב 120 V, במשך שעה 1 לדמיין את מוצרי ה- PCR.
    1. השתמש במספר הנמוך ביותר של מחזורי PCR (Y) המציגים הגברה בסביבות 250 בסיסים ( באיור 3 , יש להקה חזקה ב 15 מחזורים של הגברה ו הלהקה חלש ב 10 מחזורים 12. 12 מחזורים של הגברה PCR בקנה מידה גדול צפוי ליצור מספיק חומר עבור רצף עמוק כמו כמות cDNA בשימוש הוא 10 פעמים כי הגברה PCR בקנה מידה קטן).

9. הגברה PCR (בקנה מידה גדול PCR) וטיהור

  1. הוסף את המאגרים לתגובה על פי טבלה 9 עבור הגברה PCR עבור PCR בקנה מידה גדול.
  2. הגדר את תנאי רכיבה על אופניים PCR על פילוח 10 .
  3. הוסף 5 μL של 6x דנ"א ג'ל טעינת צבע μL 25 של תגובה PCR לטעון לתוך באר של ג'ל agarose 3%. טען 1 קילו פלוס סולם DNA לתוך באר נפרד. בצע ג'ל אלקטרופורזה ב 100 V, עבור 1.5 שעות.
  4. דמיינו את הג'ל השלם באמצעות Transilluminator UV.
  5. גודל לחלץ פרוסה ג'ל המכיל מוצרים PCR מ 200-300 בסיסים ולהעביר את הג'ל לצינור נקי 2 microfuge מ"ל.
  6. הוסף 1 מ"ל של חיץ מסיסות ג'ל, מתוך ערכת ג'ל דנ"א החילוץ, כדי פרוסת ג'ל ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, או עד הג 'ל מתמוסס, עם תסיסה מתמדת.
  7. הוסף 200 μL של isopropanol על ג 'ל מומס ומערבבים היטב על ידי pipetting. העברת 700 μL של המדגם למוצר ג 'ל DNA מיצוי ניקוי עמודה צנטריפוגה ב XG 13,000 במשך 30 שניות. שמור את העברת המדגם מומס לעמודה עד כל המדגם נטען על העמודה.
  8. הוסף 500 μL חיץ המסיסות ג'ל,ואחריו 700 μL של חיץ לשטוף עמודה, לעמודה, על פי פרוטוקול של היצרן. הוסף 12 μL של מים nuclease חינם למרכז הטור כדי לחמוק DNA. השהה נקודה: DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  9. לכמת את הריכוז של ה- DNA באמצעות כימות fluorometric. אם ספריות מרובות נבנות ומאוחדות יחד עבור רצף, מוסיפים כמות שווה של כל דגימה לבריכה, עבור סידור תפוקה גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מתאר את הסכימה של זרימת העבודה SPLASH. על תוספת של psoralen biotinylated בנוכחות 0.01% digitonin, ו crosslinking UV, RNA סך מופק מהתאים ואת כתם נקודה מבוצעת על מנת להבטיח crosslinking של biotinylated כדי RNA קרה ביעילות ( איור 2 ). אנו משתמשים biiginylated בסיס אוליגוס 20 כמו פקדים חיוביים כדי טיטרציה כמות psoralen biotinylated להתווסף לתאים, כך בערך 1 בכל 150 בסיסים הם crosslinked.

כמו יותר אירועים שכפול PCR נוטים להתרחש עם מחזורי הגברה PCR מוגברת, אנו מבצעים בקנה מידה קטן הגברה PCR באמצעות מחזורי PCR שונים כדי לקבוע את המספר הנמוך ביותר של מחזורי הגברה שיספק חומר מספיק עבור רצף עמוק. בתהליך הכנה ספרייה יעיל, אנחנומסוגל להגביר ספריית רצף cDNA מ 1.5 מיקרוגרם של גודל קלט RNA שנבחר פחות מ -15 מחזורים של הגברה PCR ( איור 3 ). הספרייה היא רצף מכן באמצעות 2x 150 זוג הבסיס קורא על מכונת התפוקה גבוהה רצף ואת רצף קורא מעובדים מכן על פי צינור חישובית באיור 4 . התוצאה הסופית היא רשימה של אינטראקציות chimeric מסוננים אשר כוללת הן interramolecular intermolecular RNA-RNA אינטראקציות transcriptome ( טבלה 11 ).

איור 1
איור 1 : סכמטי של זרימת העבודה הניסויית של SPLASH 15 . זוג רזה אינטראקציות RNA בתוך התא הם crosslinked באמצעות psoralen biotinylated תחת אור UV ב 365 ננומטר. Crosslinked RNA הוא thEn חילוץ מקוטעת על 100 בסיסים. אינטראקציה אזורים המכילים את הקישורים passoralen biotinylated מועשרים על ידי מחייב חרוזים streptavidin ו ligated יחד. עם crosslinking לאחור תחת אור UV ב 265 ננומטר, RNAs chimeric משוכפלים אז לתוך ספריית cDNA עבור רצף עמוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 : בדיקת יעילות crosslinking biotinylated ידי נקודה סופג 15 . נקודה כתם של biotinylated psoralen crosslinked RNA ב vivo בנוכחות digitonin 1%. ריכוזים שונים של RNA crosslinked (20-2,000 ng) הם הבחינו על הממברנה. ריכוזים שונים של בסיס 20 biotinylatedאוליגו הם הבחינו שולטת חיובית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: הגברה ספריית בקנה מידה קטן עבור SPLASH. 1 μL של cDNA מתגובת RT משמש PCR בקנה מידה קטן. תגובות נלקחים ב 10, 15 ו 20 מחזורים לרוץ על ג'ל agarose 3% כדי לקבוע את המספר המינימלי של מחזורים הגברה הנדרשת עבור הדור הספרייה. בדוגמה ספציפית זו, 10 מחזורים של הגברה באמצעות 10 μL של cDNA בתגובת PCR בקנה מידה גדול יפיק amplicons מספיק עבור רצף עמוק.

איור 4
סכמטי של זרימת העבודה החישובית של SPLASH. רצף קורא מתוך רצף התפוקה גבוהה ממופים transcriptome ומסונן נגד איכות ירודה קורא, כפילויות PCR, כפולים מיפוי צומת שחבור קורא באמצעות צינור ניתוח. התפוקה הסופית היא רשימה של chimeras המייצגים הן intra ו intermolecular אינטראקציות transcriptome. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

ריאגנטים נפח (μL) סופי
מים חינם Nuclease 64
10x T4 חיץ PNK 8 1x
מעכב Rnase (20 U / μL) 4 1 U / μL
T4 PNK (10 U / μL) 4 0.5 U / μL
סה"כ 80

טבלה 1: ריאגנטים עבור תיקון 3 'סוף.

ריאגנטים נפח (μL) סופי
תגובה PNK 80
מים חינם Nuclease 3
10x T4 חיץ PNK 2 1x
10 מ"מ ATP 10 1 מ"מ
T4 PNK (10 U / μL) 5 0.5 U / μL
סה"כ 100

טבלה 2: ריאגנטים לתיקון 5 'סוף.

ריאגנטים נפח (μL) סופי
תגובה PNK 100
10x T4 RNA ligase חיץ 6 1x
10 מ"מ ATP 6 1 מ"מ
מעכב Rnase (20 U / μL) 4 0.5 U / μL
T4 Rnl1 (10 U / μL) 40 2.5 U / μL
Nuclease freמים 4
סה"כ 160

טבלה 3: ריאגנטים עבור קשירת הקרבה.

רְכִיב כמות לתגובה (μL) סופי
RNA ומקשר 5
T4 חיץ Rnl2 (10x) 1 1x
PEG 8000 (50%, wt / vol) 3 15% (wt / vol)
מעכב Rnase (20 U / μL) 0.5 1 U / μL
T4 Rnl2 (tr) (200U / μL) 0.5 10 U / μ; L
סה"כ 10

טבלה 4: ריאגנטים עבור קשירת מתאם.

רְכִיב כמות לתגובה (μL) סופי
קשירת פריימר 6
חיץ ראשון גדיל (5x) 2 1x
DNTPs (10 מ"מ) 0.5 0.5 מ"מ
DTT (0.1 M) 0.5 5 מ"מ
מעכב Rnase (20 U / μL) 0.5 1 U / μL
Transcriptase הפוך (200 U / μL) 0.5 10 U / μL
סה"כ 10

טבלה 5: ריאגנטים לתעתיק הפוך.

רְכִיב כמות לתגובה (μL) סופי
גדיל ראשון cDNA 6
יחיד גדיל DNA Ligase חיץ (10x) 1 1x
Betaine (5 M) 2 1 M
MnCl 2 (50 מ"מ) 0.5 2.5 מ"מ
יחיד גדיל DNA ligase (100U / μL) 0.5 5U / μL
סה"כ 10

טבלה 6: ריאגנטים עבור מעגלית של cDNA.

רְכִיב כמות לתגובה (μL) סופי
LNA DNA המוצר 1
מים חינם Nuclease 10.5
High-Fidelity DNA פולימראז 2x לערבב הורים 12.5 1x
יוניברסל PCR תחל (10 מיקרומטר) 0.5 0.02 מיקרומטר
אינדקס (X) פריימר (10 מיקרומטר) 0.5 0.02 מיקרומטר
סה"כ 25

טבלה 7: ריאגנטים המשמשים PCR בקנה מידה קטן.

שלב טֶמפֶּרָטוּרָה זְמַן מחזורים
דנטורציה ראשונית 98 ° C 30 s 1
דנטורציה 98 ° C 10 s
רִכּוּך 65 ° C 30 s 25
סיומת 72 ° C 30 s
תוסף סופי 72 ° C 5 דקות
לְהַחזִיק 4 ° C 850

טבלה 8: תנאים המשמשים ל- PCR בקנה מידה קטן.

רְכִיב כמות לתגובה (μL) סופי
LNA DNA המוצר 5
מים חינם Nuclease 6.5
High-Fidelity DNA פולימראז 2x לערבב הורים 12.5 1x
יוניברסל PCR תחל (10 מיקרומטר) 0.5 0.02 מיקרומטר
אינדקס (X) פריימר (10 מיקרומטר) 0.5 0.02 מיקרומטר
סה"כ 25

טבלה 9: ריאגנטים המשמשים PCR בקנה מידה גדול.

שלב טֶמפֶּרָטוּרָה זְמַן מחזורים
דנטורציה ראשונית 98 ° C 30 s 1
דנטורציה 98 ° C 10 s
רִכּוּך 65 ° C 30 s Y
סיומת 72 ° C 30 s
תוסף סופי 72 ° C 5 דקות
לְהַחזִיק 4 ° C 850

טבלה 10: תנאים המשמשים ל- PCR בקנה מידה גדול.

לוח 11
טבלה 11: תוצר ניתוח של צינור החישוב. "דגל SAM לפצל לקרוא 1" 0 = מציין כי הקריאה ממופה על גדיל חיובית של transcriptome. "זהות רנ"א 1" מתייחס לזהות הרנ"א משמאל לכימרה. "RNA 1 עמדת ההתחלה" מתייחס למיקום ההתחלה שאליו הקריאה ממופה לאורך RNA 1. "RNA 1 end position" מתייחס למיקום הסיום שאליו הקריאה ממופה לאורך RNA 1. "מיפוי ציון לפצל לקרוא 1" מתייחס כדי את הציון מיפוי של לקרוא כי היה ממופה RNA 1. "סיגר לפצל לקרוא 1"מציין את מספר הבסיסים שנחתכו מהקורא "S" ומספר הבסיסים שמופו לקריאת "M". "פיצול לקרוא 1" מציין את הרצף כי ממופה RNA 1. המינוח אותו שימש בצד ימין של כימרה, אשר נקרא כמו RNA 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של הטבלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מתארים בפירוט את זרימת עבודה ניסיונית וחישובית עבור SPLASH, שיטה המאפשרת לנו לזהות אינטראקציות RNA חכם חכמים בצורה גנום רחב. אנו ניצלו בהצלחה SPLASH בתרבית חיידקים, שמרים ותרבויות האדם צופים כי האסטרטגיה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על אורגניזמים שונים תחת מדינות הסלולר שונים. אחד הצעדים הקריטיים בפרוטוקול היא להתחיל עם לפחות 20 מיקרוגרם של RNA crosslinked יש חומר הולם עבור תהליכים במורד הזרם. רנ"א הוא מקוטע אז 100 בסיסים ו- PAGE גודל נבחרים. צעדים אלה חשובים לנו להעדיף להעדיף עבור chimeras ligated, ולא מונומרים במהלך תהליך הספרייה הדור. אנחנו בדרך כלל לשחזר סביב 1.5 מיקרוגרם של רנ"א לאחר פיצול ואת גודל הבחירה הראשונה, ואת רנ"א הוא מומרים אז לספריית cDNA על פי זרימת עבודה SPLASH. אנו מוצאים כי כמות זו של RNA מתחיל מאפשר לנו לייצר מספיק חומר עבור חסידור תפוקה using באמצעות פחות מ 15 מחזורים של הגברה PCR. כמו מספר האירועים שכפול PCR עולה באופן דרמטי עם מחזורי PCR מוגברת, שמירה על מספר מחזורים הגברה נמוכה הוא קריטי כדי להיות מסוגל לחלץ שימושי, chimeras ייחודי בניתוח במורד הזרם.

בניגוד לגנום רחב אחרים המבוססים על אסטרטגיות פסורלן, SPLASH מנצל גרסה biotinylated של psoralen כדי crosslink בסיס לזווג שברי RNA אחד לשני. כפי שאנו טיטרציה את כמות crosslinking לאחד crosslink לכל מאה וחמישים בסיסים, אנחנו יכולים להעשיר עבור אזורים RNA crosslinked באמצעות חרוזים streptavidin לאחר פיצול רנ"א. יתר על כן, ביצוע תגובות אנזימטיות בזמן RNAs כרוכים על חרוזים גם מותר לנו לבצע חילופי חיץ ו שוטף בנוחות. עם זאת, אחת המגבלות של האסטרטגיה היא כי psoralen biotinylated יעיל פחות לחדור לתאים מאשר psoralen או 4'-aminomethyl triאוקסלן (AMT). ככזה, זה קריטי כדי להבטיח כי psoralen biotinylated נכנס לתאים crosslinked RNAs ביעילות. אנחנו שגרתיים לבצע כתמים נקודה על crosslinked, RNAs שחולצו, יחד עם oligos biotinylated כמו שולטת חיובית, כדי להבטיח RNAs שלנו הם crosslinked כראוי. אם crosslinking הוא חלש, אסטרטגיות לחדור את הממברנה הסלולרית, כגון הוספת ריכוזים נמוכים של digitonin (ל 0.01%) במשך 5 דקות, ניתן להשתמש כדי לאפשר psoralen biotinylated להיכנס התאים ביעילות. כמו psoralen סופג באותו אורך גל כמו חומצות גרעין (260 ננומטר UV), אנחנו בדרך כלל משתמשים במערכות כימות fluorometric, ולא ספיגת UV לכימות של RNAs crosslinked.

מגבלה אחת של אסטרטגיות crosslinking מבוסס psoralen היא כי psoralen מעדיפים crosslinks ב uridines (U). ככזה, אזורי זיווג בסיס כי הם עניים U יכול לפספס במהלך crosslinking. לפיכך, בעת גילוי אירוע crosslinking בבין שני גדילים מספקים ראיות לכך שקיימת אינטראקציה, היעדר הקישוריות אינו משווה לחוסר אינטראקציה. בפרוטוקול SPLASH שלנו, אנו ללכוד אינטראקציות microRNA-mRNA מעט מאוד, כמויות נמוכות של אינטראקציות lncRNA. כמו mRNAs מחויב microRNA צפויים להיות downregulated בביטוי גנים lncRNAs הם בדרך כלל לידי ביטוי נמוך, ייצוגם המסכן הנתונים שלנו נובע בעיקר עומק רצף מספיק. אנחנו בדרך כלל רצף לפחות 200 מיליון זוג סוף סוף קורא לכל ספריית transcriptome האנושי עבור כל לשכפל. בעומק זה, רוב הרצף שלנו קורא נופל על RNAs שופע למדי. אנו צופים כי השימוש של אסטרטגיות העשרה עבור אוכלוסיות ספציפיות של RNAs יהיה מאוד לשפר את האות עבור אלה RNAs שופע נמוך יחסית. אחד האתגרים האחרים שראינו בניתוח נתונים chimeric הוא להבחין בין אירועי chimeric אינטראקציה אמיתית לעומת chimeras שנוצרו שחבור. כדי למנוע זיהוםF splicing קורא ברשימה chimeric שלנו, אנו לסנן את כל הקריאות כי הם קרובים ידועים אתרי שחבור המצוין transcriptome. אנו צופים כי עם יותר סימוני השחזור המלא, הרשימה הסופית של chimeras יהפוך אפילו יותר מדויק.

שונה מאסטרטגיות קודמות שהתמקדו אינטראקציות רנ"א ספציפיים מינים RNA יחיד או חלבון יחיד מחייב RNA, היכולת של SPLASH למפות אינטראקציות RNA-RNA באופן גנום רחב עבור כל RNAs מאפשר לנו ללמוד RNA בקנה מידה גדול רשתות אינטראקציה כדי לזהות אינטראקציות רומנטי intramolecular ו intermolecular רומן בפעם הראשונה. באמצעות SPLASH, השגנו אלפי אינטראקציות intramolecular ו intermolecular האנושי transcriptomes שמרים, ומאפשר לנו להציץ לתוך הארגון ואת הדינמיקה של אינטראקציה רנ"א in vivo . ההתקדמות בשילוב זה טווח ארוך RNA אינטראקציה נתונים לתוך RNA מבנה אלגוריתמים דוגמנות צפוילחדד את הדגמים הנוכחיים שלנו של ארגון RNA ב vivo . שילוב SPLASH לתוך אלגוריתמים חיזוי RNA intermolecular, כגון תוכניות חיזוי snoRNA, יכול גם לשפר את הדיוק של תחזיות אלה. אנו צופים כי השימושים העתידיים של SPLASH על אורגניזמים מורכבים אחרים ומערכות דינמיות ימשיכו לשפוך אור על המורכבות של רגולציה RNA הרגולציה בביולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי המעבדה וואן ומעבדת Nagarajan לדיונים אינפורמטיביים. N.Nagarajan נתמך על ידי מימון מ * כוכב. Y.Wan נתמך על ידי מימון מ- A * סטאר וחברה במדע- Branco Weiss Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Plus DNA Ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10787026 DNA ladder
10 bp DNA ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10821-015 DNA ladder
20% SDS solution First BASE BUF-2052-1L  
20x SSC First BASE BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution First BASE BUF-1151-1L-pH5.2   Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 Bio-Rad 1610145 TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit Life Technologies Holdings Pte Ltd AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade   Promega V3131  TBE Urea gel component
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Chloroform Merck 1.02445.1000 RNA extraction
Single strand DNA ligase Epicentre CL9025K CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters Sigma-Aldrich CLS8160-96EA Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE Sigma-Aldrich D5628-1G For cell treatment
Dark Reader Transilluminator  Clare Chemical Research Dark Reader DR89X Transilluminator Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x) Life Technologies Holdings Pte Ltd R0611 Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium Pan BioTech P04-03500 For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads Life Technologies Holdings Pte Ltd 65002 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetic stand for 15 mL tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd 12301D DynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd 12321D DynaMag-2
ThermoMixer Eppendorf 5382 000.015 Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen Life Technologies Holdings Pte Ltd 29986 EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL  Hitachi F8T5/BL  365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum Life Technologies Holdings Pte Ltd 10270106   Components of Hela medium
Formamide Promega H5052   Component in hybridization buffer
G8T5 Sankyo-Denki G8T5 254 nm UV bulb
Glycogen Life Technologies Holdings Pte Ltd 10814010 Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop Life Technologies Holdings Pte Ltd Nanodrop 2000 Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water  First BASE BUF-1180-500ml  
Penicillin Streptomycin   Life Technologies Holdings Pte Ltd 15140122   Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x) Life Technologies Holdings Pte Ltd F531L  Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1 New England Biolabs E7335L  PCR primers
DNA Gel Extraction Kit QIAgen 28106 QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit Life Technologies Holdings Pte Ltd Q32854 Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit Qiagen 74106 RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor Life Technologies Holdings Pte Ltd AM2696 SUPERase In
Reverse transcriptase Life Technologies Holdings Pte Ltd 18080400 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies Holdings Pte Ltd S11494 SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs M0204L Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373L Enzyme for adaptor ligation
Temed Bio-Rad 1610801 TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform Life Technologies Holdings Pte Ltd 15596018 TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea First BASE BIO-2070-5kg  
UV crosslinker Stratagene 400072 UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator UVP 95-0417-01 For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich X4126-10G
DNA cleanup it Zymo Research  D4004 Zymo DNA concentrator-5 
List of software required
FastQC software 0.11.4 http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software 1.0.7 https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software 0.7.12 http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software 1.2.1 http://www.htslib.org/
PULLSEQ software 1.0.2 https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software 2.5.0c https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script AWK GNU 4.1.2 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence:
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Tags

גנטיקה גיליון 123 RNA גנומיקה אינטראקציה רצף מבנה האדם
מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan,… More

Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen. J. Vis. Exp. (123), e55255, doi:10.3791/55255 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter