Summary
Här specificerar vi metoden för S- ekventering av P- sorolen tvärbunden, L igaterad och S väljs H ybrids (SPLASH), som möjliggör genomgående kartläggning av intramolekylära och intermolekylära RNA-RNA-interaktioner in vivo . SPLASH kan appliceras för att studera RNA-interaktomer av organismer inklusive jäst, bakterier och människor.
Abstract
Att veta hur RNA interagerar med sig själva och med andra är nyckeln till förståelsen av RNA-baserad genreglering i cellen. Även om exempel på RNA-RNA-interaktioner såsom mikroRNA-mRNA-interaktioner har visat sig reglera genuttryck, är den fullständiga utsträckning som RNA-interaktioner uppträder i cellen fortfarande okänd. Tidigare metoder för att studera RNA-interaktioner har huvudsakligen fokuserat på delmängder av RNA som interagerar med ett visst protein eller RNA-art. Här specificerar vi en metod som heter S- ekventering av P soralen tvärbunden, L igaterad och S valda H ybrids (SPLASH) som möjliggör genomgripande infångning av RNA-interaktioner in vivo på ett opartiskt sätt. SPLASH använder in vivo tvärbindning, närhetligering och hög genomströmningssekvensering för att identifiera intramolekylära och intermolekylära RNA-basparparametrar globalt. SPLASH kan appliceras på olika organismer inklusive bakterier, jäst och mänskliga celler, liksom aS olika cellulära förhållanden för att underlätta förståelsen av RNA-organisationens dynamik under olika cellulära sammanhang. Hela experimentella SPLASH-protokollet tar ungefär 5 dagar att slutföra och beräkningsflödet tar ungefär 7 dagar att slutföra.
Introduction
Att studera hur makromolekyler viks och interagerar med varandra är nyckeln till att förstå genreglering i cellen. Medan mycket arbete har fokuserats under det senaste decenniet om att förstå hur DNA och proteiner bidrar till genreglering, är relativt mindre känt om post-transkriptionell reglering av genuttryck. RNA bär information i både sin linjära sekvens och i dess sekundära och tertiära struktur 1 . Dess förmåga att basera paret med sig själv och med andra är viktigt för sin funktion in vivo . Nyliga framsteg inom RNA-sekundärstrukturundersökning med hög genomströmning har givit värdefulla insikter i placeringen av dubbel- och enkelsträngade regioner i transkriptomen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer information om parningsparametrarna saknas fortfarande i stor utsträckning. För att bestämma vilken RNA-sekvens som interagerar med en annan RNA-region i transkriptomen behöver vi global parvis information.
Kartläggning av parvisa RNA-interaktioner på ett globalt, opartiskt sätt har traditionellt varit en stor utmaning. Medan tidigare tillvägagångssätt, såsom CLASH 9 , hiCLIP 10 och RAP 11 , används för att identifiera RNA-interaktioner i stor skala, kartlägger dessa tekniker typiskt RNA-basparning för en delmängd av RNA som antingen interagerar med ett visst protein eller RNA-species. Den senaste utvecklingen i studier av globala RNA-interaktioner inkluderar metoden RPL 12 , som inte stabiliserar RNA-interaktioner in vivo och kan därför endast fånga en delmängd av in vivo- interaktioner. För att övervinna dessa utmaningar utvecklade vi och andra genomgående, opartiska strategier för maP RNA-interaktomer in vivo , med användning av modifierade versioner av tvärbindningspsoralen 13 , 14 , 15 . I detta protokoll beskriver vi detaljerna för utförande av S- ekventering av P- soralt tvärbunden, L- igaterad och S valda H ybrids (SPLASH), vilken utnyttjar biotinylerad psoralen för att tvärbinda basparrings-RNA in vivo följt av närliggande ligering och hög genomströmningssekvensering till Identifiera RNA-basparparametrar genomgående ( Figur 1 ) 15 .
I det här manuskriptet beskriver vi stegen för att utföra SPLASH med hjälp av odlade vidhäftande celler, i detta fall HeLa-celler. Samma protokoll kan lätt anpassas till suspensionsdäggdjursceller och till jäst- och bakterieceller. I korthet behandlas HeLa-celler med biotinylerad psoralen och bestrålas vid 365 nm för att tvärbinda interaktiva RNA-baspar in vivo. RNA: erna extraheras sedan från cellerna, fragmenteras och berikas för tvärbindningsregioner med användning av streptavidinpärlor. Interaktiva RNA-fragment ligeras sedan tillsammans med användning av närliggande ligering och gjordes i ett cDNA-bibliotek för djup sekventering. Vid sekvensering mappas de chimära RNA på transcriptomen / genomet för att identifiera de RNA-interagerande regionerna som är parade med varandra. Vi har framgångsrikt utnyttjat SPLASH för att identifiera tusentals RNA-interaktioner in vivo i jäst och olika humana celler, inklusive intramolekylär och intermolekylär RNA-basparning i olika klasser av RNA, såsom snoRNA, lncRNA och mRNA, för att glimta in i strukturorganisationen och interaktionsmönstren Av RNA i cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Behandling av HeLa-celler med biotinylerad psoralen och RNA-extraktion
- Culture HeLa-celler i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovinserum (FBS) och 1% penicillin streptomycin (PS) i en 10 cm-platta.
- Tvätta HeLa-cellerna två gånger med 5 ml 1x PBS. Tappa överskott av PBS helt ur skålen genom att placera skålen vertikalt i 1 min.
- Tillsätt 1 ml PBS innehållande 200 μM biotinylerad psoralen och 0,01% vikt / volym digitonin, till cellerna jämnt och inkubera vid 37 ° C i 5 min. Medan biotinylerad psoralen kan komma in i cellen är dess permeabilitet mycket högre när cellerna exponeras för låga mängder digitonin (0,01%) i 5 min
- Ta av locket på 10 cm-plattan innehållande de behandlade HeLa-cellerna och placera disken platt på is. Bestråla skålen innehållande cellerna med 365 nm UV i 20 minuter på is, på ett avstånd av 3 cm från UV-lamporna, med användning av UV-tvärbindaren.
- Isolera tOtal RNA från HeLa-celler genom guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformutvinning enligt tillverkarens protokoll. Tillsätt 1: 1 volym isopropanol för att fälla ut RNA vid rumstemperatur i 30 min.
Pauspunkt: RNA kan förvaras vid -20 ° C i isopropanol i obestämd tid. En dot blot kan utföras vid detta steg för att kontrollera att biotinylerad psoralen framgångsrikt har gått in i cellerna och har tvärbundna RNA in vivo ( Figur 2 ). - Centrifugera det utfällda RNA vid 20 000 xg under 30 min vid 4 ° C för att återvinna RNA. Ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml 70% kall etanol till RNA-pelleten för att tvätta RNA.
- Centrifugera proverna vid 20 000 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten och lufttorka pelleten i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt nukleasfritt vatten till RNA-pelleten och kvantifiera koncentrationen av RNA med användning av UV-spektrometer.
Pauspunkt: RNA kan lagras vid -80 ° C efter fLash frysning i flytande kväve.
2. RNA-fragmentering
- Förvärmning 15 μL 2x RNA-fragmenteringsbuffert och 10 | il av RNA-provet (1 | ig / | il) individuellt i 0,2 ml PCR-rör vid 95 ° C i 1 min. Blanda 10 | il av den uppvärmda 2x RNA-fragmenteringsbufferten med 10 | il RNA-prov genom pipettering upp och ner. Inkubera provet vid 95 ° C i 5 min. Stoppa reaktionen genom att snabba kylningen av reaktionen på is.
- Överför och pool de 2 fragmenteringsreaktionerna till ett 1,5 ml microfuge-rör. Tillsätt 40 μl nukleasfritt vatten till reaktionen, 10 | il 3 M natriumacetat, 1 | il glykogen och 300 | il 100% etanol till fragmenteringsreaktionen. Inkubera RNA vid -20 ° C i minst 1 h för utfällning av RNA.
- Centrifugera det utfällda RNA vid 20 000 xg under 30 min, avlägsna supernatanten och tvätta RNA med användning av 1 ml 70% etanol.
- Centrifugera RNA vid 20 000 xg i 15 min, remÖver supernatanten och lösa upp RNA i 20 pl nukleasfritt vatten.
3. RNA-storlek och eluering
- Tillsätt 20 μl RNA-laddningsfärg till det utvunna RNA i mikrovågsröret. Värm RNA med RNA-laddningsfärgen vid 95 ° C under 3 minuter och lägg den på is under 2 minuter.
- Tillsätt 3 μL RNA-laddningsfärg till 0,25 μL 10 nt DNA-stege i ett mikrofugrör. Värm stegen vid 95 ° C i 3 minuter och lägg den på is i 2 minuter.
- Ladda den denaturerade stegen och prov på en 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel och storleken fraktioneras genom elektrofores i 40 minuter vid 180 V. Stryk gelén i 10 ml TBE-buffert innehållande 1: 10 000 nukleinsyragelfärg för 5 Min i mörkret.
- Punka ett rent 0,6 ml mikrofugrör i botten med en 24 G nål och placera den i ett 2 ml microfuge-rör.
- Visualisera banden på den efterfärgade gelén med hjälp av en transilluminator och skär en gelskiva motsvarande 90-110 nt. Överför gelskivan i det punkterade 0,6 ml mikrofuge-röret i 2 ml mikrofuge-röret. Detta storleksval utförs för att medge att de chimära fragmenten har en minsta längd för att kartlägga till transkriptom och att skilja mellan närliggande ligerade produkter jämfört med oliggjorda produkter i nedströmsstorleksvalsteg.
- Centrifugera gelskivorna vid 12 000 xg vid rumstemperatur i 2 min för att skrapa gelskivan och samla den i 2 ml microfuge-röret. Kassera det tomma 0,6 ml microfuge-röret. Tillsätt 700 μL elueringsbuffert till den strimlade gelskivan i 2 ml mikrofuge-röret och inkubera vid 4 ° C över natten med konstant rotation för att tillåta diffusion av proverna i bufferten.
- Överför gelskivorna och elueringsbufferten till ett centrifugrörfilter och centrifugera vid 20 000 xg under 2 min. Gelskivorna kommer att fångas i det övre facket i filtret. Kassera gelskivorna och det övre facket.
- Tillsätt 1 μl glykogen och 700 | il 100% isopropanol till filtratet i mikrovågsröret och fäll ut RNA vid -20 ° C under minst 1 h eller över natten.
Pauspunkt: RNA kan utfällas i isopropanol i obestämd tid vid -20 ° C. - Centrifugera det utfällda RNA vid 20 000 xg under 30 min vid 4 ° C för att återvinna RNA. Ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml 70% kall etanol för att tvätta RNA-pelleten. Centrifugera den tvättade pelleten vid 20 000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort tvättbufferten och tillsätt 20 μl nukleasfritt vatten för att resuspendera RNA. Kvantifiera koncentrationen av RNA med användning av en UV-spektrometer.
Pauspunkt: RNA kan förvaras vid -80 ° C efter snabbfrysning i flytande kväve.
4. Berikning av RNA-tvärbindningsregioner
- Vortex streptavidin-belagda magnetiska pärlor kraftigt att resuspendera pärlorna homogent i röret. Överför 100 μl pärlor till ett 1,5 ml microfuge-rör och placera det på en magnetIc stå i 1 min för att tillåta pärlorna att hålla fast vid rörets magnetiska sida. Ta bort lagringsbufferten från pärlorna försiktigt och ta röret ur magnetstativet.
- Tillsätt 1 ml Lysis Buffer till pärlorna i mikrovågsslangen och pipett upp och ner. Placera mikrovågens innehållande pärlor på magnetstativet i 1 min för att separera pärlorna från tvättbufferten. Upprepa detta för totalt 3 tvättar.
- Ta bort tvättbufferten från pärlorna genom att placera pärlorna som innehåller mikrovågor på magnetstativet i 1 min. Tillsätt RNase-hämmare (1: 200) till lysbufferten och tillsätt 100 | il lysisbuffert till de tvättade pärlorna i mikrofuktöret.
- Tillsätt 2 ml nyberedd hybridiseringsbuffert, 1 ml kompletterad lysbuffert, 1,5 μg storleksfraktionerad RNA och 100 | il resuspenderade pärlor till ett 15 ml koniskt centrifugrör. Vortex röret försiktigt.
- Inkubera det 15 ml koniska centrifugröret vid 37 ° C i 30 min med änd-ände-rotation.Förvärm tvättvätskan vid 37 ° C.
- Placera 15 ml koniska centrifugrör på ett magnetiskt stativ för 15 ml rör under 2 min för att separera pärlorna från bufferten. Pipettera bufferten försiktigt ut ur röret och kassera det.
- Tillsätt 1 ml förvärmd tvättbuffert till pärlorna, pipett upp och ner och överför pärlorna till ett 1,5 ml mikrofuge-rör. Inkubera vid pärlorna vid 37 ° C i 5 min, med änd-till-ände rotation.
- Centrifugera snabbt innehållet i microfuge-röret. Placera de 1,5 ml tvättade pärlorna i mikrovågsrör på ett magnetiskt stativ för 2 ml rör under 1 min, för att separera pärlorna från tvättbufferten. Ta bort bufferten från pärlorna genom att pipettera bufferten försiktigt ut ur mikrovågsslangen.
- Tillsätt 1 ml förvärmd tvättbuffert till pärlorna och pipett upp och ner för att upprepa tvätten. Utför totalt 5 tvättar. Vid slutet av den 5 : e tvätten, ta bort tvättbufferten genom att placera de mikrofukthaltiga pärlorna på magnetstativet för1 min.
5. Närhetsligering
- Tillsätt 1 ml kall T4-polynukleotidkinas (PNK) -buffert till de tvättade pärlorna och inkubera pärlorna i 5 minuter vid 4 ° C, med rotationsändning mot slutet. Placera mikrovågsröret som innehåller pärlorna på magnetbandet under 1 minut och försiktigt avlägsna T4 PNK-bufferten. Upprepa detta steg för totalt 2 tvättar och ta bort T4 PNK-bufferten efter den sista tvätten.
- Tillsätt buffertar till pärlorna, enligt tabell 1 . För att aktivera 3'-ändarna av RNA-fragmentet att ligeras till 3'-adaptrar nedan inkubera pärlorna i bufferten vid 37 ° C i 4 h med konstant omrörning för att omvandla den 3'-cykliska fosfatgruppen i slutet av RNA till 3 'OH.
- Tillsätt buffertar till den tidigare reaktionen, enligt tabell 2 . För att möjliggöra 5'-änden av RNA-fragmenten att vara ligeringskompetent inkubera reaktionen vid 37 ° C i 1 timme med konstant omröring i närvaro av ATP, För att omvandla 5'OH på RNA till 5'-fosfat.
- Tillsätt buffert till föregående reaktion för att utföra närliggande ligering, enligt tabell 3 . Inkubera reaktionen vid 16 ° C i 16 h, med konstant omröring,
- Placera mikrofugen som innehåller det ligerade RNA på en magnetstativ i 1 min. Ta bort supernatanten försiktigt och tillsätt 1 ml rumstemperatur tvättbuffert till pärlorna. Resuspenderas genom pipettering upp och ner.
- Placera mikrovågsröret på magnetstativet i 1 min och ta bort tvättbufferten försiktigt. Utför totalt 2 tvättar och ta bort tvättbufferten från pärlorna i slutet av den andra tvätten.
- Tillsätt 100 μl RNA PK-buffert till pärlorna och resuspendera genom pipettering upp och ner. Värm proverna vid 95 ° C i 10 minuter på ett värmeblock.
- Kyl provet på is i 1 minut och tillsätt 500 μL guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform till provet. Blanda genom vortexing kraftigt i 10 s. Inkubera blandningarnaRe vid rumstemperatur i 10 min.
Pauspunkt: RNA kan lagras i guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform vid -80 ° C under några månader. - Tillsätt 100 μL kloroform till guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform extraherade prover. Vortex kraftigt i 10 s. Centrifugera proverna vid 20 000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
- Överför 400 μL av det vattenhaltiga skiktet till ett nytt 1,5 ml mikrofuge-rör. Tillsätt 800 μL (2 volymer) 100% etanol och blanda genom pipettering upp och ner.
- Överför RNA-lösningen till RNA-rengöringskolumner och återställ RNA enligt tillverkarens instruktioner, så att även små RNA hålls kvar. Eluta RNA i 100 μl nukleasfritt vatten.
Pauspunkt: RNA kan förvaras vid -80 ° C efter snabbfrysning i flytande kväve.
6. Omvänd tvärbindning av biotinylerad psoralen
- Överför 100 μL av de eluerade proven till en brunn i en 24-brunnsplåt. Ta bort locket och bestråla provet under UV 254 nm, i 5 minuter på is.
- Överför det omvända tvärbundna provet till ett rent microfuge-rör. Tillsätt 10 μl natriumacetat, 1 μl glykogen och 300 μl 100% etanol och fäll ut RNA vid -20 ° C under minst 1 h eller över natten.
Pauspunkt: RNA kan utfällas i etanol i obestämd tid vid -20 ° C. - Centrifugera det utfällda RNA vid 20 000 xg under 30 min vid 4 ° C för att återvinna RNA. Ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml 70% kall etanol för att tvätta RNA-pelleten.
- Centrifugera den tvättade pelleten vid 20 000 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Ta bort tvättbufferten och tillsätt 4,25 μL nukleasfritt vatten för att resuspendera RNA. Överför RNA till ett 0,2 ml PCR-rör.
Pauspunkt: RNA kan förvaras vid -80 ° C efter snabbfrysning i flytande kväve.
7. Omvänd transkription och cDNA-cirkulärisering
- Tillsätt 0,75 plAv RNA-länkare (0,5 pg / pi) till det resuspenderade provet i PCR-röret och värm vid 80 ° C under 90 s. Placera provet på is i 2 minuter.
- Tillsätt buffertarna till det denaturerade provet för 3'-adapterligering, enligt tabell 4 . Inkubera reaktionen vid 25 ° C under 2,5 timmar.
- Överför reaktionen till ett 1,5 ml microfuge-rör. Tillsätt 90 μl nukleasfritt vatten till reaktionen följt av 10 | il natriumacetat, 1 | il glykogen och 300 | il 100% etanol. Precipitera RNA vid -20 ° C under minst 1 h eller över natten.
Pauspunkt: RNA kan utfällas i etanol i obestämd tid vid -20 ° C. - Centrifugera det utfällda RNA vid 20 000 xg under 30 min vid 4 ° C för att återvinna RNA. Ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml 70% kall etanol för att tvätta RNA-pelleten.
- Centrifugera den tvättade pelleten vid 20 000 g under 15 minuter vid 4 ° C. Ta bort tvättbufferten resuspendera pelleten i 5 | il nukleasfri water.
- Tillsätt 5 μl RNA-laddningsfärg till det utvunna RNA i mikrofuktöret. Värm RNA med RNA-laddningsfärgen vid 95 ° C under 3 minuter och lägg den på is under 2 minuter.
- Tillsätt 3 μL RNA-laddningsfärg till 0,25 μL 10 nt DNA-stege i ett mikrofugrör. Värm stegen vid 95 ° C i 3 minuter och lägg den på is i 2 minuter.
- Utför storleksfraktionering med 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel som i steg 3.3 och 3.4.
- Visualisera gelén färgad med nukleinsyra fläck med användning av transilluminator och skära en gelskiva motsvarande 110-140 nt på stegen. Överför gelskivan i det punkterade 0,6 ml microfuge-röret i 2 ml microfuge-röret och följ protokollet från steg 3.6 - 3.9.
- Tillsätt 5 μL nukleasfritt vatten för att resuspendera RNA-pelleten. Överför RNA till ett 0,2 ml PCR-rör.
Pauspunkt: RNA kan förvaras vid -80 ° C efter snabbfrysning i flytande kväve. - Tillsätt 1 μl RT-primer vid 1,2581; M till RNA i PCR-röret och värma vid 80 ° C i 2 min. Placera provet på is i 2 minuter.
- Tillsätt buffertarna för omvänd transkription enligt tabell 5 . Inkubera reaktionen vid 50 ° C under 30 minuter.
- Tillsätt 1,1 μL 1 N NaOH till reaktionen och värm vid 98 ° C under 20 minuter. Placera reaktionen på is.
- Överför reaktionen till ett 1,5 ml microfuge-rör. Tillsätt 90 μl nukleasfritt vatten till reaktionen följt av 10 | il natriumacetat, 1 | il glykogen och 300 | il 100% etanol. Precipitera DNA vid -20 ° C under minst 1 h eller över natten.
Pauspunkt: DNA kan utfällas i etanol i obestämd tid vid -20 ° C. - Centrifugera det utfällda DNA vid 20 000 g under 30 minuter vid 4 ° C för att återvinna DNA. Ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml 70% kall etanol för att tvätta DNA-pelleten. Centrifugera den tvättade pelleten vid 20 000 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Ta bort tvättbufferten resuspendera pelSläpp 5 μL nukleasfritt vatten.
- Utför storleksfraktionering med 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel som i steg 3.3 och 3.4.
- Visualisera den efterfärgade gelén med hjälp av transilluminator och skär en gelskiva motsvarande 200-240 nt på stegen. Det omvänd transkriberade cDNA är nu 96 baser längre än RNA-fragmentet på grund av tillsatsen av 96-bas RT-primeren. Överför gelskivan i det punkterade 0,6 ml mikrofuge-röret i 2 ml mikrofuge-röret.
- Centrifugera gelskivorna vid 12 000 xg vid rumstemperatur i 2 min för att skrapa gelskivan och samla den i 2 ml microfuge-röret. Kassera det tomma 0,6 ml microfuge-röret.
- Tillsätt 700 μL elueringsbuffert till den strimlade gelskivan i 2 ml mikrofuge-röret och inkubera vid 37 ° C under 2 timmar med konstant rotation. Följ protokollet enligt beskrivningen i steg 3.7-3.8.
- Tillsätt 6 μL nukleasfritt vatten för att resuspendera DNA-pelleten. Överför DNA: t till ett 0,2 ml PCR-rör.
- Tillsätt buffertarna till reaktionen för cDNA-cirkularisering, enligt tabell 6 . Inkubera reaktionen vid 60 ° C under 1 h och värm vid 80 ° C i 10 min för att inaktivera reaktionen.
- Överför reaktionen till ett 1,5 ml microfuge-rör. Rening av cirkuläriserad cDNA med hjälp av en DNA-rengöringskolonn enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt 20 μl nukleasfritt vatten till kolonnen för att eluera det renade cDNA.
Pauspunkt: DNA kan lagras vid -20 ° C under några månader.
8. PCR-amplifiering (Small Scale PCR)
- Tillsätt buffertarna till reaktionen enligt Tabell 7 för PCR-amplifiering för att testa det minsta antalet cykler som behövs för bibliotekets amplifiering.
- Ställ in PCR-cykelförhållandena enligt tabell 8 . Pausera reaktionen och överför 5 μL avPCR-reaktionen vid 10, 15 och 20 cykler, i separata 1,5 ml mikrofuge-rör.
- Tillsätt 1 μl 6x DNA geladdladdningsfärg till var och en av 5 μl PCR-reaktionen vid de olika cyklerna. Utför gelelektrofores på en 3% agarosgel, vid 120 V, under 1 h för att visualisera PCR-produkterna.
- Använd det lägsta antalet PCR-cykler (Y) som visar amplifiering vid cirka 250 baser (I Figur 3 finns ett starkt band vid 15 cykler av amplifiering och ett svagt band vid 10 cykler. 12 cykler med storskalig PCR-amplifiering är sannolikt att Generera tillräckligt material för djup sekvensering, eftersom mängden cDNA som användes är 10 gånger så liten som PCR-amplifiering med liten skala).
9. PCR Amplification (Large Scale PCR) och rening
- Tillsätt buffertarna till reaktionen enligt tabell 9 för PCR-amplifiering för storskalig PCR.
- Ställ in PCR-cykelförhållandena enligtTabell 10 .
- Tillsätt 5 μL 6x DNA geladdladdningsfärg till 25 μl PCR-reaktion och laddas i en brunn i en 3% agarosgel. Ladda 1 kb plus DNA-stege i en separat brunn. Utför gelelektrofores vid 100 V, i 1,5 h.
- Visualisera den färdiga gelén med en UV-transilluminator.
- Storlek extrahera en gelskiva som innehåller PCR-produkter från 200 till 300 baser och överföra gelén till ett rent 2 ml mikrofuge-rör.
- Tillsätt 1 ml gellöslighetsbuffert, från ett DNA-gelutsugningskit, till gelskivan och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter eller tills gelén löser upp med konstant omröring.
- Tillsätt 200 μl isopropanol till den upplösta gelen och blanda väl genom pipettering. Överför 700 μL av provet till en DNA-extraktionsreningskolonn och centrifugera vid 13 000 xg under 30 s. Fortsätt att överföra det upplösta provet till kolonnen tills hela provet har laddats på kolonnen.
- Tillsätt 500 μl gellöslighetsbuffert,Följt av 700 pl kolonn tvättbuffert, till kolonnen, enligt tillverkarens protokoll. Tillsätt 12 μL nukleasfritt vatten till mitten av kolonnen för att eliminera DNA. Pauspunkt: DNA kan lagras vid -20 ° C.
- Kvantifiera koncentrationen av DNA med användning av fluorometrisk kvantifiering. Om flera bibliotek skapas och sammanfogas för sekvensering, lägg till lika mängd av varje prov till poolen för sekvensering med hög genomströmning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar schematisk av SPLASH-arbetsflödet. Vid tillsats av biotinylerad psoralen i närvaro av 0,01% digitonin och UV-tvärbindning extraheras totalt RNA från cellerna och en punktfläck utförs för att säkerställa att tvärbindning av biotinylerad till RNA har skett effektivt ( Figur 2 ). Vi använder biotinylerade 20 basoligoser som positiva kontroller för att titrera mängden biotinylerad psoralen som skall sättas till cellerna, så att ungefär 1 av var 150-baserna är tvärbundna.
Eftersom fler PCR-dupliceringshändelser tenderar att inträffa med ökade PCR-amplifieringscykler utför vi en liten skala PCR-amplifiering med olika PCR-cykler för att bestämma det lägsta antalet amplifieringscykler som kommer att tillhandahålla tillräckligt material för djup sekvensering. I ett effektivt bibliotekspreparat är viKunna förstärka ett cDNA-sekvenseringsbibliotek från en 1,5 μg storleksval vald RNA-ingång på mindre än 15 cykler av PCR-amplifiering ( Figur 3 ). Biblioteket sekvenseras sedan med användning av 2x 150 baspar läser på en hög genomströmnings-sekvenseringsmaskin och sekvenseringsläsningarna behandlas sedan i enlighet med beräkningsrörledningen i figur 4 . Slutresultatet är en lista över filtrerade chimära interaktioner som innefattar både intramolekylära och intermolekylära RNA-RNA-interaktioner i transkriptomen ( tabell 11 ).
Figur 1 : Schematisk av det experimentella arbetsflödet för SPLASH 15 . Parvisa RNA-interaktioner inuti cellen tvärbunden med användning av biotinylerad psoralen under UV-ljus vid 365 nm. Tvärbunden RNA är thEn extraherad och fragmenterad till omkring 100 baser. Interaktionsregioner som innehåller de biotinylerade psoralen-tvärbindningarna berikas genom bindning till streptavidinpärlor och ligeras tillsammans. Vid omvänt tvärbindning under UV-ljus vid 265 nm klonas de chimära RNA sedan i ett cDNA-bibliotek för djup sekventering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Testning av biotinylerad tvärbindnings-effektivitet med punktsprutning 15 . Dot blot av biotinylerad psoralen tvärbunden RNA in vivo i närvaro av 1% digitonin. Olika koncentrationer av tvärbunden RNA (20-2000 ng) ses på membranet. Olika koncentrationer av biotinylerad 20 basOligo ses som positiva kontroller. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förstoring av småskaliga bibliotek för SPLASH. 1 jil cDNA från RT-reaktionen användes för PCR med liten skala. Reaktioner tas ut vid 10, 15 och 20 cykler och körs på en 3% agarosgel för att bestämma det minsta antalet amplifieringscykler som krävs för att generera bibliotek. I detta specifika exempel kommer 10 cykler av amplifiering med användning av 10 | il av cDNA i en storskalig PCR-reaktion att generera tillräckliga amplikoner för djup sekventering.
| Reagens | Volym (μL) | Slutlig |
| Nukleasfritt vatten | 64 | |
| 10x T4 PNK-buffert | 8 | 1x |
| Rnase-inhibitor (20 U / μl) | 4 | 1 U / μl |
| T4 PNK (10 U / jil) | 4 | 0,5 U / μl |
| Total | 80 |
Tabell 1: Reagenser för 3'-ändreparation.
| Reagens | Volym (μL) | Slutlig |
| PNK-reaktion | 80 | |
| Nukleasfritt vatten | 3 | |
| 10x T4 PNK-buffert | 2 | 1x |
| 10 mM ATP | 10 | 1 mM |
| T4 PNK (10 U / jil) | 5 | 0,5 U / μl |
| Total | 100 |
Tabell 2: Reagenser för 5'-ändreparation.
| Reagens | Volym (μL) | Slutlig |
| PNK-reaktion | 100 | |
| 10x T4-RNA-ligasbuffert | 6 | 1x |
| 10 mM ATP | 6 | 1 mM |
| Rnase-hämmare (20 U / μl) | 4 | 0,5 U / μl |
| T4 Rnl1 (10 U / μl) | 40 | 2,5 U / μl |
| Nukleas freE vatten | 4 | |
| Total | 160 |
Tabell 3: Reagenser för närhetligering.
| Komponent | Mängd per reaktion (μL) | Slutlig |
| RNA och linker | 5 | |
| T4Rnl2-buffert (10x) | 1 | 1x |
| PEG 8000 (50%, vikt / volym) | 3 | 15% (vikt / volym) |
| Rnase-hämmare (20 U / μl) | 0,5 | 1 U / μl |
| T4Rnl2 (tr) (200U / | il) | 0,5 | 10 U / μ; L |
| Total | 10 |
Tabell 4: Reagenser för adapterligering.
| Komponent | Mängd per reaktion (μL) | Slutlig |
| Ligation och primer | 6 | |
| Första strängbufferten (5x) | 2 | 1x |
| DNTPs (10 mM) | 0,5 | 0,5 mM |
| DTT (0,1 M) | 0,5 | 5 mM |
| Rnase-hämmare (20 U / μl) | 0,5 | 1 U / μl |
| Omvänd transkriptas (200 U / μl) | 0,5 | 10 U / μl |
| Total | 10 |
Tabell 5: Reagenser för revers transkription.
| Komponent | Mängd per reaktion (μL) | Slutlig |
| Första sträng-cDNA | 6 | |
| Enstring-DNA-ligasbuffert (10x) | 1 | 1x |
| Betain (5 M) | 2 | 1 M |
| MnCl2 (50 mM) | 0,5 | 2,5 mM |
| Enstring-DNA-ligas (100U / μl) | 0,5 | 5U / ^ il |
| Total | 10 |
Tabell 6: Reagens för cirkulärisering av cDNA.
| Komponent | Mängd per reaktion (μL) | Slutlig |
| Ligerad DNA-produkt | 1 | |
| Nukleasfri vatten | 10,5 | |
| High-Fidelity DNA-polymeras 2x masterblandning | 12,5 | 1x |
| Universal PCR-primer (10 | im) | 0,5 | 0,02 | im |
| Index (X) Primer (10 ^ M) | 0,5 | 0,02 | im |
| Total | 25 |
Tabell 7: Reagenser som används för PCR med liten skala.
| Steg | Temperatur | Tid | Cycles |
| Initial denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| denaturering | 98 ° C | 10 s | |
| glödgning | 65 ° C | 30 s | 25 |
| Förlängning | 72 ° C | 30 s | |
| Slutlig förlängning | 72 ° C | 5 min | |
| Håll | 4 ° C | ∞ |
Tabell 8: Villkor som används för småskaliga PCR.
| Komponent | Mängd per reaktion (μL) | Slutlig |
| Ligerad DNA-produkt | 5 | |
| Nukleasfri vatten | 6,5 | |
| High-Fidelity DNA-polymeras 2x masterblandning | 12,5 | 1x |
| Universal PCR-primer (10 | im) | 0,5 | 0,02 | im |
| Index (X) Primer (10 ^ M) | 0,5 | 0,02 | im |
| Total | 25 |
Tabell 9: Reagenser som används för PCR med stor skala.
| Steg | Temperatur | Tid | Cycles |
| Initial denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| denaturering | 98 ° C | 10 s | |
| glödgning | 65 ° C | 30 s | Y |
| Förlängning | 72 ° C | 30 s | |
| Slutlig förlängning | 72 ° C | 5 min | |
| Håll | 4 ° C | ∞ |
Tabell 10: Villkor som används för storskalig PCR.
Tabell 11: Analysutmatning av beräkningsrörledningen. "SAM-flaggsplitsläsning 1" = 0 indikerar att läsningen är mappad till transkriptoms positiva sträng. "RNA 1-identitet" avser identiteten av RNA till vänster om chimären. "RNA 1 startposition" hänvisar till startpositionen som läsningen är mappad längs RNA 1. "RNA 1-slutposition" avser slutetpositionen till vilken läsningen är mappad längs RNA 1. "Mappningspoängsavläsning 1" hänvisar till Till kartläggningsresultatet för läsningen som var mappad till RNA 1. "Cigar split split 1"Anger antalet baser som klippts från läsningen "S" och antalet baser som var mappade till läsningen "M". "Split read 1" indikerar den sekvens som var mappad till RNA 1. Samma nomenklatur användes till höger om chimären, som heter RNA 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi i detalj det experimentella och beräknade arbetsflödet för SPLASH, en metod som gör det möjligt för oss att identifiera parvisa RNA-interaktioner på ett genomgående sätt. Vi har framgångsrikt utnyttjat SPLASH i bakteriella, jäst- och mänskliga kulturer och förutse att strategin kan tillämpas allmänt på olika organismer under olika cellulära tillstånd. Ett av de kritiska stegen i protokollet är att börja med minst 20 | jg tvärbunden RNA för att ha tillräckligt material för nedströms processer. RNA fragmentas sedan till 100 baser och PAGE-storlek väljs. Dessa steg är viktiga för att vi företrädesvis beriker för ligerade kimärer, snarare än monomerer under bibliotekets generationsprocess. Vi återhämtar vanligen omkring 1,5 μg RNA efter fragmentering och det första storleksvalet, och RNA omvandlas sedan till ett cDNA-bibliotek enligt SPLASH-arbetsflödet. Vi finner att denna mängd start RNA tillåter oss att generera tillräckligt material för hIgh-genomströmningssekvensering med mindre än 15 cykler av PCR-amplifiering. Eftersom antalet PCR-dupliceringshändelser ökar dramatiskt med ökade PCR-cykler, är det viktigt att hålla antalet amplifieringscykler låga för att kunna extrahera användbara och unika chimärer i nedströmsanalysen.
I motsats till de andra genom-breda psoralenbaserade strategierna använder SPLASH en biotinylerad version av psoralen för att tvärbinda basparade RNA-fragment till varandra. Eftersom vi titrerade mängden tvärbindning till ungefär en tvärbindning per hundra och femtio baser kan vi berika för tvärbundna RNA-regioner genom att använda streptavidinpärlor efter RNA-fragmentering. Vidare tillåter utövande av enzymatiska reaktioner medan RNA-bindningarna är bundna på pärlor också att vi utför buffertbyten och tvättar bekvämt. En av begränsningarna i strategin är emellertid att biotinylerad psoralen är mindre effektiv vid penetrering i celler än psoralen eller 4'-aminometyltri-triOxsalen (AMT). Som sådan är det kritiskt att säkerställa att biotinylerad psoralen har gått in i cellerna och tvärbundet effektivt med RNA. Vi utför rutinmässigt prickfläckar på tvärbundna, extraherade RNA, tillsammans med biotinylerade oligos som positiva kontroller, för att säkerställa att våra RNA är ordentligt tvärbundna. I händelse av att tvärbindning är svag kan strategier för permeering av det cellulära membranet, såsom att lägga till låga koncentrationer av digitonin (till 0,01%) under 5 min, användas för att tillåta biotinylerad psoralen att effektivt komma in i cellerna. Eftersom psoralen absorberar vid samma våglängd som nukleinsyror (UV 260 nm) använder vi vanligtvis fluorometriska kvantifieringssystem, snarare än UV-absorption för kvantifiering av tvärbundna RNA.
En begränsning av psoralenbaserade tvärbindningsstrategier är att psoralen företrädesvis tvärbindar vid uridiner (U). Som sådan kan basparringsregioner som är U fattiga missas under tvärbindning. Följaktligen under detektering av en tvärbindningshändelse bMellan två strängar ger bevis för att en interaktion uppträder, motsvarar en brist på tvärbindning inte en brist på interaktion. I vårt SPLASH-protokoll tar vi väldigt lite mikroRNA-mRNA-interaktioner och låga mängder av lncRNA-interaktioner. Eftersom mikroRNA-bundna mRNA sannolikt kommer nedregleras i genuttryck och lncRNAs typiskt är lågt uttryckta, är deras dåliga representation i våra data främst beroende på otillräckligt sekvenseringsdjup. Vi typiskt sekvens läser minst 200 miljoner parade ändar per humant transkriptombibliotek för varje replikat. På detta djup läser de flesta av våra sekvenser fall på ganska rikliga RNA. Vi förutser att användningen av anrikningsstrategier för specifika populationer av RNA-signaler avsevärt ökar signalen för dessa relativt låga rikliga RNA. En annan utmaning som vi observerade vid analys av chimär data är att skilja mellan sanna interagerande chimära händelser kontra kimärer som genereras av splitsning. Förhindra förorening oF splitsning läser i vår chimära lista, filtrerar vi bort alla läser som ligger nära kända antecknade splitsningsställen i transkriptomen. Vi förväntar oss att med slutligare splitsningsannotationer blir den slutliga listan över chimärer ännu mer exakta.
Olika från tidigare strategier som fokuserade på RNA-interaktioner som är specifika för en enda RNA-art eller ett enda RNA-bindande protein, möjliggör SPLASHs förmåga att kartlägga RNA-RNA-interaktioner på ett genomväxande sätt för alla RNA, att vi kan studera storskaligt RNA Interaktionsnät och för första gången identifiera nya intramolekylära och intermolekylära RNA-interaktioner. Med hjälp av SPLASH erhöll vi tusentals intramolekylära och intermolekylära interaktioner i humant och jäst-transkriptomerna, vilket möjliggör oss att se på organisationen och dynamiken hos RNA-interaktionen in vivo . Förskott att integrera denna långdistans RNA-interaktionsdata i RNA-strukturmodelleringsalgoritmer är sannolikt attFörfina våra nuvarande modeller av RNA-organisation in vivo . Att integrera SPLASH i intermolekylära RNA-prediktionsalgoritmer, såsom snoRNA-prediktionsprogram, kan också förbättra noggrannheten av dessa förutsägelser. Vi förutser att framtida användningar av SPLASH på andra komplexa organismer och dynamiska system kommer att fortsätta att kasta ljuset på invecklingarna av RNA-baserad genreglering i biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmarna av Wan Lab och Nagarajan Lab för informativa diskussioner. N.Nagarajan stöds av finansiering från A * STAR. Y.Wan stöds av finansiering från A * STAR och Society i Science-Branco Weiss Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20% SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2x RNA fragmentation buffer | |||
| 18 mM MgCl2 | |||
| 450 mM KCl | |||
| 300 mM Tris-Cl pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC |
|||
| RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
|||
References
- Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
- Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
- Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
- Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
- Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
- Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
- Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
- Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
- Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).
