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Genetics

वैश्विक बायोटिनिलेटेड Psoralen का उपयोग आरएनए-आरएनए अंतरण मैपिंग

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55255
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

Summary

यहां, हम एस की विधि एस एसरेलन क्रॉस्लेन्क्क्ड, एल इगेटिड, और एस चुने हुए एचबीबीडीएस (एसपीएलएचएच) की पहचान करते हैं, जो विवो में इंट्रामोलेक्यूलर और इंटरमॉलिक्युलर आरएनए-आरएनए इंटरैक्शन के जीनोम-विस्तृत मानचित्रण को सक्षम बनाता है। खमीर, बैक्टीरिया और मनुष्यों सहित जीवों के आरएनए इंटरएक्टॉम के अध्ययन के लिए स्पलाश लागू किया जा सकता है।

Abstract

जानने के लिए कि आरएनए स्वयं के साथ कैसे बातचीत करते हैं और दूसरों के साथ सेल में आरएनए आधारित जीन विनियमन को समझने की कुंजी है। आरएनए-आरएनए बातचीत के उदाहरणों में जैसे माइक्रोआरएनए-एमआरएनए बातचीत जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए दिखायी गई है, सेल में आरएनए की बातचीत पूरी तरह से पता नहीं है, अभी भी अज्ञात है। आरएनए की बातचीत का अध्ययन करने के लिए पूर्व विधियां मुख्य रूप से आरएनए के उपसंकल्प पर केंद्रित होती हैं जो एक विशेष प्रोटीन या आरएनए प्रजातियों के साथ बातचीत कर रहे हैं। यहां, हम एस के नाम से एक विधि का विस्तार करते हैं जिसमें पी सोरेलन क्रॉस्लेन्क्क्ड, एल इगेटेड, और एस चुने गए एचबीबीडीएस (एसपीएलएएसएच) की पहचान होती है जो एक निष्पक्ष तरीके से जीवाणु-व्यापक आरएनए बातचीत में विवो में कब्जा करने की अनुमति देता है। स्प्रैश ने विश्व स्तर पर इंट्रामोलेक्युलर और इंटरमॉलिक्युलर आरएनए बेस-पेयरिंग साझीदारों की पहचान करने के लिए विवो क्रॉस्लिंकिंग, निकटता लगीकरण, और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण का इस्तेमाल किया है। स्प्लेस को जीवाणु, खमीर और मानव कोशिकाओं सहित विभिन्न जीवों पर भी लागू किया जा सकता हैविभिन्न सेलुलर संदर्भों के तहत आरएनए संगठन की गतिशीलता की समझ को सुविधाजनक बनाने के लिए विविध सेलुलर स्थितियां हैं। पूरे प्रायोगिक SPLASH प्रोटोकॉल को पूरा करने में लगभग 5 दिन लगते हैं और कम्प्यूटेशनल वर्कफ़्लो को पूरा होने में लगभग 7 दिन लगते हैं।

Introduction

सेल में जीन विनियमन को समझने की कुंजी है कि कैसे अणुओं को गुना और एक-दूसरे के साथ बातचीत करना महत्वपूर्ण है। डीएनए और प्रोटीन जीन विनियमन में कैसे योगदान करते हैं, यह समझने के लिए पिछले दशक में बहुत प्रयास किया गया है, अपेक्षाकृत कम जीन अभिव्यक्ति के बाद ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के बारे में जाना जाता है। आरएनए अपने रेखीय अनुक्रम और उसकी माध्यमिक और तृतीयक संरचना 1 दोनों में जानकारी रखती है। विवो में अपने कार्य के लिए अपने साथ और अन्य लोगों के साथ अपनी जोड़ी बनाने की क्षमता महत्वपूर्ण है हाई थ्रूपुट आरएनए माध्यमिक संरचना की जांच में हालिया अग्रिमों ने प्रतिलिपि 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , हॉवे में डबल और एकल फंसे क्षेत्रों के स्थानों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है।पेयरिंग इंटरेक्शन पार्टनर पर सूचनाएं अभी भी काफी हद तक गायब हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि ट्रांसनाइम में एक अन्य आरएनए क्षेत्र के साथ आरएनए अनुक्रम क्या कर रहा है, हमें वैश्विक जोड़ी-वार जानकारी की आवश्यकता है

वैश्विक, निष्पक्ष तरीके से जोड़-वार आरएनए बातचीत का मिलान पारंपरिक रूप से एक बड़ी चुनौती है। जबकि पिछले दृष्टिकोण, जैसे कि 9 9 एचएसीएलआईपी 10 और आरएपी 11 , बड़े पैमाने पर आरएनए बातचीत की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है, ये तकनीक आम तौर पर आरएनए के एक सबसेट के लिए आरएनए बेस जोड़ी का नक्शा करते हैं जो किसी विशेष प्रोटीन या आरएनए प्रजातियों के साथ बातचीत करते हैं। वैश्विक आरएनए बातचीत के अध्ययन में हाल के घटनाक्रम में आरपीएल 12 का तरीका शामिल है, जो कि विवो में आरएनए बातचीत को स्थिर नहीं करता है और इसलिए केवल विवो बातचीत में इसका एक सबसेट कैप्चर कर सकता है। इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए, हम और दूसरों ने जी के लिए जीनोम चौड़ा, निष्पक्ष रणनीति विकसित कीक्रॉस्लेंकर psoralen 13 , 14 , 15 के संशोधित संस्करणों का उपयोग करते हुए विवो में पी आरएनए इंटरएक्टॉम। इस प्रोटोकॉल में, हम पी सोरेलन क्रॉस्लेंक्क्ड, एल इगेटेड, और एस चुने हुए एचबीबीडीएस (एसपीएलएएसएच) के एस के समेकन करने के विवरण का वर्णन करते हैं, जो बायोटीनिलेटेड सोरेलन का उपयोग विवो में बेस युग्मन आरएनए को क्रॉसलिंक करने के लिए करता है, इसके बाद निकटता लगीकरण और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण आरएनए आधार-जोड़ीदार भागीदारों जीनोम चौड़ा ( चित्रा 1 ) 15 की पहचान

इस पांडुलिपि में, हम सभ्य पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग करके SPLASH करने के चरणों का वर्णन करते हैं, इस स्थिति में हेला कोशिकाएं वही प्रोटोकॉल आसानी से निलंबन स्तनधारी कोशिकाओं और खमीर और बैक्टीरिया कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। संक्षेप में, हेला कोशिकाओं को बायोटिनिलेटेड psoralen के साथ व्यवहार किया जाता है और 365 एनएम पर विकिरणित किया जाता है ताकि विवो में आरएनए आधार जोड़े में बातचीत कर सकें।। तब आरएनए को कोशिकाओं से निकाला जाता है, स्ट्रेप्टिविडिन मोती का उपयोग करके क्रॉस्लेन्किंग क्षेत्र के लिए विखंडित और समृद्ध। आरएनए के टुकड़े परस्पर संबंधों को निकटता के बंधन का उपयोग करके एक साथ ligated और गहरी अनुक्रमण के लिए एक सीडीएनए पुस्तकालय में बनाया है। अनुक्रमित होने पर, चिरात्मक आरएनए को ट्रांस्क्रिप्टम / जीनोम पर मैप किए जाते हैं जो आरएनए इंटरैक्टिंग क्षेत्रों की पहचान करते हैं जो एक दूसरे के लिए बनती हैं हम स्ट्रॉश का उपयोग सफलतापूर्वक उपयोग किया है जिसमें आरआईए के विभिन्न वर्गों जैसे स्नोआरएनए, एलएनसीआरएनए और एमआरएनए जैसे इंट्रामोलेक्यूलर और इंटरमॉलिक्यूलर आरएनए बेस जोड़ी सहित खमीर और विभिन्न मानव कोशिकाओं में विवो में आरएनए के हजारों की बातचीत का पता लगाया गया है, ताकि संरचनात्मक संगठन और इंटरैक्शन पैटर्न की झलक मिल सके। सेल में आरएनए का

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Protocol

1. Biotinylated Psoralen और आरएनए निष्कर्षण के साथ हेला कोशिकाओं का उपचार

  1. दल्बेेको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पीएस) के साथ संस्कृतियों में हेला कोशिकाएं 10 सेमी प्लेट में
  2. हेला कोशिकाओं को 5 एमएल 1x पीबीएस के साथ दो बार धो लें पकवान से 1 मिनट के लिए खड़ी रखकर अतिरिक्त पीबीएस को निकालें।
  3. 1 एमएल की पीबीएस युक्त 200 माइक्रोन बायोटिनिलेटेड सोरेलन और 0.01% वाइड / डी डिजिटोनिन युक्त कोशिकाओं को समान रूप से और 5 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। जबकि बायोटिनिलाटेड psoralen कोशिका में प्रवेश कर सकता है, इसकी पारगम्यता अधिक होती है, जब कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए डिजीटीनिन (0.01%) की कम मात्रा में अवगत कराया जाता है
  4. उपचारित हेला कोशिकाओं युक्त 10 सेमी की थाली के ढक्कन को निकालें और बर्फ पर डिश फ्लैट रखो। यूवी ब्रॉल्स से 3 सेमी की दूरी पर, यूवी क्रॉस्लिंकर का उपयोग करते हुए, बर्फ पर 20 मिनट के लिए 365 एनएम यूवी के साथ कोशिकाओं को युक्त डिशेट बनाना।
  5. टी अलगनिर्माता के प्रोटोकॉल के बाद ग्नाइडीनियम थियोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा हेला कोशिकाओं से ओटल आरएनए। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शाही सेना के वेग को दूर करने के लिए आइसोप्रॉनॉल का 1: 1 मात्रा जोड़ें
    पॉज़ प्वाइंट: आरएएन को -20 डिग्री सेल्सियस में आइसोपोपार्नोल में अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है। यह जांचने के लिए कि इस बायोटिनिलेटेड psoralen ने कोशिकाओं में सफलतापूर्वक प्रवेश किया है और विवो में आरएनए ( चित्रा 2 ) में क्रॉस-लिंक्ड किया गया है, इस बिंदु पर एक डॉट ब्लॉंट किया जा सकता है।
  6. आरएनए को पुनर्प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 xg पर उपजी आरएनए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरएनए गोली धोने के लिए आरएनए गोली में 1 एमएल 70% ठंडे इथेनॉल जोड़ें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 xg के नमूनों को अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए हवा सूखा।
  8. आरएनए गोली के लिए एन्यूकेलेज फ्री पानी जोड़ें और यूवी स्पेक्ट्रोमीटर से आरएनए की एकाग्रता का पता लगाएं।
    रोकें बिंदु: आरए को एफ के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता हैतरल नाइट्रोजन में ठंड जमा देता है

2. आरएनए फ्रेग्मेंटेशन

  1. पहले से 15 μL 2x आरएनए विखंडन बफर और आरएनए नमूना (1 माइक्रोग्राम / μL) के 10 μL अलग-अलग 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में, 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 10 μL आरएनए नमूने के साथ गरम 2x आरएनए विखंडन बफर के 10 μL मिलाएं। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं बर्फ पर प्रतिक्रिया को ठंडा करने से तस्वीर को रोकें।
  2. एक 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 2 विखंडन प्रतिक्रियाओं को ट्रांसफर और पूल करें। प्रतिक्रिया के लिए 40 μL न्युकेला मुफ्त पानी, 3 एम सोडियम एसीटेट के 10 μL, 1 μL ग्लाइकोजन और 300 μL 100% इथेनॉल को विखंडन प्रतिक्रिया में जोड़ें। आरएनए को कम करने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए सेते हैं।
  3. 20,000 xg में 30 मिनट के लिए उपजी आरएनए अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 1 एमएल 70% इथेनॉल का उपयोग करके आरएनए धो लें।
  4. 15 मिनट के लिए 20,000 xg पर आरएनए अपकेंद्रित्र, रिमसतह पर तैरनेवाला ओव्वेज और एन्यूकेलेज फ्री पानी के 20 μL में आरएनए भंग।

3. आरएनए आकार का चयन और अल्युशन

  1. माइक्रोफ्यूज ट्यूब में आरएए लदान डाई के 20 μL को आरएएनए में जोड़ें। आरएनए लदान डाई के साथ आरएनए को 3 डिग्री सेल्सियस पर 95 डिग्री सेल्सियस से गरम करें और इसे 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  2. माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 10 एनटी डीएनए सीढ़ी के 0.25 μL के लिए 3 μL आरएनए लदान डाई को जोड़ें। सीढ़ी को 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट तक गरम करें और इसे 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  3. विच्छेदन सीढ़ी और नमूनों को 8.6 सेमी x 6.8 सेमी 6% टीबीई यूरिया जेल और 180 डिग्री पर 40 मिनट के लिए वैद्युतकणसंचलन द्वारा आकार विभेदित करें। 10 एमएल के टीबीई बफर में जेल डालना जिसमें 1: 10,000 न्यूक्लिक एसिड जेल का दाग होता है अंधेरे में मिनट
  4. एक 24 जी सुई का उपयोग करके एक साफ 0.6 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब को पंचक दें और इसे 2 एमएल माइक्रोफ़्यूज ट्यूब में रखें।
  5. ट्रांसिल्युमिनेटर के उपयोग के बाद दाग वाले जेल पर बैंड को विज़ुअलाइज़ करें और 90-11 के लिए जेल का टुकड़ा कट करें0 एनटी। 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में पंचर 0.6 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में जेल स्लाइस को स्थानांतरित करें। यह आकार चयन ट्रांस्क्रिप्टम में मैप करने के लिए न्यूनतम लम्बाई की अनुमति देने के लिए किया जाता है और डाउनस्ट्रीम साइज चयन चरणों में अनलिमिटेड उत्पादों की तुलना में निकटता वाले उत्पादों के बीच अंतर करने के लिए।
  6. कमरे के तापमान पर 12,000 XG पर जेल स्लाइस को अपकेंद्रित्र 2 मिनट के लिए जेल टुकड़ा टुकड़ा और 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा। खाली 0.6 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब को छोड़ दें। 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में कटा हुआ जेल टुकड़े के लिए 700 बियर का बफर जोड़ें और बफर में नमूनों के प्रसार की अनुमति देने के लिए, लगातार रोटेशन के साथ रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते रहें।
  7. जेल स्लाइस और अल्युशन बफर को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब फिल्टर और 2 मिनट के लिए 20,000 xg पर अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें। जेल स्लाइस फिल्टर के शीर्ष डिब्बे में फंस जाएंगे। जेल स्लाइसें और शीर्ष डिब्बे त्यागें।
  8. ग्लाइकोन के 1 μL और 7 जोड़ेंमाइक्रोफ्यूज ट्यूब में छानने के लिए 100% आइसोप्रोपेनॉल के 00 μL और कम से कम 1 घंटे या रातोंरात के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए को कम करते हैं।
    पॉज़ प्वाइंट: आरएएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर ऑस्टोपोपार्नोल में अनिश्चित काल में उपजी हो सकता है
  9. आरएनए को पुनर्प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 xg पर उपजी आरएनए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरएनए गोली धोने के लिए 70% ठंडे इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 xg पर धोया गया गोली अपकेंद्र
  10. धोने के बफर को निकालें और आरएनए को रिसासपेंड करने के लिए 20 μL न्युकेलेज फ्री पानी जोड़ें। यूवी स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग करके आरएनए की एकाग्रता को बढ़ाएं
    पॉज़ प्वाइंट: तरल नाइट्रोजन में फ़्लैश फ्रीजिंग के बाद आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. आरएनए क्रॉटलिंकिंग क्षेत्र के संवर्धन

  1. ट्यूब में समरूप रूप से मोती को पुन: resuspend करने के लिए भंवर streptavidin लेपित चुंबकीय मोती। एक 1.5 एमएल माइक्रॉफ़ ट्यूब के लिए मोती के 100 μL स्थानांतरण करें और इसे एक चुंबक पर रखें1 मिनट के लिए आईसी स्टैंड के लिए मोती ट्यूब के चुंबकीय तरफ छड़ी करने की अनुमति देते हैं। मोती से भंडारण बफर को ध्यान से निकालें और ट्यूब को चुंबक स्टैंड से बाहर निकालें।
  2. माइक्रोफ्यूज ट्यूब में मोतियों को 1 एमएल लेंस बफर जोड़ें और ऊपर और नीचे पिपेट करें। 1 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोती वाले माइक्रोफ्यूज़ को धोने के बफर से मोती अलग रखें। कुल 3 धोने के लिए इसे दोहराएं।
  3. 1 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोती वाले सूक्ष्म कणों को रखकर मोती से धो बफर निकालें। Lysis बफर के लिए आरएनस अवरोध करनेवाला (1: 200) जोड़ें और माइक्रोफ्यूज ट्यूब में धोने वाले मोतियों के लिए 100 μL lysis बफर जोड़ें।
  4. ताजा तैयार हाइब्रिडिजेशन बफर के 2 एमएल, पूरक मिसाल के बफर के 1 एमएल, 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब के आकार विभाजित आरएनए और 100 μL रिज्यूसड मोती जोड़ें। भंवर ट्यूब धीरे से
  5. 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस से 30 मिनट के लिए अंत में रोटेशन से समाप्त करें।37 डिग्री सेल्सियस पर धो बफर पहले से गर्म
  6. बफर से मोती को अलग करने के लिए 15 मिलीलीटर की 15 मिलीलीटर ट्यूबों को 15 एमएल ट्यूबों के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें। बफर को ट्यूब से सावधानी से पिपेट करें और इसे हटा दें।
  7. मोती के लिए पूर्व गर्म धोने के बफर के 1 एमएल जोड़ें, पिपेट को ऊपर और नीचे और मोती को 1.5 एमएल माइक्रोफ़्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। मोती पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तक सेते हैं, अंत में रोटेशन के अंत में।
  8. संक्षेप में microfuge ट्यूब की सामग्री नीचे अपकेंद्रित्र। धोने के बफर से मोतियों को अलग करने के लिए, 1 मिनट के लिए 2 एमएल ट्यूबों के लिए चुंबकीय स्टैंड पर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में 1.5 एमएल धोया मोती रखें। बफर को माइक्रोफ्यूज ट्यूब से बफर को पिपेट करने से मोती से निकालें।
  9. धोने के लिए 1 एमएल का प्री-वार्म वॉश बफर और मोती को पिपेट ऊपर और नीचे दोहराएं। कुल 5 व्यर्थ निकालें। 5 वें धोने के अंत में, माइक्रोफ्यूज युक्त मोती युक्त चुंबक स्टैंड के लिए धो बफर हटा दें1 मिनट।

5. निकटता Ligation

  1. धोने वाले मोतियों के लिए 1 एमएल शीत टी -4 पॉलिनक्लियोक्लियोटिड किनाज (पीएनके) बफर जोड़ें और मोती को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते रहें, अंत में रोटेशन के अंत में। 1 मिनट के लिए चुंबकीय पट्टी पर मोती युक्त माइक्रोफ्यूज ट्यूब रखें और धीरे-धीरे टी 4 पीएनके बफर को हटा दें। कुल 2 धोने के लिए इस चरण को दोहराएं और अंतिम धोने के बाद टी 4 पीएनके बफर को हटा दें।
  2. टेबल 1 के अनुसार, मोतियों को बफर जोड़ें आरएनए टुकड़े के 3 'समाप्त होने के लिए नीचे 3' एडेप्टरों के लिए ligated होना सक्षम करने के लिए, आरएफए के अंत में 3 'चक्रीय फॉस्फेट समूह को बदलने के लिए लगातार आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बफर में मोती सेते हैं। 3 'ओह।
  3. तालिका 2 के अनुसार, पिछले प्रतिक्रिया में बफ़र्स जोड़ें आरएनए टुकड़ों के 5 'अंत को सक्षम करने के लिए बाध्यकारी होने के लिए, एटीपी की उपस्थिति में निरंतर आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते।, 5 'आरए से 5' फॉस्फेट को ओएच कन्वर्ट करने के लिए।
  4. टेबल 3 के मुताबिक, बफर को निकटता की बालिग के लिए पिछले प्रतिक्रिया में जोड़ें। 16 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस, लगातार आंदोलन के साथ प्रतिक्रिया सेते हैं,
  5. 1 मिनट के लिए एक चुंबक स्टैंड पर ligated आरएनए युक्त microfuge रखें सतह पर तैरने वाले को सावधानी से निकालें और मोती को 1 एमएल का कमरा तापमान धो बफर जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा Resuspend
  6. 1 मिनट के लिए चुंबक स्टैंड पर माइक्रोफ्यूज ट्यूब रखें और सावधानी से धो बफर को हटा दें। कुल 2 वाश धो लें और दूसरे धोने के अंत में मोती से धो बफर को हटा दें।
  7. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मोतियों और resuspend को आरएनए पीके बफर के 100 μL जोड़ें। एक गर्मी ब्लॉक पर नमूने 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गरम करें।
  8. 1 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना ठंडा करें और नमूने के लिए 500 μL guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform जोड़ें। 10 एस के लिए सख्ती से vortexing द्वारा मिक्स मिक्क्सू सेते हैं10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर फिर से
    पॉज़ प्वाइंट: कुछ महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर गुआनडिनियम थिओसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म में आरएनए को संग्रहीत किया जा सकता है।
  9. गुआनिडिनियम थियोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निकाले जाने वाले नमूनों में 100 μL क्लोरोफॉर्म जोड़ें। भंवर 10 एस के लिए सख्ती से 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 xg के नमूनों को अपकेंद्रित्र
  10. एक नई 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में जलीय परत के 400 μL स्थानांतरित करें। 100% इथेनॉल के 800 μL (2 संस्करण) जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
  11. आरएनए क्लीनअप कॉलम में आरएनए समाधान को ट्रांसफर करना और निर्माता के निर्देशों के बाद आरएनए को ठीक करना, यह सुनिश्चित करना कि छोटे आरएनए भी बनाए रखा जाए। 100 μL न्युकेलेज मुक्त पानी में आरएनए को नमस्कार।
    पॉज़ प्वाइंट: तरल नाइट्रोजन में फ़्लैश फ्रीजिंग के बाद आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

6. बायोटिनिलेटेड Psoralen के क्रॉसलिंकिंग रिवर्स

  1. अल्यूमड नमूनों के 100 μL को 24 अच्छी तरह से पीएल के एक कुएं में स्थानांतरित करेंखाया। आवरण निकालें और यूवी 254 एनएम के तहत नमूने को चमकाना, बर्फ पर 5 मिनट के लिए।
  2. एक साफ माइक्रोफ्यूज ट्यूब के लिए रिवर्स क्रॉस-लिंक्ड नमूना स्थानांतरित करें। 10 μL सोडियम एसीटेट, 1 μL ग्लाइकोजन और 300 μL 100% इथेनॉल में जोड़ें और कम से कम 1 घंटे या रातोंरात के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए को कम करें।
    पॉज़ प्वाइंट: आरएनए को इथेनॉल में अनिश्चित काल से -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रक्षेपित किया जा सकता है।
  3. आरएनए को पुनर्प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 xg पर उपजी आरएनए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरएनए गोली धोने के लिए 70% ठंडे इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 xg पर धोया गया गोली अपकेंद्र धोने के बफर को निकालें और आरएनए को रिजसेंड करने के लिए 4.25 μL न्युकेलेज फ्री पानी जोड़ें। आरएनए को 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    पॉज़ प्वाइंट: तरल नाइट्रोजन में फ़्लैश फ्रीजिंग के बाद आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

7. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और सीडीएनए परिपत्रीकरण

  1. 0.75 μL जोड़ेंआरसीए लिंकर (0.5 μg / μL) में पीसीआर ट्यूब में resuspended नमूना के लिए और 90 डिग्री के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी नमूना को 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें
  2. टेबल 4 के अनुसार, 3 'एडॉप्टर लघने के लिए डिफनेटेड नमूने में बफ़र्स जोड़ें। 2.5 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
  3. एक 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया स्थानांतरण। 10 μL सोडियम एसीटेट, 1 μL ग्लाइकोजन और 300 μL 100% इथेनॉल के बाद प्रतिक्रिया के लिए 90 μL न्युकेलेज फ्री पानी जोड़ें। कम से कम 1 घंटे या रातोंरात के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए की गति।
    पॉज़ प्वाइंट: आरएनए को इथेनॉल में अनिश्चित काल से -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रक्षेपित किया जा सकता है।
  4. आरएनए को पुनर्प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 xg पर उपजी आरएनए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरएनए गोली धोने के लिए 70% ठंडे इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 ग्राम पर धोया गया गोली अपकेंद्रित करें धोने के बफर को हटा दें, 5 μL की न्युकली फ्री डब्ल्यू में गोली को फिर से खोलेंअटर।
  6. माइक्रोफ्यूज ट्यूब में आरएए लदान डाई के 5 μL को पुनः प्राप्त आरएनए में जोड़ें। आरएनए लदान डाई के साथ आरएनए को 3 डिग्री सेल्सियस पर 95 डिग्री सेल्सियस से गरम करें और इसे 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  7. माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 10 एनटी डीएनए सीढ़ी के 0.25 μL के लिए 3 μL आरएनए लदान डाई को जोड़ें। सीढ़ी को 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट तक गरम करें और इसे 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  8. चरणों 3.3 और 3.4 के रूप में 8.6 सेमी x 6.8 सेमी 6% टीबीई यूरिया जेल का उपयोग कर आकार विभाजन का प्रदर्शन करें।
  9. ट्रांसिल्युमिनेटर का उपयोग करते हुए न्यूक्लिक एसिड के दाग के साथ जेल की कल्पना करें और सीढ़ी पर 110-140 एनटी के अनुरूप जेल का टुकड़ा कट करें। 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में पिलने वाला 0.6 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में जेल स्लाइस को स्थानांतरित करें और प्रोटोकॉल 3.6- 3.9 कदम से पालन करें।
  10. शाही सेना गोली resuspend के लिए 5 μL nuclease मुक्त पानी जोड़ें। आरएनए को 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    पॉज़ प्वाइंट: तरल नाइट्रोजन में फ़्लैश फ्रीजिंग के बाद आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  11. 1.25 पर आरटी प्राइमर के 1 μL जोड़ें81; पीसीआर ट्यूब में आरएनए के लिए एम और गर्मी में 80 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 मिनट नमूना को 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें
  12. तालिका 5 के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए बफ़र्स जोड़ें 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं
  13. प्रतिक्रिया के लिए 1.1 μL और 1 एनओओएचएचएच को 20 डिग्री के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ें। बर्फ पर प्रतिक्रिया रखें
  14. एक 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया स्थानांतरण। 10 μL सोडियम एसीटेट, 1 μL ग्लाइकोजन और 300 μL 100% इथेनॉल के बाद प्रतिक्रिया के लिए 90 μL न्युकेलेज फ्री पानी जोड़ें। कम से कम 1 घंटे या रातोंरात के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए की गति।
    पॉज़ प्वाइंट: डीएनए को इथेनॉल में अनिश्चित काल तक -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रक्षेपित किया जा सकता है
  15. डीएनए को पुनर्प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 ग्राम पर प्रक्षेपित डीएनए को अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और डीएनए गोली धोने के लिए 70% ठंडे इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 xg पर धोया गया गोली अपकेंद्र धोने के बफर को निकालें, पील को फिर से खोलें5 μL नुकले पानी मुक्त पानी में दें।
  16. चरणों 3.3 और 3.4 के रूप में 8.6 सेमी x 6.8 सेमी 6% टीबीई यूरिया जेल का उपयोग कर आकार विभाजन का प्रदर्शन करें।
  17. ट्रांसिल्युमिनेटर का उपयोग करके पोस्ट-स्टेन्ड जेल को विज़ुअलाइज़ करें और सीढ़ी पर 200-240 एनटी के बराबर जीईएल स्लाइस कट करें। रिवर्स लिखित सीडीएनए अब 96 बेस आरटी प्राइमर के अतिरिक्त के कारण आरएनए टुकड़ा से 96 आधार हैं। 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में पंचर 0.6 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में जेल स्लाइस को स्थानांतरित करें।
  18. कमरे के तापमान पर 12,000 XG पर जेल स्लाइस को अपकेंद्रित्र 2 मिनट के लिए जेल टुकड़ा टुकड़ा और 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा। खाली 0.6 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब को छोड़ दें।
  19. 2 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में कटा हुआ जेल टुकड़े के लिए 700 बचे हुए बफर का बफर जोड़ें और लगातार रोटेशन के साथ 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते रहें। चरण 3.7- 3.8 में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें।
  20. डीएनए गोली resuspend करने के लिए 6 μL nuclease मुक्त पानी जोड़ें। डीएनए को 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  21. तालिका 6 के अनुसार, सीडीएनए परिपत्र के लिए प्रतिक्रिया में बफ़र्स जोड़ें। प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करने के लिए 10 डिग्री के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और गर्मी पर प्रतिक्रिया को सेते।
  22. एक 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया स्थानांतरण। निर्माता के निर्देशों के बाद एक डीएनए क्लीनअप स्तंभ का उपयोग कर परिपत्रित सीडीएनए शुद्ध करना। शुद्ध सीडीएनए को चुने के लिए कॉलम में 20 μL न्युकेलेज फ्री पानी जोड़ें।
    पॉज़ प्वाइंट: डीएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर कुछ महीने के लिए जमा किया जा सकता है।

8. पीसीआर प्रवर्धन (छोटे पैमाने पीसीआर)

  1. पुस्तकालय प्रवर्धन के लिए आवश्यक चक्रों की न्यूनतम संख्या का परीक्षण करने के लिए पीसीआर प्रवर्धन के लिए तालिका 7 के अनुसार प्रतिक्रिया में बफ़र्स जोड़ें।
  2. तालिका 8 के मुताबिक पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति निर्धारित करें प्रतिक्रिया रोकें और 5 μL का स्थानांतरण करें10, 15 और 20 चक्रों पर पीसीआर प्रतिक्रिया, अलग 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में।
  3. विभिन्न चक्रों में 5 μL पीसीआर प्रतिक्रिया में से प्रत्येक के लिए 1 μL 6x डीएनए जेल लदान डाई को जोड़ें। पीसीआर उत्पादों को देखने के लिए 1 घंटे के लिए 3% agarose जेल पर जेल वैद्युतकणसंचलन करें, 120 वी पर।
    1. पीसीआर चक्र (वाई) की न्यूनतम संख्या का उपयोग करें जो लगभग 250 अड्डों पर प्रवर्धन दिखाता है ( चित्रा 3 में , प्रवर्धन के 15 चक्रों और 10 चक्रों पर एक बेहोश बैंड पर एक मजबूत बैंड है। बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रवर्धन के 12 चक्र होने की संभावना है गहरी अनुक्रमण के लिए पर्याप्त सामग्री उत्पन्न करते हैं क्योंकि सीडीएनए की मात्रा 10 गुणा छोटे पैमाने पर पीसीआर प्रवर्धन का है)।

9. पीसीआर एम्प्लीफिकेशन (बड़े स्केल पीसीआर) और शुद्धि

  1. बड़े पैमाने पर पीसीआर के लिए पीसीआर प्रवर्धन के लिए तालिका 9 के अनुसार प्रतिक्रिया में बफर जोड़ें।
  2. पीसीआर के अनुसार साइकिल चालन की स्थिति निर्धारित करेंतालिका 10
  3. 5 μL 6x डीएनए जेल लदान डाई को 25 μL पीसीआर प्रतिक्रिया में जोड़ें और 3% agarose जेल के कूल में लोड करें। 1 केबी प्लस डीएनए सीढ़ी को अलग तरह से लोड करें 1.5 घंटे के लिए 100 वी पर जेल वैद्युतकणसंचलन करें।
  4. एक यूवी ट्रांसलिमुनेटर का उपयोग करके पूरा जेल को विज़ुअलाइज़ करें
  5. आकार 200-300 कुर्सियों से पीसीआर उत्पादों युक्त जेल का टुकड़ा निकालें और एक साफ 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में जेल स्थानांतरण करें।
  6. एक डीएनए जेल निष्कर्षण किट से 1 एमएल जेल सॉल्युबिलिटी बफर, जेल टुकड़ा और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, या जब तक जेल घुल नहीं जाता है, तब तक लगातार आंदोलन के साथ।
  7. भंग जेल में 200 μL आइसोप्रॉनॉल को मिलाएं और पिपेट करने से अच्छी तरह मिलाएं। 30 एस के लिए 13,000 xg पर एक डीएनए जेल निष्कर्षण क्लीनअप स्तंभ और अपकेंद्रित्र के नमूने के 700 μL स्थानांतरित करें जब तक सभी नमूने कॉलम पर लोड नहीं किए जाते तब तक भंग नमूना को स्तंभ में स्थानांतरित रखें।
  8. 500 μL जेल विलेयता बफर जोड़ें,इसके बाद निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, स्तंभ के 700 μL स्तंभ धो बफर के अनुसार डीएनए से छुटकारा पाने के लिए स्तंभ के केंद्र में 12 μL नुकले-मुक्त पानी जोड़ें। रोकें बिंदु: डीएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है
  9. फ्लोरोमेट्रिक मात्रा का ठहराव का उपयोग करके डीएनए की एकाग्रता को बढ़ाएं। यदि कई पुस्तकालयों का निर्माण और अनुक्रमण के लिए एक साथ जमा किया गया है, तो पूल के लिए प्रत्येक नमूने की समान मात्रा जोड़ें, उच्चतर रूपरेखा अनुक्रमण के लिए।

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Representative Results

चित्रा 1 चित्रा 1 SPLASH वर्कफ़्लो के योजनाबद्ध को दर्शाया गया है। 0.01% डिजीटलिनिन की उपस्थिति में बायोटिनिलेटेड पॉरलेंस के अतिरिक्त, और यूवी क्रॉटलिंकिंग, कुल आरएनए को कोशिकाओं से निकाला जाता है और एक डॉट ब्लाट किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आरएनए को बायोटिनिलेटेड के क्रॉटलिंकिंग कुशलतापूर्वक ( चित्रा 2 ) हो गई है। हम बायोटिनिलाटेड 20 आधार ऑलिगो को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करते हैं, जो कि कोशिकाओं में बायोटिनिलेटेड psoralen की मात्रा को जोड़ते हैं, जैसे कि प्रत्येक 150 ठिकानों में लगभग 1 को क्रॉस-लिंक्ड किया जाता है।

जितना अधिक पीसीआर दोहराव की घटनाओं में वृद्धि हुई पीसीआर प्रवर्धन चक्रों के साथ होते हैं, हम एक छोटे पैमाने पर पीसीआर प्रवर्धन करते हैं जो विभिन्न पीसीआर चक्रों का उपयोग करते हैं, जो निम्नतम प्रवर्धन चक्र निर्धारित करते हैं जो गहरी अनुक्रमण के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करते हैं। एक कुशल पुस्तकालय तैयारी प्रक्रिया में, हम हैंपीसीआर प्रवर्धन ( चित्रा 3 ) के कम से कम 15 चक्रों में चयनित आरएनए इनपुट के 1.5 μg आकार से सीडीएनए अनुक्रमण लाइब्रेरी को बढ़ाने में सक्षम। तब लाइब्रेरी को 2x 150 आधार जोड़ी का उपयोग करके एक उच्चतर इनपुट अनुक्रमण मशीन पर पढ़ा जाता है और क्रमिक पढ़ता है, चित्रा 4 में कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन के अनुसार संसाधित किया जाता है। अंतिम परिणाम फ़िल्टर की गई चिमड़ी बातचीत की एक सूची है जिसमें ट्रांस्क्रिप्टोम ( तालिका 11 ) में इंट्रामोलेक्यूलर और इंटरमॉलिक्यूलर आरएनए-आरएनए इंटरैक्शन दोनों शामिल हैं।

आकृति 1
चित्रा 1 : SPLASH 15 के प्रायोगिक कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध सेल के भीतर जोड़ीदार आरएनए बातचीत 365 एनएम पर यूवी प्रकाश के तहत बायोटिनिलेटेड psoralen का उपयोग करते हुए crosslinked हैं। Crosslinked आरएनए वें हैएन निष्कर्ष निकाला और लगभग 100 ठिकानों के लिए खंडित। बायोटिनिलेटेड psoralen crosslinks वाले क्षेत्रों के साथ बातचीत करना, स्ट्रेप्टिविडिन मोती के लिए बाध्य करके और एक साथ ligated द्वारा समृद्ध हैं। यूवी प्रकाश के तहत 265 एनएम पर रिवर्स क्रॉटलिंकिंग पर, चिमरिक आरएनए को सीडीएनए पुस्तकालय में गहरी अनुक्रमण के लिए क्लोन किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : बीटिनिलेटेड क्रॉटलिंकिंग दक्षता का परीक्षण डॉट ब्लोटिंग 15 1% डिजीटीनिन की उपस्थिति में बायोटीनिलेटेड psoralen crosslinked आरएनए विवो में डॉट ब्लोट क्रिस्टलंकित आरएनए (20-2,000 एनजी) के विभिन्न सांद्रण झिल्ली पर दिखाई देते हैं। बायोटिनिलाटेड 20 आधार के विभिन्न सांद्रताOligo सकारात्मक नियंत्रण के रूप में देखा जाता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: स्प्लैश के लिए लघु स्तरीय पुस्तकालय प्रवर्धन आरटी प्रतिक्रिया से 1 μL सीडीएनए छोटे पैमाने पर पीसीआर के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रतिक्रियाओं को 10, 15 और 20 चक्रों पर लिया जाता है और लाइब्रेरी पीढ़ी के लिए जरूरी प्रवर्धन चक्र की न्यूनतम संख्या निर्धारित करने के लिए 3% agarose जेल पर चलाया जाता है। इस विशिष्ट उदाहरण में, बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रतिक्रिया में सीडीएनए के 10 μL का प्रयोग करके प्रवर्धन के 10 चक्रों को गहरी अनुक्रमण के लिए पर्याप्त एम्पलिसिस उत्पन्न होंगे।

चित्रा 4
स्पैशल के कम्प्यूटेशनल वर्कफ़्लो के योजनाबद्ध उच्च आवृत्ति अनुक्रमण से पढ़ते हुए अनुक्रमण ट्रांसस्क्रिप्टम के लिए मैप किए जाते हैं और खराब गुणवत्ता की पढ़ाई के खिलाफ फ़िल्टर किए जाते हैं, पीसीआर डुप्लिकेट, डुप्लिकेट मैपिंग और स्प्लिचिंग जंक्शन, विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग करके पढ़ता है। अंतिम आउटपुट उन चीमारों की एक सूची है जो ट्रांसस्केम में इंट्रा- और इंटरमॉलेक्यूलर इंटरैक्शन दोनों का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

अभिकर्मकों वॉल्यूम (μL) अंतिम
Nuclease मुक्त पानी 64
10x टी 4 पीएनके बफर 8 1x
Rnase अवरोधक (20 U / μL) 4 1 यू / μ एल
टी 4 पीएनके (10 यू / एमएल) 4 0.5 यू / μ एल
कुल 80

तालिका 1: 3 'अंत की मरम्मत के लिए अभिकर्मकों

अभिकर्मकों वॉल्यूम (μL) अंतिम
पीएनके प्रतिक्रिया 80
Nuclease मुक्त पानी 3
10x टी 4 पीएनके बफर 2 1x
10 मिमी एटीपी 10 1 मिमी
टी 4 पीएनके (10 यू / एमएल) 5 0.5 यू / μ एल
कुल 100

तालिका 2: 5 'अंत की मरम्मत के लिए अभिकर्मक

अभिकर्मकों आयतन (μL) अंतिम
पीएनके प्रतिक्रिया 100
10x टी 4 आरएनए ligase बफर 6 1x
10 मिमी एटीपी 6 1 मिमी
Rnase अवरोध करनेवाला (20 U / μL) 4 0.5 यू / μ एल
टी 4 आरएनएल 1 (10 यू / एमएल) 40 2.5 यू / μL
न्युकेला फ्रई पानी 4
कुल 160

तालिका 3: निकटता के लिए अभिकर्मकों ligation।

अंग प्रति प्रतिक्रिया की मात्रा (μL) अंतिम
आरएनए और लिंकर 5
टी 4 आरएनएल 2 बफर (10x) 1 1x
पीईजी 8000 (50%, वाइट / वॉल्यूम) 3 15% (वाइट / वॉल्यूम)
Rnase अवरोध करनेवाला (20 U / μL) 0.5 1 यू / μ एल
टी 4 आरएनएल 2 (टीआर) (200 यू / μ एल) 0.5 10 यू / μ, एल
कुल 10

तालिका 4: एडॉप्टर लगीकरण के लिए अभिकर्मक।

अंग प्रति प्रतिक्रिया की मात्रा (μL) अंतिम
Ligation और प्राइमर 6
प्रथम-स्ट्रैंड बफर (5x) 2 1x
डीएनटीपी (10 मिमी) 0.5 0.5 मिमी
डीटीटी (0.1 एम) 0.5 5 मिमी
Rnase अवरोध करनेवाला (20 U / μL) 0.5 1 यू / μ एल
रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ (200 यू / μ एल) 0.5 10 यू / μL
कुल 10

तालिका 5: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए अभिकर्मक

अंग प्रति प्रतिक्रिया की मात्रा (μL) अंतिम
पहली सीढ़ी सीडीएनए 6
एकल किनारा डीएनए ligase बफर (10x) 1 1x
बेटन (5 एम) 2 1 एम
एमएनसीएल 2 (50 एमएम) 0.5 2.5 मिमी
एकल किनारा डीएनए ligase (100U / μL) 0.5 5यू / μL
कुल 10

तालिका 6: सीडीएनए के परिपत्रन के लिए अभिकर्मक

अंग प्रति प्रतिक्रिया की मात्रा (μL) अंतिम
Ligated डीएनए उत्पाद 1
Nuclease मुक्त पानी 10.5
उच्च-फिडेलिटी डीएनए पोलीमरेज़ 2 एक्स मास्टर मिक्स 12.5 1x
यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर (10 माइक्रोन) 0.5 0.02 माइक्रोन
सूचकांक (एक्स) प्राइमर (10 माइक्रोन) 0.5 0.02 माइक्रोन
कुल 25

तालिका 7: छोटे पैमाने पर पीसीआर के लिए प्रयुक्त अभिकर्मक

चरण तापमान पहर साइकिल
प्रारंभिक अस्वीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 30 एस 1
विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 10 एस
एनीलिंग 65 डिग्री सेल्सियस 30 एस 25
एक्सटेंशन 72 डिग्री सेल्सियस 30 एस
अंतिम एक्सटेंशन 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस ∞

तालिका 8: छोटे पैमाने पर पीसीआर के लिए उपयोग की जाने वाली परिस्थितियां

अंग प्रति प्रतिक्रिया की मात्रा (μL) अंतिम
Ligated डीएनए उत्पाद 5
Nuclease मुक्त पानी 6.5
उच्च-फिडेलिटी डीएनए पोलीमरेज़ 2 एक्स मास्टर मिक्स 12.5 1x
यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर (10 माइक्रोन) 0.5 0.02 माइक्रोन
सूचकांक (एक्स) प्राइमर (10 माइक्रोन) 0.5 0.02 माइक्रोन
कुल 25

तालिका 9: बड़े पैमाने पर पीसीआर के लिए इस्तेमाल अभिकर्मकों

चरण तापमान पहर साइकिल
प्रारंभिक अस्वीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 30 एस 1
विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 10 एस
एनीलिंग 65 डिग्री सेल्सियस 30 एस Y
एक्सटेंशन 72 डिग्री सेल्सियस 30 एस
अंतिम एक्सटेंशन 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस ∞

तालिका 10: बड़े पैमाने पर पीसीआर के लिए इस्तेमाल की जाने वाली परिस्थितियां

टेबल 11
तालिका 11: कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन का विश्लेषण उत्पादन "एसएएम ध्वज विभाजित विभाजित 1" = 0 इंगित करता है कि पटकथा प्रतिलेख के सकारात्मक किनारे पर मैप की जाती है "आरएनए 1 पहचान" का अर्थ चिरा के बाईं ओर के आरएनए की पहचान को दर्शाता है "आरएनए 1 की शुरुआत स्थिति" प्रारंभिक स्थिति को संदर्भित करता है जिसमें आरएएन 1 के साथ पढ़ने के लिए मैप किया जाता है। "आरएनए 1 एंड पोझिशन" अंत स्थिति को संदर्भित करता है जिसमें रीड 1 आरए 1 के साथ मैप किया जाता है। "मैपिंग स्कोर विभाजित 1 पढ़ें" संदर्भ पढ़ने के मैपिंग स्कोर को आरएनए 1 के लिए मैप किया गया था। "सिगार विभाजित 1 पढ़ें"पढ़ा "एस" और "एम" पढ़ने के लिए मैप किए गए ठिकानों की संख्या से ढके हुए ठिकानों की संख्या को इंगित करता है "स्प्लिट पठन 1" अनुक्रम को दर्शाता है जो आरएनए 1 के लिए मैप किया गया था। उसी नामकरण का उपयोग कल्पना के दाहिनी ओर के लिए किया गया था, जिसे आरएनए 2 नाम दिया गया है। कृपया इस तालिका के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां, हम SPLASH के लिए प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल वर्कफ़्लो को विस्तार से वर्णन करते हैं, यह एक विधि है जो हमें जीन-वार आरएनए अंतरणों को एक जीनोम-व्यापी तरीके से पहचानने देती है। हमने सफलतापूर्वक जीवाणु, खमीर और मानव संस्कृतियों में स्पैश का उपयोग किया है और आशा करते हैं कि रणनीति विभिन्न सेलुलर राज्यों के तहत विभिन्न जीवों पर व्यापक रूप से लागू की जा सकती है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में से एक कम से कम 20 माइक्रोग्राम क्रॉस-लिंक्ड आरएनए के साथ प्रारंभ करना है जो डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं के लिए पर्याप्त सामग्री है। आरएनए तब 100 ठिकानों और पेज आकार के चुने हुए हिस्सों में विभाजित है। लाइब्रेरी पीढ़ी प्रक्रिया के दौरान मोनोमरों के बजाय, लिपिटेड चिमेरा के लिए अधिमानतः समृद्ध बनाने के लिए ये कदम महत्वपूर्ण हैं विखंडन और पहले आकार के चयन के बाद हम आम तौर पर लगभग 1.5 μg आरएनए प्राप्त करते हैं, और आरएनए फिर सीपीएनए लाइब्रेरी में एसपीएलएएचएच वर्कफ़्लो के अनुसार परिवर्तित हो जाता है। हम पाते हैं कि आरएनए शुरू करने की यह राशि हमें एच के लिए पर्याप्त सामग्री उत्पन्न करने की अनुमति देती हैपीसीआर प्रवर्धन के कम से कम 15 चक्रों का उपयोग करते हुए igh आउटपुट अनुक्रमण। चूंकि पीसीआर दोहराव की घटनाओं की संख्या बढ़ती पीसीआर चक्रों के साथ नाटकीय रूप से बढ़ती है, प्रवर्धन चक्रों की संख्या को ध्यान में रखते हुए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में उपयोगी, और अनूठे चिमेरा निकालने में सक्षम होने के लिए कम महत्वपूर्ण है।

अन्य जीनोम-व्यापी psoralen आधारित रणनीतियों के विपरीत, एसपीएएलएचएच ने बेस-युग्मित आरएनए टुकड़ों को एक-दूसरे को क्रॉसलिंक करने के लिए psoralen के बायोटिनिलाटेड संस्करण का इस्तेमाल किया है। जैसा कि हमने क्रॉसलिंकिंग की राशि को प्रति सौ और पचास आधार पर लगभग एक क्रॉस्लिंक कहा था, हम आरएनए विखंडन के बाद स्ट्रेप्टिविडिन मोती का उपयोग करके क्रॉस्लेंक्क्ड आरएनए क्षेत्रों के लिए समृद्ध कर सकते हैं। इसके अलावा, एंजाइमिक प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित करते हुए आरएनए मोतियों पर बंधे हुए हैं, हमें बफर एक्सचेंजों का प्रदर्शन करने और आसानी से वाष्पन करने की अनुमति दी। हालांकि, रणनीति की एक सीमा है कि बायोटीनिलेटेड psoralen psoralen या 4'-aminomethyl त्रिकोणीय की तुलना में कोशिकाओं में मर्मज्ञ में कम कुशल हैऑक्ससेलेन (एएमटी) जैसे, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि बायोटिनिलेटेड psoralen ने कोशिकाओं में प्रवेश किया है और आरएनए को क्रॉसलिंक किया है कुशलता से। हम नियमित रूप से क्रोस लिंक्ड, निकाले आरएनए पर डॉट बोट्स को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में बायोटिनिलेटेड ऑलिगोस के साथ, यह सुनिश्चित करने के लिए सुनिश्चित करते हैं कि हमारे आरएनए ठीक से क्रॉस-लिंक्ड कर रहे हैं। क्रॉसलिंकिंग कमजोर होने पर, सेल्यूलर झिल्ली में घुसना करने की रणनीतियां, जैसे डिजीटोनिन (0.01%) की 5 मिनट के लिए कम सांद्रता को जोड़ने के लिए, बायोटिनेलिटेड पॉओलेन कोशिकाओं में कुशलता से प्रवेश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जैसा कि psoralen न्यूक्लिक एसिड (यूवी 260 एनएम) के रूप में एक ही तरंग दैर्ध्य पर अवशोषित, हम आमतौर पर crosslinked आरएनए की मात्रा का ठहराव के लिए यूवी अवशोषण के बजाय fluorometric मात्रा का ठहराव प्रणाली का उपयोग करें।

Psoralen आधारित crosslinking रणनीतियों की एक सीमा है कि psoralen uridines (यू) पर preferentially crosslinks। जैसे, क्रास लिंक्गिंग के दौरान यू गौणों के आधार युग्मन क्षेत्रों को याद किया जा सकता है। इसलिए एक क्रॉस-लिंकिंग इवेंट बी का पता लगाने मेंदो किस्में और सबूत उपलब्ध कराते हैं कि एक बातचीत हो रही है, पारस्परिक संबंध की कमी बातचीत की कमी के समान नहीं है। हमारे स्पैशल प्रोटोकॉल में, हम बहुत कम माइक्रोआरएनए-एमआरएनए बातचीत, और कम मात्रा में एलएनसीआरएनए इंटरैक्शन लेते हैं। चूंकि माइक्रोआरएनए बाध्य एमआरएनए जीन एक्सप्रेशन और एलएनसीआरएनए में अवरुद्ध होने की संभावना है, आम तौर पर नीच रूप से व्यक्त किया जाता है, हमारे डेटा में उनके खराब प्रतिनिधित्व मुख्य रूप से अपर्याप्त अनुक्रमण गहराई के कारण होता है। हम आम तौर पर अनुक्रम प्रत्येक प्रतिलिपि के लिए कम से कम 200 मिलियन युग्मित अंत प्रति मानव ट्रांसक्रिप्टम पुस्तकालय पढ़ता है। इस गहराई पर, हमारे अनुक्रम में से अधिकांश काफी प्रचलित आरएनए पर पड़ता है। हम आशा करते हैं कि आरएनए की विशिष्ट आबादी के लिए संवर्धन रणनीतियों के इस्तेमाल से इन अपेक्षाकृत कम प्रचलित आरएनए के लिए संकेत काफी बढ़ेगा। एक अन्य चुनौती जिसे हम चिमरिक डेटा का विश्लेषण करते हुए मनाया है, यह स्पष्ट है कि स्पेलिंग से उत्पन्न होने वाली चीमरेस बनाम वास्तविक इंटरैक्टिंग चिमनिक घटनाओं के बीच अंतर है। संदूषण को रोकने के लिएच splicing हमारी chimeric सूची में पढ़ता है, हम सभी को पढ़ता है कि ट्रांसस्केम में ज्ञात एनोटेटेड स्प्लिचिंग साइट्स के करीब हैं। हम आशा करते हैं कि अधिक पूर्ण स्प्लिचिंग एनोटेशन के साथ, चीमेरों की अंतिम सूची अधिक सटीक बन जाएगी।

आरएनए बातचीत पर ध्यान केंद्रित करने वाली पिछले रणनीतियों से भिन्न जो कि एक आरएनए प्रजातियों या एक एकल आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए विशिष्ट हैं, सभी आरएनए के लिए जीनोम-व्यापी तरीके से आरएनए-आरएनए संवाद को स्पैश करने की क्षमता हमें बड़े पैमाने पर आरएनए का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है इंटरैक्शन नेटवर्क और पहली बार के लिए उपन्यास इंट्रमोलेक्यूलर और इंटरमॉलिक्यूलर आरएनए इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए। SPLASH का उपयोग करते हुए, हमने मानव और खमीर ट्रांसस्क्रिप्टम में हजारों इंट्रामोलेक्ल्यूलर और इंटरमॉलेकुलर इंटरैक्शन प्राप्त किए, जिससे हमें विवो में आरएनए इंटरएक्टियम के संगठन और गतिशीलता की झलक मिल सके। आरएनए संरचना मॉडलिंग एल्गोरिदम में इस लंबी दूरी के आरएनए इंटरैक्शन डेटा को एकीकृत करने की संभावना हैविवो में आरएनए संगठन के हमारे मौजूदा मॉडल को परिष्कृत करें स्नोआरएएनए भविष्यवाण कार्यक्रमों के रूप में स्पॉस्ल को इंटरमॉलिक्यूलर आरएनए भविष्यवाणी एल्गोरिदम में शामिल करना, इन भविष्यवाणियों की सटीकता में भी सुधार कर सकता है। हम आशा करते हैं कि अन्य जटिल जीवों और गतिशील प्रणालियों पर SPLASH के भविष्य के उपयोग जीवविज्ञान में आरएनए आधारित जीन विनियमन की जटिलताओं पर प्रकाश डालना जारी रखेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास वित्तीय हितों की प्रतिस्पर्धा नहीं है

Acknowledgments

हम सूचनात्मक चर्चाओं के लिए वान प्रयोगशाला और नागराजन लैब के सदस्यों का धन्यवाद करते हैं। एन। नागरसान को ए * स्टार से फंडिंग द्वारा समर्थित है वाई। वैन को ए * स्टार और सोसाइटी इन साइंस-ब्रैंको वेइस फेलोशिप से फंडिंग द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Plus DNA Ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10787026 DNA ladder
10 bp DNA ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10821-015 DNA ladder
20% SDS solution First BASE BUF-2052-1L  
20x SSC First BASE BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution First BASE BUF-1151-1L-pH5.2   Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 Bio-Rad 1610145 TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit Life Technologies Holdings Pte Ltd AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade   Promega V3131  TBE Urea gel component
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Chloroform Merck 1.02445.1000 RNA extraction
Single strand DNA ligase Epicentre CL9025K CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters Sigma-Aldrich CLS8160-96EA Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE Sigma-Aldrich D5628-1G For cell treatment
Dark Reader Transilluminator  Clare Chemical Research Dark Reader DR89X Transilluminator Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x) Life Technologies Holdings Pte Ltd R0611 Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium Pan BioTech P04-03500 For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads Life Technologies Holdings Pte Ltd 65002 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetic stand for 15 mL tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd 12301D DynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd 12321D DynaMag-2
ThermoMixer Eppendorf 5382 000.015 Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen Life Technologies Holdings Pte Ltd 29986 EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL  Hitachi F8T5/BL  365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum Life Technologies Holdings Pte Ltd 10270106   Components of Hela medium
Formamide Promega H5052   Component in hybridization buffer
G8T5 Sankyo-Denki G8T5 254 nm UV bulb
Glycogen Life Technologies Holdings Pte Ltd 10814010 Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop Life Technologies Holdings Pte Ltd Nanodrop 2000 Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water  First BASE BUF-1180-500ml  
Penicillin Streptomycin   Life Technologies Holdings Pte Ltd 15140122   Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x) Life Technologies Holdings Pte Ltd F531L  Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1 New England Biolabs E7335L  PCR primers
DNA Gel Extraction Kit QIAgen 28106 QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit Life Technologies Holdings Pte Ltd Q32854 Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit Qiagen 74106 RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor Life Technologies Holdings Pte Ltd AM2696 SUPERase In
Reverse transcriptase Life Technologies Holdings Pte Ltd 18080400 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies Holdings Pte Ltd S11494 SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs M0204L Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373L Enzyme for adaptor ligation
Temed Bio-Rad 1610801 TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform Life Technologies Holdings Pte Ltd 15596018 TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea First BASE BIO-2070-5kg  
UV crosslinker Stratagene 400072 UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator UVP 95-0417-01 For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich X4126-10G
DNA cleanup it Zymo Research  D4004 Zymo DNA concentrator-5 
List of software required
FastQC software 0.11.4 http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software 1.0.7 https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software 0.7.12 http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software 1.2.1 http://www.htslib.org/
PULLSEQ software 1.0.2 https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software 2.5.0c https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script AWK GNU 4.1.2 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence:
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

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References

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आनुवंशिकी अंक 123 आरएनए जीनोमिक्स इंटरैक्ट अनुक्रमण संरचना मानव
वैश्विक बायोटिनिलेटेड Psoralen का उपयोग आरएनए-आरएनए अंतरण मैपिंग
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Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen. J. Vis. Exp. (123), e55255, doi:10.3791/55255 (2017).

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