Summary
Aqui, detalhamos o método de equação de S de sorgo de P soralen reticulado, L igado e Híbridos H elegidos (SPLASH), que permite o mapeamento genômico de interações intramoleculares e intermoleculares RNA-RNA in vivo . SPLASH pode ser aplicado para estudar os interactomas de RNA de organismos, incluindo leveduras, bactérias e seres humanos.
Abstract
Saber como os RNAs interagem entre si e com os outros é fundamental para entender a regulação genética baseada no RNA na célula. Embora existam exemplos de interacções ARN-ARN, tais como interacções ARNm-ARNm, mostrou-se que regulam a expressão genética, a extensão total em que as interacções ARN ocorrem na célula é ainda desconhecida. Métodos anteriores para estudar as interações de RNA focaram principalmente em subconjuntos de RNAs que estão interagindo com uma determinada proteína ou espécies de RNA. Aqui, detalhamos um método chamado S equenciamento de P soralen reticulado, L igated, e S elegido H ybrids (SPLASH) que permite a captura do genoma de ARN interações in vivo de forma imparcial. SPLASH utiliza reticulação in vivo , ligação de proximidade e sequenciação de alto rendimento para identificar parceiros de ligação de bases de ARN intramoleculares e intermoleculares globalmente. SPLASH pode ser aplicado a diferentes organismos, incluindo bactérias, leveduras e células humanas, bemS diversas condições celulares para facilitar a compreensão da dinâmica da organização do RNA sob diversos contextos celulares. Todo o protocolo SPLASH experimental leva cerca de 5 dias para ser concluído eo fluxo de trabalho computacional leva aproximadamente 7 dias para ser concluído.
Introduction
Estudar como as macromoléculas se dobram e interagem entre si é a chave para a compreensão da regulação genética na célula. Embora muitos esforços tenham sido focados na década passada na compreensão de como o DNA e as proteínas contribuem para a regulação genética, relativamente menos se sabe sobre a regulação pós-transcricional da expressão gênica. O ARN contém informação tanto na sua sequência linear como na sua estrutura secundária e terciária 1 . Sua capacidade de basear o par com si e com os outros é importante para a sua função in vivo . Os avanços recentes na sondagem de estrutura secundária de RNA de alto rendimento proporcionaram informações valiosas sobre as localizações de regiões duplas e de cadeia simples no transcriptoma 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer informações sobre o emparelhamento interação parceiros ainda está em grande parte ausente. Para determinar qual a sequ�cia de ARN que interage com outra regi� de ARN no transcriptoma, necessitamos de informa�o global de pares.
Mapear par-sábio RNA interações em um global, imparcial forma tem sido tradicionalmente um grande desafio. Embora as abordagens anteriores, tais como CLASH 9 , hiCLIP 10 e RAP 11 , sejam usadas para identificar as interações de RNA em uma maneira de grande escala, essas técnicas tipicamente mapeiam o par de bases de RNA para um subconjunto de RNAs que interagem com uma determinada proteína ou espécies de RNA. Os desenvolvimentos recentes no estudo de interacções de ARN globais incluem o método RPL 12 , que não estabiliza as interacções de ARN in vivo e, portanto, só pode capturar um subconjunto de interacções in vivo . Para superar esses desafios, nós e outros desenvolvemos estratégias genéticas, semP ARN interacional in vivo , utilizando versões modificadas do reticulador psoraleno 13 , 14 , 15 . Neste protocolo, descrevemos os pormenores para realizar a equalização de S de Hélidos H reticulados, S igated e S elegidos por P soralen (SPLASH), que utiliza psoraleno biotinilado para reticular ARNs de emparelhamento de bases in vivo , seguido por ligação de proximidade e sequenciação de alto rendimento a Identificar parceiros de ARN-base de ligação genoma-wide ( Figura 1 ] 15 .
Neste manuscrito, descrevemos as etapas para realizar SPLASH usando células aderentes cultivadas, neste caso células HeLa. O mesmo protocolo pode ser facilmente adaptado a células de mamífero de suspensão e a células de levedura e bactérias. Resumidamente, as células HeLa são tratadas com psoraleno biotinilado e irradiadas a 365 nm para interligar os pares de bases de ARN em interacção in vivo. Os RNAs são então extraídos das células, fragmentados e enriquecidos para regiões de reticulação usando esferas de estreptavidina. Os fragmentos de ARN que interagem são então ligados em conjunto utilizando ligadura de proximidade e transformados numa biblioteca de cDNA para sequenciação profunda. Após sequenciação, os ARN quiméricos são mapeados no transcriptoma / genoma para identificar as regiões que interagem com o ARN que estão emparelhadas entre si. Utilizamos com sucesso SPLASH para identificar milhares de interações de RNA in vivo em leveduras e diferentes células humanas, incluindo emparelhamento de ARN intramolecular e intermolecular em diversas classes de RNAs, como snoRNAs, lncRNAs e mRNAs, vislumbrando os padrões de organização estrutural e interação De RNAs na célula.
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Protocol
1. Tratamento de Células HeLa com Extracção de Psoraleno e ARN Biotinilados
- Células HeLa de cultura em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina estreptomicina (PS) numa placa de 10 cm.
- Lavar as células HeLa duas vezes com 5 mL de 1x PBS. Drene excesso de PBS completamente do prato, colocando o prato verticalmente por 1 min.
- Adicionar 1 mL de PBS contendo 200 μM de psoraleno biotinilado e 0,01% p / v de digitonina, às células uniformemente e incubar a 37 ° C durante 5 min. Enquanto o psoraleno biotinilado pode entrar na célula, a sua permeabilidade é muito maior quando as células são expostas a baixas quantidades de digitonina (0,01%) durante 5 min
- Remover a tampa da placa de 10 cm contendo as células HeLa tratadas e colocar o prato plano sobre gelo. Irradiar o prato que contém as células com 365 nm UV durante 20 min em gelo, a uma distância de 3 cm das lâmpadas UV, utilizando o reticulador UV.
- IsolarOtal de células HeLa por extracção de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio de acordo com o protocolo do fabricante. Adicionar volume 1: 1 de isopropanol para precipitar o ARN à temperatura ambiente durante 30 min.
Ponto de Pausa: O RNA pode ser armazenado a -20 ° C em isopropanol indefinidamente. Pode realizar-se uma transferência de pontos nesta etapa para verificar se o psoraleno biotinilado penetrou com sucesso nas células e tinha RNAs reticulados in vivo ( Figura 2 ). - Centrifugar o ARN precipitado a 20 000 xg durante 30 min a 4 ° C para recuperar o ARN. Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de etanol frio a 70% ao sedimento de ARN para lavar o ARN.
- Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e secar ao ar a pastilha durante 5 min à temperatura ambiente.
- Adicionar nuclease água livre para o RNA pellet e quantificar a concentração de RNA usando UV espectrômetro.
Ponto de Pausa: O ARN pode ser armazenado a -80 ° C após fCongelamento de chicote em nitrogênio líquido.
2. Fragmentação de RNA
- Pré-aqueça 15 μL de 2x tampão de fragmentação de ARN e 10 μL da amostra de RNA (1 μg / μL) individualmente em tubos de PCR de 0,2 mL, a 95 ° C durante 1 min. Misturam 10 μL do tampão de fragmentação de ARN 2x aquecido com 10 μL de amostra de ARN pipetando para cima e para baixo. Incubar a amostra a 95 ° C durante 5 min. Parar a reação por arrefecimento rápido da reação em gelo.
- Transferir e juntar as 2 reacções de fragmentação a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 40 μL de água livre de nuclease à reacção, 10 μL de acetato de sódio 3 M, 1 μL de glicogénio e 300 μL de etanol a 100% para a reacção de fragmentação. Incubar o ARN a -20 ° C durante pelo menos 1 h para precipitar o ARN.
- Centrifugar o ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 min, remover o sobrenadante e lavar o ARN usando 1 mL de etanol a 70%.
- Centrifugar o ARN a 20.000 xg durante 15 min, remOve o sobrenadante e dissolver o ARN em 20 μL de água livre de nuclease.
3. Selecção e eluição de tamanhos de ARN
- Adicionar 20 μL de corante de carga de ARN ao ARN recuperado no tubo de microcentrífuga. Aquecer o ARN com o corante de carga de RNA a 95 ° C durante 3 min e colocá-lo em gelo durante 2 min.
- Adicionar 3 μL de corante de carga de RNA a 0,25 μL de escada de ADN de 10 nt num tubo de microcentrífuga. Aquecer a escada a 95 ° C durante 3 min e colocá-lo em gelo por 2 min.
- Carregar a escada desnaturada e as amostras num gel de ureia TBE 8,6 cm x 6,8 cm 6% e fraccionar o tamanho por electroforese durante 40 min a 180 V. Manchar o gel em 10 mL de tampão TBE contendo 1: 10.000 de mancha de gel de ácido nucleico durante 5 Min no escuro.
- Perfure um tubo de microcentrífuga limpo de 0,6 mL na parte inferior usando uma agulha de 24 G e coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
- Visualize as bandas no gel pós-corado utilizando um transiluminador e corte uma fatia de gel correspondente a 90-110 nt. Transfira a fatia de gel para o tubo de microcentrífuga perfurado de 0,6 mL no tubo de microcentrífuga de 2 mL. Esta selec�o de tamanho �realizada para permitir que os fragmentos quim�icos tenham um comprimento m�imo para mapear para o transcriptoma e para distinguir entre produtos ligados de proximidade versus produtos n� ligados em etapas de selec�o de tamanho a jusante.
- Centrifugar as fatias de gel a 12.000 xg à temperatura ambiente durante 2 minutos para triturar a fatia de gel e recolhê-la no tubo de microcentrífuga de 2 mL. Descarte o tubo vazio de microcentrifugadora de 0,6 mL. Adicionar 700 μL de tampão de eluição à fatia de gel triturada no tubo de microcentrífuga de 2 mL e incubar a 4 ° C durante a noite com rotação constante, para permitir a difusão das amostras para o tampão.
- Transferir as fatias de gel e o tampão de eluição para um filtro de tubo de centrífuga e centrifugar a 20.000 xg durante 2 min. As fatias de gel serão aprisionadas no compartimento superior do filtro. Descarte as fatias de gel e o compartimento superior.
- Adicionar 1 μL de glicogênio e 700 μL de 100% de isopropanol ao filtrado no tubo de microcentrífuga e precipitar o ARN a -20 ° C durante pelo menos 1 h ou durante a noite.
Ponto de Pausa: O ARN pode ser precipitado indefinidamente em isopropanol a -20 ° C. - Centrifugar o ARN precipitado a 20 000 xg durante 30 min a 4 ° C para recuperar o ARN. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de etanol frio a 70% para lavar a pastilha de RNA. Centrifugar o sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Remover o tampão de lavagem e adicionar 20 μL de água livre de nuclease para ressuspender o RNA. Quantificar a concentração de RNA utilizando um espectrómetro UV.
Ponto de Pausa: O RNA pode ser armazenado a -80 ° C após congelamento rápido em nitrogênio líquido.
4. Enriquecimento de regiões de reticulação de ARN
- Vortex estreptavidina revestido magnético grânulos vigorosamente para ressuspender as esferas homogênea no tubo. Transferir 100 μL de esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e colocá-lo em um ímãDurante 1 min para permitir que os grânulos furem ao lado magnético do tubo. Remova cuidadosamente o tampão de armazenamento dos grânulos e retire o tubo do suporte magnético.
- Adicionar 1 mL de Lysis Buffer às pérolas no tubo de microcentrífuga e pipetar para cima e para baixo. Colocar a microcentrífuga contendo esferas no suporte magnético durante 1 min para separar as esferas do tampão de lavagem. Repita este procedimento para um total de 3 lavagens.
- Remover o tampão de lavagem dos grânulos, colocando o microfuge contendo grânulos sobre o suporte magnético durante 1 min. Adicionar inibidor de RNase (1: 200) ao tampão de lise e adicionar 100 μL de tampão de lise às contas lavadas no tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 2 mL de Tampão de Hibridização recentemente preparado, 1 mL de tampão de lise suplementado, 1,5 μg de ARN fraccionado de tamanho e 100 μL de esferas ressuspendidas para um tubo de centrifugação cónico de 15 mL. Vortex o tubo suavemente.
- Incubar o tubo de centrífuga cônica de 15 mL a 37 ° C por 30 min com rotação de ponta a ponta.Pré-aquecer o tampão de lavagem a 37 ° C.
- Coloque os tubos de centrifugação cônicos de 15 mL em um suporte magnético para tubos de 15 mL por 2 min para separar as esferas do tampão. Pipetar o tampão cuidadosamente para fora do tubo e descartá-lo.
- Adicionar 1 mL de tampão de lavagem pré-aquecido para as pérolas, pipetar para cima e para baixo e transferir as esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incubar nas contas a 37 ° C durante 5 min, com rotação de extremidade a extremidade.
- Centrifugar rapidamente o conteúdo do tubo de microcentrífuga. Colocar as pérolas lavadas de 1,5 mL em tubos de microcentrífuga num suporte magnético para tubos de 2 mL durante 1 min, para separar as esferas do tampão de lavagem. Remova o tampão dos grânulos, pipetando suavemente o tampão para fora do tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 1 mL de tampão de lavagem pré-aquecido para as esferas e pipeta para cima e para baixo para repetir a lavagem. Realizar um total de 5 lavagens. No final da 5ª lavagem, remova o tampão de lavagem colocando a microcentrífuga contendo grânulos no suporte do magneto para1 minuto.
5. Ligação de Proximidade
- Adicionar 1 mL de tampão de polinucleótido quinase T4 frio (PNK) às esferas lavadas e incubar as esferas durante 5 min a 4 ° C, com rotação de extremidade a extremidade. Coloque o tubo de microcentrífuga contendo os grânulos na tira magnética durante 1 min e retire suavemente o tampão T4 PNK. Repita este passo para um total de 2 lavagens e remova o tampão T4 PNK após a última lavagem.
- Adicionar tampões às contas, de acordo com a Tabela 1 . Para permitir que as extremidades 3 'do fragmento de ARN sejam ligadas a adaptadores 3' abaixo, incubar as esferas no tampão a 37 ° C durante 4 h com agitação constante para converter o grupo fosfato cíclico 3 'na extremidade do RNA para 3 'OH.
- Adicionar tampões à reacção anterior, de acordo com a Tabela 2 . Para permitir que a extremidade 5 'dos fragmentos de ARN seja capaz de ligar, incubar a reacção a 37 ° C durante 1 h com agitação constante na presença de ATP, Para converter 5 'OH no ARN em 5' fosfato.
- Adicionar tampão à reacção anterior para realizar a ligação de proximidade, de acordo com a Tabela 3 . Incubar a reacção a 16 ° C durante 16 h, com agitação constante,
- Colocar a microcentrífuga contendo o ARN ligado num suporte magnético durante 1 min. Remover cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 1 mL de tampão de lavagem à temperatura ambiente às contas. Ressuspender pipetando para cima e para baixo.
- Coloque o tubo de microcentrífuga sobre o suporte do magneto durante 1 min e remova cuidadosamente o tampão de lavagem. Realizar um total de 2 lavagens, e remover o tampão de lavagem dos grânulos no final da segunda lavagem.
- Adicionar 100 μL de RNA PK Buffer às pérolas e ressuspender pipetando para cima e para baixo. Aquecer as amostras a 95 ° C durante 10 min num bloco de calor.
- Arrefecer a amostra em gelo durante 1 min e adicionar 500 μL de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio à amostra. Misture agitando vigorosamente durante 10 s. Incubar o mixtuTemperatura ambiente durante 10 min.
Ponto de Pausa: O ARN pode ser armazenado em tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio a -80 ° C durante um par de meses. - Adicionar 100 μL de clorofórmio às amostras extraídas com tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio. Vortex vigorosamente durante 10 s. Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir 400 μL da camada aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 800 μL (2 volumes) de etanol a 100% e misturar pipetando para cima e para baixo.
- Transfira a solução de RNA para as colunas de limpeza de RNA e recupere o RNA seguindo as instruções do fabricante, garantindo que mesmo os RNAs pequenos sejam retidos. Eluir o ARN em 100 μL de água isenta de nuclease.
Ponto de Pausa: O RNA pode ser armazenado a -80 ° C após congelamento rápido em nitrogênio líquido.
6. Reticulação Reversa de Psoraleno Biotinilado
- Transferir os 100 μL das amostras eluídas para um poço de 24 pocomeu. Remover a tampa e irradiar a amostra sob UV 254 nm, durante 5 min em gelo.
- Transferir a amostra reticulada inversa para um tubo de microcentrífuga limpo. Adicionar 10 μL de acetato de sódio, 1 μL de glicogénio e 300 μL de etanol a 100% e precipitar o RNA a -20 ° C durante pelo menos 1 h ou de um dia para o outro.
Ponto de Pausa: O ARN pode ser precipitado em etanol indefinidamente a -20 ° C. - Centrifugar o ARN precipitado a 20 000 xg durante 30 min a 4 ° C para recuperar o ARN. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de etanol frio a 70% para lavar a pastilha de RNA.
- Centrifugar o sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Remover o tampão de lavagem e adicionar 4,25 μL de água livre de nuclease para ressuspender o RNA. Transfira o RNA para um tubo de PCR de 0,2 mL.
Ponto de Pausa: O RNA pode ser armazenado a -80 ° C após congelamento rápido em nitrogênio líquido.
7. Reverse Transcription and cDNA Circularization
- Adicionar 0,75 μLDe ligante de ARN (0,5 μg / μL) à amostra ressuspensa em tubo de PCR e aquecer a 80 ° C durante 90 s. Colocar a amostra em gelo durante 2 min.
- Adicionar os tampões à amostra desnaturada para ligar o adaptador 3 ', de acordo com a Tabela 4 . Incubar a reacção a 25 ° C durante 2,5 h.
- Transferir a reacção para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 90 μL de água livre de nuclease à reação, seguido por 10 μL de acetato de sódio, 1 μL de glicogênio e 300 μL de etanol a 100%. Precipitar o ARN a -20 ° C durante pelo menos 1 h ou durante a noite.
Ponto de Pausa: O ARN pode ser precipitado em etanol indefinidamente a -20 ° C. - Centrifugar o ARN precipitado a 20 000 xg durante 30 min a 4 ° C para recuperar o ARN. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de etanol frio a 70% para lavar a pastilha de RNA.
- Centrifugar o sedimento lavado a 20 000 g durante 15 min a 4 ° C. Remover o tampão de lavagem ressuspender o sedimento em 5 μL de n livre de nucleaseAter
- Adicionar 5 μL de corante de carga de ARN ao ARN recuperado no tubo de microcentrífuga. Aquecer o ARN com o corante de carga de RNA a 95 ° C durante 3 min e colocá-lo em gelo durante 2 min.
- Adicionar 3 μL de corante de carga de RNA a 0,25 μL de escada de ADN de 10 nt num tubo de microcentrífuga. Aquecer a escada a 95 ° C durante 3 min e colocá-lo em gelo por 2 min.
- Realizar o fraccionamento de tamanho utilizando 8,6 cm x 6,8 cm 6% de gel de ureia TBE como nos passos 3.3 e 3.4.
- Visualize o gel corado com mancha de ácido nucleico utilizando o transiluminador e corte uma fatia de gel correspondente a 110-140 nt na escada. Transfira a fatia de gel para o tubo de microcentrífuga perfurado de 0,6 mL no tubo de microcentrífuga de 2 mL e siga o protocolo das etapas 3,6- 3,9.
- Adicionar 5 μL de água livre de nuclease para ressuspender a pastilha de RNA. Transfira o RNA para um tubo de PCR de 0,2 mL.
Ponto de Pausa: O RNA pode ser armazenado a -80 ° C após congelamento rápido em nitrogênio líquido. - Adicionar 1 μL de iniciador RT a 1,2581; M ao ARN em tubo de PCR e aquecer a 80 ° C durante 2 min. Colocar a amostra em gelo durante 2 min.
- Adicionar os tampões para transcrição reversa de acordo com a Tabela 5 . Incubar a reacção a 50 ° C durante 30 min.
- Adicionar 1,1 μL de NaOH 1 N à reacção e aquecer a 98 ° C durante 20 min. Colocar a reacção sobre gelo.
- Transferir a reacção para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 90 μL de água livre de nuclease à reação, seguido por 10 μL de acetato de sódio, 1 μL de glicogênio e 300 μL de etanol a 100%. Precipitar o ADN a -20 ° C durante pelo menos 1 h ou durante a noite.
Ponto de Pausa: O DNA pode ser precipitado indefinidamente em etanol a -20 ° C. - Centrifugar o ADN precipitado a 20 000 g durante 30 min a 4 ° C para recuperar o ADN. Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de etanol frio a 70% para lavar a pastilha de ADN. Centrifugar o sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Remover o tampão de lavagem ressuspender o pelDeixe entrar 5 μL de água livre de nuclease.
- Realizar o fraccionamento de tamanho utilizando 8,6 cm x 6,8 cm 6% de gel de ureia TBE como nos passos 3.3 e 3.4.
- Visualize o gel pós-corado usando o transiluminador e corte uma fatia de gel correspondente a 200-240 nt na escada. O cDNA transcrito inverso é agora 96 bases mais comprido do que o fragmento de ARN devido à adição do iniciador RT de 96 bases. Transfira a fatia de gel para o tubo de microcentrífuga perfurado de 0,6 mL no tubo de microcentrífuga de 2 mL.
- Centrifugar as fatias de gel a 12.000 xg à temperatura ambiente durante 2 minutos para triturar a fatia de gel e recolhê-la no tubo de microcentrífuga de 2 mL. Descarte o tubo vazio de microcentrifugadora de 0,6 mL.
- Adicionar 700 μL de tampão de eluição à fatia de gel triturada no tubo de microcentrífuga de 2 mL e incubar a 37 ° C durante 2 h com rotação constante. Siga o protocolo conforme descrito nas etapas 3.7 a 3.8.
- Adicionar 6 μL de água livre de nuclease para ressuspender a pastilha de ADN. Transferir o DNA para um tubo de PCR de 0,2 mL.
- Adicionar os tampões à reacção para a circularização de cDNA, de acordo com a Tabela 6 . Incubar a reacção a 60 ° C durante 1 hora e aquecer a 80 ° C durante 10 minutos para inactivar a reacção.
- Transferir a reacção para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Purificar o cDNA circularizado utilizando uma coluna de limpeza de ADN de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar 20 μL de água livre de nuclease à coluna para eluir o cDNA purificado.
Ponto de Pausa: O DNA pode ser armazenado a -20 ° C por um par de meses.
8. Amplificação por PCR (PCR de pequena escala)
- Adicionar os tampões à reacção de acordo com a Tabela 7 para amplificação por PCR para testar o número mínimo de ciclos necessários para a amplificação da biblioteca.
- Configure as condições de ciclagem de PCR de acordo com a Tabela 8 . Pausar a reacção e transferir 5 μL deA reacção de PCR a 10, 15 e 20 ciclos, em tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mL.
- Adicionar 1 μL de corante de carga de gel de DNA 6x a cada uma das 5 μL de reação de PCR nos diferentes ciclos. Realizar electroforese em gel num gel de agarose a 3%, a 120 V, durante 1 h para visualizar os produtos de PCR.
- Utilize o menor número de ciclos de PCR (Y) que mostram amplificação em torno de 250 bases (na Figura 3 , existe uma banda forte a 15 ciclos de amplificação e uma banda fraca em 10 ciclos. Gerar material suficiente para sequenciamento profundo, uma vez que a quantidade de cDNA utilizada é 10 vezes superior à da amplificação por PCR em pequena escala).
9. Amplificação por PCR (PCR de Grande Escala) e Purificação
- Adicionar os tampões à reacção de acordo com a Tabela 9 para amplificação por PCR para PCR a grande escala.
- Configure as condições de ciclagem de PCR deTabela 10 .
- Adicionar 5 μL de corante de carga de gel de DNA 6x aos 25 μL de reação de PCR e carregar em um poço de um gel de agarose a 3%. Carregue 1 kb mais escada de DNA em um poço separado. Realizar electroforese em gel a 100 V, durante 1,5 h.
- Visualize o gel completo usando um Transiluminador UV.
- Tamanho extrair uma fatia de gel contendo produtos de PCR a partir de 200-300 bases e transferir o gel para um tubo de microcentrífuga limpa de 2 ml.
- Adicionar 1 mL de tampão de solubilidade em gel, de um kit de extração de gel de DNA, à fatia de gel e incubar à temperatura ambiente por 30 min, ou até o gel se dissolver, com agitação constante.
- Adicionar 200 μL de isopropanol ao gel dissolvido e misturar bem por pipetagem. Transferir 700 μL da amostra para uma coluna de limpeza de extracção de ADN gel e centrifugar a 13.000 xg durante 30 s. Manter a transferência da amostra dissolvida para a coluna até que toda a amostra tenha sido carregada na coluna.
- Adicionar 500 μL de tampão de solubilidade em gel,Seguido de 700 μL de tampão de lavagem em coluna, para a coluna, de acordo com o protocolo do fabricante. Adicionar 12 μL de água isenta de nuclease ao centro da coluna para eludir o ADN. Ponto de Pausa: O DNA pode ser armazenado a -20 ° C.
- Quantificar a concentração do DNA usando quantificação fluorométrica. Se múltiplas bibliotecas são construídas e reunidas em conjunto para seqüenciamento, adicione quantidade igual de cada amostra para o pool, para seqüenciamento de alto rendimento.
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Representative Results
A Figura 1 ilustra o esquema do fluxo de trabalho SPLASH. Após a adição de psoraleno biotinilado na presença de 0,01% de digitonina e reticulação UV, o ARN total é extraído das células e é efectuada uma transferência de pontos para assegurar que a reticulação do biotinilado com o ARN tenha ocorrido eficientemente ( Figura 2 ). Utilizamos oligos biotinilados de 20 bases como controlos positivos para titular a quantidade de psoraleno biotinilado a ser adicionado às células, de modo que aproximadamente 1 em cada 150 bases são reticuladas.
À medida que mais eventos de duplicação de PCR tendem a ocorrer com ciclos de amplificação de PCR aumentados, realizamos uma amplificação de PCR em pequena escala utilizando diferentes ciclos de PCR para determinar o menor número de ciclos de amplificação que fornecerão material suficiente para sequenciamento profundo. Num processo eficiente de preparação de bibliotecas,Capaz de amplificar uma biblioteca de sequenciação de cDNA a partir de um 1,5 μg de tamanho de entrada de ARN seleccionado em menos de 15 ciclos de amplificação por PCR ( Figura 3 ). A biblioteca é então sequenciada utilizando 2 x 150 leituras de pares de bases numa máquina de sequenciação de alto débito e as leituras de sequenciação são então processadas de acordo com a tubagem computacional na Figura 4 . O resultado final é uma lista de interacções quiméricas filtradas que inclui interacções ARN-ARN intramoleculares e intermoleculares no transcriptoma ( Tabela 11 ).
Figura 1 : Esquema do fluxo de trabalho experimental do SPLASH 15 . As interacções de RNA em pares no interior da célula são reticuladas utilizando psoraleno biotinilado sob luz UV a 365 nm. O ARN reticulado é oExtraído e fragmentado para cerca de 100 bases. As regiões de interacção que contêm as reticulações de psoraleno biotiniladas são enriquecidas por ligação a esferas de estreptavidina e ligadas em conjunto. Após reticulação reversa sob luz UV a 265 nm, os RNAs quiméricos são então clonados numa biblioteca de cDNA para sequenciação profunda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Teste da eficiência de reticulação biotinilada por transferência de pontos 15 . Dot blot de RNA reticulado com psoraleno biotinilado in vivo na presença de 1% de digitonina. Concentrações diferentes de ARN reticulado (20-2000 ng) são manchadas na membrana. Diferentes concentrações de 20 bases biotiniladasOligo são vistos como controlos positivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Amplificação de biblioteca de pequena escala para SPLASH. 1 μL de cDNA da reação RT é usado para PCR de pequena escala. As reacções são retiradas aos ciclos de 10, 15 e 20 e aplicadas num gel de agarose a 3% para determinar o número mínimo de ciclos de amplificação necessários para a produção da biblioteca. Neste exemplo espec�ico, 10 ciclos de amplifica�o utilizando 10 � de cDNA numa reac�o de PCR em grande escala ir� gerar amplic�s suficientes para sequencia�o profunda.
| Reagentes | Volume (μL) | Final |
| Água sem Nuclease | 64 | |
| Tampão 10x T4 PNK | 8 | 1x |
| Inibidor de Rnase (20 U / μL) | 4 | 1 U / μL |
| T4 PNK (10 U / μL) | 4 | 0,5 U / μL |
| Total | 80 |
Tabela 1: Reagentes para reparação em 3 '.
| Reagentes | Volume (μL) | Final |
| PNK reação | 80 | |
| Água sem Nuclease | 3 | |
| Tampão 10x T4 PNK | 2 | 1x |
| ATP 10 mM | 10 | 1 mM |
| T4 PNK (10 U / μL) | 5 | 0,5 U / μL |
| Total | 100 |
Tabela 2: Reagentes para a reparação da extremidade 5 '.
| Reagentes | Volume (μL) | Final |
| PNK reação | 100 | |
| Tampão de ligase de ARN 10x T4 | 6 | 1x |
| ATP 10 mM | 6 | 1 mM |
| Inibidor de Rnase (20 U / μL) | 4 | 0,5 U / μL |
| T4 Rnl1 (10 U / μL) | 40 | 2,5 U / μL |
| Nuclease freÁgua | 4 | |
| Total | 160 |
Tabela 3: Reagentes para ligação de proximidade.
| Componente | Quantidade por reacção (μL) | Final |
| ARN e ligante | 5 | |
| T4 tampão Rnl2 (10x) | 1 | 1x |
| PEG 8000 (50%, p / v) | 3 | 15% (p / v) |
| Inibidor de Rnase (20 U / μL) | 0,5 | 1 U / μL |
| T4 Rnl2 (tr) (200U / μL) | 0,5 | 10 U / μ;EU |
| Total | 10 |
Tabela 4: Reagentes para ligação do adaptador.
| Componente | Quantidade por reacção (μL) | Final |
| Ligação e primer | 6 | |
| Tampão de primeira cadeia (5x) | 2 | 1x |
| DNTPs (10 mM) | 0,5 | 0,5 mM |
| DTT (0,1 M) | 0,5 | 5 mM |
| Inibidor de Rnase (20 U / μL) | 0,5 | 1 U / μL |
| A transcriptase reversa (200 U / μL) | 0,5 | 10 U / μL |
| Total | 10 |
Tabela 5: Reagentes para transcrição reversa.
| Componente | Quantidade por reacção (μL) | Final |
| ADNc de primeira cadeia | 6 | |
| O tampão de ADN ligase de cadeia simples (10x) | 1 | 1x |
| Betaine (5 M) | 2 | 1 M |
| MnCl2 (50 mM) | 0,5 | 2,5 mM |
| DNA ligase de cadeia simples (100 U / μL) | 0,5 | 5U / μL |
| Total | 10 |
Tabela 6: Reagentes para circularização de cDNA.
| Componente | Quantidade por reacção (μL) | Final |
| Produto de DNA Ligado | 1 | |
| Água sem Nuclease | 10,5 | |
| Mistura principal de DNA polimerase 2x de alta fidelidade | 12,5 | 1x |
| Universal PCR Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 μM |
| Índice (X) Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 μM |
| Total | 25 |
Tabela 7: Reagentes utilizados para PCR de pequena escala.
| Degrau | Temperatura | Tempo | Ciclos |
| Denaturação Inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturação | 98 ° C | 10 s | |
| anelamento | 65 ° C | 30 s | 25 |
| Extensão | 72 ° C | 30 s | |
| Extensão Final | 72 ° C | 5 min | |
| Aguarde | 4 ° C | -benzóico. |
Tabela 8: Condições utilizadas para PCR de pequena escala.
| Componente | Quantidade por reacção (μL) | Final |
| Produto de DNA Ligado | 5 | |
| Água sem Nuclease | 6.5 | |
| Mistura principal de DNA polimerase 2x de alta fidelidade | 12,5 | 1x |
| Universal PCR Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 μM |
| Índice (X) Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 μM |
| Total | 25 |
Tabela 9: Reagentes utilizados para PCR de grande escala.
| Degrau | Temperatura | Tempo | Ciclos |
| Denaturação Inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturação | 98 ° C | 10 s | |
| anelamento | 65 ° C | 30 s | Y |
| Extensão | 72 ° C | 30 s | |
| Extensão Final | 72 ° C | 5 min | |
| Aguarde | 4 ° C | -benzóico. |
Tabela 10: Condições utilizadas para PCR de larga escala.
Tabela 11: Saída de análise do pipeline computacional. "SAM flag split read 1" = 0 indica que a leitura é mapeada para a cadeia positiva do transcriptome. "Identidade de RNA 1" refere-se à identidade do ARN da esquerda da quimera. "Posição inicial RNA 1" refere-se à posição inicial à qual a leitura é mapeada ao longo do ARN 1. "Posição final RNA 1" refere-se à posição final à qual a leitura é mapeada ao longo do RNA 1. Para a pontuação de mapeamento da leitura que foi mapeada para RNA 1. "Cigar split read 1"Indica o número de bases que foram cortadas da leitura "S" eo número de bases que foi mapeado para a leitura "M". "Split read 1" indica a seqüência que foi mapeada para RNA 1. A mesma nomenclatura foi usada para o lado direito da quimera, que é nomeado como RNA 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
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Discussion
Aqui, descrevemos em detalhes o fluxo de trabalho experimental e computacional para SPLASH, um método que nos permite identificar par-sábio RNA interações em um genoma-wide maneira. Utilizamos com sucesso SPLASH em bactérias, leveduras e culturas humanas e antecipamos que a estratégia pode ser amplamente aplicada a diversos organismos em diferentes estados celulares. Uma das etapas críticas no protocolo é começar com pelo menos 20 μg de RNA reticulado para ter material adequado para processos a jusante. O ARN é então fragmentado para 100 bases e tamanho PAGE seleccionado. Estes passos são importantes para que possamos enriquecer preferencialmente para quimeras ligadas, em vez de monómeros durante o processo de geração de bibliotecas. Normalmente recuperamos cerca de 1,5 μg de RNA após a fragmentação e a primeira selecção de tamanho, e o ARN é então convertido numa biblioteca de cDNA de acordo com o fluxo de trabalho SPLASH. Descobrimos que esta quantidade de ARN inicial nos permite gerar material suficiente para hSequenciamento de alto rendimento utilizando menos de 15 ciclos de amplificação por PCR. À medida que o número de eventos de duplicação de PCR aumenta dramaticamente com ciclos de PCR aumentados, manter o número de ciclos de amplificação baixo é crítico para ser capaz de extrair quimeras úteis e únicas na análise a jusante.
Em contraste com as outras estratégias baseadas em psoraleno ao nível do genoma, o SPLASH utiliza uma versão biotinilada de psoraleno para reticular fragmentos de ARN emparelhados à base uns com os outros. À medida que titulamos a quantidade de reticulação para aproximadamente uma ligação cruzada por cento e cinquenta bases, podemos enriquecer para regiões de ARN reticuladas utilizando esferas de estreptavidina após fragmentação de ARN. Além disso, a realização de reacções enzimáticas enquanto os RNAs estão ligados a esferas também nos permitiu realizar intercâmbios de tampão e lavagens convenientemente. Contudo, uma das limitações da estratégia é que o psoraleno biotinilado é menos eficiente na penetração nas células do que o psoraleno ou o 4'-aminometil-triOxsalen (AMT). Como tal, �cr�ico garantir que o psoraleno biotinilado tenha entrado nas c�ulas e reticulado eficientemente os RNAs. Realizamos rotineiramente transferências de pontos em RNAs extraídos, reticulados, juntamente com oligos biotinilados como controlos positivos, para assegurar que os nossos RNAs estão devidamente reticulados. No caso de a reticulação ser fraca, podem ser utilizadas estratégias para permear a membrana celular, tais como adicionar baixas concentrações de digitonina (a 0,01%) durante 5 min, para permitir que o psoraleno biotinilado entre eficientemente nas células. À medida que o psoraleno absorve no mesmo comprimento de onda que os ácidos nucleicos (UV 260 nm), usamos tipicamente sistemas de quantificação fluorométrica, em vez de absorção UV para quantificação de ARN reticulados.
Uma limitação das estratégias de reticulação baseadas em psoraleno é que o psoraleno reticula preferencialmente nas uridinas (U). Como tal, as regiões de emparelhamento de bases que são U pobres podem ser perdidas durante a reticulação. Assim, ao detectar um evento de reticulação bEntre duas vertentes fornecem evidência de que uma interação está ocorrendo, a falta de reticulação não equivale a uma falta de interação. No nosso protocolo SPLASH, capturamos muito poucas interações microRNA-mRNA, e baixas quantidades de interações lncRNA. Como mRNAs ligados a microRNA são susceptíveis de ser downregulated na expressão gênica e lncRNAs são tipicamente pouco expressa, a sua má representação em nossos dados é principalmente devido à insuficiente profundidade de seqüenciamento. Normalmente, sequenciamos, pelo menos, 200 milhões de leituras de extremidades emparelhadas por biblioteca de transcriptoma humano para cada repetição. Nesta profundidade, a maioria de nossas leituras de seqüenciamento caem em RNAs bastante abundantes. Nós antecipamos que o uso de estratégias de enriquecimento para populações específicas de RNAs irá aumentar muito o sinal para estes RNAs abundantes relativamente baixos. Um outro desafio que observamos na análise de dados quiméricos é distinguir entre verdadeiros eventos quiméricos interagentes versus quimeras que são gerados a partir de splicing. Para evitar a contaminaçãoF splicing lê em nossa lista quimérica, filtrar afastado todas as leituras que estão perto de conhecido anotado splicing sites no transcriptome. Nós antecipamos que, com anotações de emenda mais completas, a lista final de quimeras se tornará ainda mais precisa.
Diferentemente das estratégias anteriores que se concentravam nas interacções de ARN que são específicas de uma única espécie de ARN ou de uma única proteína de ligação de ARN, a capacidade do SPLASH de mapear as interacções RNA-ARN de um modo genómico para todos os RNAs permite estudar ARN em larga escala Interação intramolecular e intermolecular pela primeira vez. Usando o SPLASH, obtivemos milhares de interações intramoleculares e intermoleculares nos transcriptomas humanos e de leveduras, permitindo vislumbrar a organização ea dinâmica do ARN interativo in vivo . Os avanços na integração desses dados de interação de RNA de longo alcance em algoritmos de modelagem de estrutura de RNARefinar nossos modelos atuais de organização de RNA in vivo . Incorporar SPLASH em algoritmos intermoleculares de predição de RNA, como programas de predição de snoRNA, também pode melhorar a precisão dessas previsões. Nós antecipamos que usos futuros de SPLASH em outros organismos complexos e sistemas dinâmicos continuarão a lançar luz sobre as complexidades da regulação de genes baseados em RNA em biologia.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do laboratório Wan e do laboratório Nagarajan por discussões informativas. N.Nagarajan é apoiado pelo financiamento de A * STAR. Y.Wan é apoiado pelo financiamento de A * STAR e Sociedade em Ciência-Branco Weiss Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20% SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2x RNA fragmentation buffer | |||
| 18 mM MgCl2 | |||
| 450 mM KCl | |||
| 300 mM Tris-Cl pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC |
|||
| RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
|||
References
- Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
- Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
- Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
- Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
- Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
- Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
- Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
- Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
- Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).
