Summary
Qui, abbiamo dettagliato il metodo di equilibrio di P soralen crosslinked, L igated e S elected H ybrids (SPLASH), che consente mapping a livello genomico delle interazioni RNA-RNA intramolecolari e intermolecolari in vivo . SPLASH può essere applicato per studiare interagenti RNA di organismi compresi lieviti, batteri e umani.
Abstract
Sapere come i RNA interagiscono con se stessi e con gli altri è fondamentale per capire la regolazione del gene basato su RNA nella cellula. Mentre esempi di interazioni RNA-RNA come le interazioni di microRNA-mRNA sono state dimostrate per regolare l'espressione genica, l'intero grado in cui si verificano interazioni RNA nella cella è ancora sconosciuto. I metodi precedenti per studiare le interazioni di RNA si sono concentrati principalmente su subsets di RNA che interagiscono con una particolare proteina o specie di RNA. Qui, abbiamo dettagliato un metodo denominato S equencing di P soralen crosslinked, L igated, e S eletti H ybrids (SPLASH) che consente la cattura genoma di interazioni RNA in vivo in modo imparziale. SPLASH utilizza la reticolazione in vivo , la legatura di prossimità e il sequenziamento ad alta velocità per identificare partner globalmente associati alla base di RNA intramolecolare e intermolecolare. SPLASH può essere applicato a diversi organismi, compresi batteri, lieviti e cellule umane, nonché aS diverse condizioni cellulari per facilitare la comprensione della dinamica dell'organizzazione di RNA in diversi contesti cellulari. L'intero protocollo sperimentale SPLASH richiede circa 5 giorni per completare e il flusso di lavoro computazionale richiede circa 7 giorni per completare.
Introduction
Studiare come macromolecole si piegano e interagiscono tra loro è la chiave per comprendere la regolazione del gene nella cellula. Mentre molti sforzi sono stati focalizzati nell'ultimo decennio per comprendere come il DNA e le proteine contribuiscono alla regolazione del gene, è relativamente meno noto circa la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica. L'RNA trasporta informazioni sia nella sequenza lineare che nella struttura secondaria e terziaria 1 . La sua capacità di fondare la coppia con se stessa e con gli altri è importante per la sua funzione in vivo . I progressi recenti nel sondaggio della struttura secondaria RNA a elevata produttività hanno fornito preziosi approfondimenti sulle posizioni delle regioni a doppia e singola banda nel transcriptoma 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer le informazioni sui partner di interazione di coppia sono ancora in gran parte mancanti. Per determinare quale sequenza RNA interagisce con un'altra regione RNA nel trascrittoma, abbiamo bisogno di informazioni globali a livello di coppia.
La mappatura delle interazioni RNA in coppia in maniera globale e imparziale è stata tradizionalmente una grande sfida. Mentre gli approcci precedenti, come CLASH 9 , hiCLIP 10 e RAP 11 , vengono utilizzati per identificare le interazioni RNA in modo scalare, queste tecniche tipicamente mappano l'accoppiamento base di RNA per un sottoinsieme di RNA che interagiscono con una particolare specie di proteine o RNA. Gli sviluppi recenti nello studio delle interazioni globali di RNA includono il metodo RPL 12 , che non stabilizza le interazioni RNA in vivo e quindi può solo catturare un sottoinsieme di interazioni in vivo . Per superare queste sfide, noi e gli altri abbiamo sviluppato strategie prive di genoma e maestoseP interazioni di RNA in vivo , utilizzando versioni modificate del psoralen 13 , 14 , 15 del reticolatore. In questo protocollo, descriviamo i dettagli per eseguire l'equilibrio di S di P soralen incrociato, L igato e S eligibriti (SPLASH), che utilizza il psoralene biotinilato in RNA in accoppiamento a base di collegamento in vivo in seguito alla legatura di prossimità e ad alta sequenza di throughput a Individuare i partner RNA base-pairing in tutto il genoma ( Figura 1 ) 15 .
In questo manoscritto descriviamo i passaggi per eseguire SPLASH utilizzando cellule aderenti colte, in questo caso le cellule HeLa. Lo stesso protocollo può essere facilmente adattato alle cellule di mammiferi di sospensione e alle cellule di lievito e batteri. In breve, le cellule HeLa vengono trattate con psoralene biotinilato e irradiati a 365 nm per incrociare in coppia le coppie di RNA interattive in vivo. I RNA vengono quindi estratti dalle cellule, frammentati e arricchiti per le regioni di reticolazione usando perline di streptavidina. I frammenti RNA interattivi vengono quindi legati insieme usando la legatura di prossimità e fatti in una libreria di cDNA per la sequenza profonda. Al sequenziamento, gli RNA chimerici vengono mappati sul transcriptome / genoma per identificare le regioni interagenti RNA che sono accoppiate tra loro. Abbiamo utilizzato con successo SPLASH per identificare migliaia di interazioni RNA in vivo in lieviti e diverse cellule umane, tra cui l'accoppiamento base di RNA intramolecolare e intermolecolare in diverse classi di RNA, come snoRNA, lncRNA e mRNA, per intravedere nell'organizzazione strutturale e nei modelli di interazione Di RNA nella cella.
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Protocol
1. Trattamento delle cellule HeLa con estrazione di Psoralen e RNA biotinilata
- Coltivano le cellule HeLa nel mezzo di Eagle di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% di siero fetale fetale (FBS) e 1% di penicillina streptomicina (PS) in una piastra di 10 cm.
- Lavare le cellule HeLa due volte con 5 ml di 1x PBS. Scaricare completamente il PBS dal piatto posando il piatto verticalmente per 1 minuto.
- Aggiungere 1 ml di PBS contenente 200 μM di psoralene biotinilato e 0,01% w / v digitonin, alle cellule uniformemente e incubare a 37 ° C per 5 min. Mentre il psoralen biotinilato può entrare nella cella, la sua permeabilità è molto più alta quando le cellule sono esposte a basse quantità di digitonina (0,01%) per 5 min
- Rimuovere il coperchio della piastra da 10 cm contenente le celle HeLa trattate e posizionare il piatto piatto su ghiaccio. Irradiare il piatto contenente le celle con UV 365 nm per 20 minuti su ghiaccio, a distanza di 3 cm dalle lampadine UV, utilizzando il reticolatore UV.
- Isolare tOtal RNA dalle cellule HeLa mediante l'estrazione di guanidinium tiocianato-fenolo-cloroformio seguendo il protocollo del produttore. Aggiungere 1: 1 volume di isopropanolo per precipitare l'RNA a temperatura ambiente per 30 min.
Punto di pausa: RNA può essere conservato a -20 ° C in isopropanolo a tempo indeterminato. Una macchia di punti può essere eseguita a questo punto per verificare che il psoralen biotinilato è entrato con successo nelle cellule e ha RNA reticolato in vivo ( Figura 2 ). - Centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C per recuperare l'RNA. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo freddo al 70% al pellicola RNA per lavare l'RNA.
- Centrifugare i campioni a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e asciugare l'aria del pellet per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere acqua nuclease libera al pellet RNA e quantificare la concentrazione di RNA utilizzando lo spettrometro UV.
Punto di pausa: RNA può essere conservato a -80 ° C dopo fCongelamento a coclea in azoto liquido.
2. Frammentazione di RNA
- Preriscaldare 15 μL di tampone di frammentazione 2x RNA e 10 μL campione RNA (1 μg / μL) singolarmente in 0,2 mL di tubi PCR, a 95 ° C per 1 min. Mescolare 10 μL del tampone di frammentazione 2x RNA riscaldato con un campione di RNA da 10 μL pipettando verso l'alto e verso il basso. Incubare il campione a 95 ° C per 5 min. Interrompere la reazione facendo raffreddare la reazione sul ghiaccio.
- Trasferire e raggruppare le 2 reazioni di frammentazione in un tubo microfuge da 1,5 ml. Aggiungere alla soluzione 40 μL di acqua libera da nucleasi alla reazione, 10 μl di 3 M acetato di sodio, 1 μl di glicogeno e 300 μl di etanolo al 100% alla reazione di frammentazione. Incubare l'RNA a -20 ° C per almeno 1 h per precipitare l'RNA.
- Centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 xg per 30 minuti, rimuovere il surnatante e lavare l'RNA utilizzando 1 mL di etanolo al 70%.
- Centrifugare l'RNA a 20.000 xg per 15 minuti, remOve il surnatante e sciogliere l'RNA in 20 μl di acqua libera da nucleasi.
3. Selezione e eluizione di dimensioni RNA
- Aggiungere 20 μL di colorante di carica RNA al RNA recuperato nel tubo microfuge. Riscaldare l'RNA con il colorante di carica RNA a 95 ° C per 3 minuti e metterlo su ghiaccio per 2 min.
- Aggiungere 3 μL di colorante di carica RNA a 0,25 μL di scala del DNA da 10 nt in un tubo a microfuga. Scaldare la scaletta a 95 ° C per 3 minuti e metterlo su ghiaccio per 2 min.
- Caricare la scala denaturata e campioni su un gel di urea di TBE da 8,6 cm x 6,8 cm 6% e frazionare la dimensione con elettroforesi per 40 minuti a 180 V. Venga gelato il gel in 10 ml di tampone TBE contenente 1: 10.000 di macchie di gel di acido nucleico per 5 Min al buio.
- Puntare un tubo microfugo da 0,6 ml pulito in fondo usando un ago da 24 G e inserirlo in un tubo microfugo da 2 ml.
- Visualizzare le bande sul gel post-macchiato utilizzando un transilluminatore e tagliare una fetta di gel corrispondente a 90-110 nt. Trasferire la fetta di gel nel tubo microfuge da 0.6 ml forato nel tubo microfuge da 2 mL. La selezione di questa dimensione viene eseguita per consentire ai frammenti chimerici di avere una lunghezza minima per mappare il trascrittomato e di distinguere i prodotti legati alla prossimità rispetto ai prodotti non lucrati nei passaggi di selezione a valle.
- Centrifugare le fettine di gel a 12.000 xg a temperatura ambiente per 2 minuti per strappare la fetta di gel e raccogliere nel tubo microfuge da 2 mL. Scartare il tubo vuoto da 0,6 ml di microfuge. Aggiungere 700 μl di tampone di eluizione alla fetta di gel triturata nel tubo microfuge da 2 mL e incubare a 4 ° C per una notte con rotazione costante, per consentire la diffusione dei campioni nel tampone.
- Trasferire le fette di gel e il tampone di eluizione in un filtro a tubo di centrifuga e centrifugare a 20.000 xg per 2 min. Le fette del gel saranno intrappolate nel vano superiore del filtro. Scartare le fettine di gel e il vano superiore.
- Aggiungere 1 μl di glicogeno e 700 μl di 100% isopropanolo al filtrato nel tubo microfugo e precipitare l'RNA a -20 ° C per almeno 1 h o durante la notte.
Punto di pausa: RNA può essere precipitato in isopropanolo indefinitamente a -20 ° C. - Centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C per recuperare l'RNA. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo a freddo del 70% per lavare il pellet RNA. Centrifugare il pellet lavato a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 20 μL di acqua libera da nucleasi per risospendere l'RNA. Quantitate la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrometro UV.
Punto di pausa: L'RNA può essere conservato a -80 ° C dopo il congelamento in azoto liquido.
4. Arricchimento delle regioni di RNA Crosslinking
- Vortex streptavidina ha rivestito ampiamente i branelli magnetici per riposizionare le perle in modo omogeneo nel tubo. Trasferire 100 μL di branelli in un tubo da 1,5 ml di microfuge e metterlo su un magneteIc per 1 min per consentire alle perle di attaccarsi al lato magnetico del tubo. Rimuovere attentamente il tampone di memorizzazione dalle perle e togliere il tubo dal supporto del magnete.
- Aggiungere 1 mL di lysis buffer alle perle nel tubo microfuge e pipettare verso l'alto e verso il basso. Mettere le perline contenenti microfuge sul supporto magnetico per 1 min per separare le perle dal tampone di lavaggio. Ripetere questo per un totale di 3 lavaggi.
- Rimuovere il tampone di lavaggio dalle perle, posizionando i fori contenenti microfuge sul supporto magnetico per 1 minuto. Aggiungere l'inibitore della RNasi (1: 200) al tampone di lisi e aggiungere 100 μl di tampone di lisi ai branchi lavati nel tubo microfuge.
- Aggiungere 2 mL di bucido di ibridazione preparato di fresco, 1 mL di tampone di lisi addizionato, 1,5 μg di RNA frazionato di dimensioni e 100 μl di brani resuspendati in un tubo centrifugo conico da 15 mL. Vortex del tubo delicatamente.
- Incubare il tubo centrifugo conica da 15 ml a 37 ° C per 30 min con rotazione fine a fine.Preriscaldare il tampone di lavaggio a 37 ° C.
- Posizionare i tubi centrifugati conici da 15 ml su un supporto magnetico per 15 ml di tubi per 2 minuti per separare le sfere dal tampone. Pipettare con cura il tampone dal tubo e scartarlo.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio pre-riscaldato alle perle, pipettare verso l'alto e verso il basso e trasferire le perle in un tubo da 1,5 ml di microfuge. Incubare alle perline a 37 ° C per 5 minuti, con rotazione fine a fine.
- Centrifugare brevemente il contenuto del tubo microfugo. Posizionare le perline lavate da 1,5 ml in tubi a microfuga su un supporto magnetico per tubi da 2 ml per 1 min, per separare le perle dal tampone di lavaggio. Rimuovere il tampone dalle perle pipettando delicatamente il tampone dal tubo microfugo.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio pre-riscaldato alle perle e pipetta su e giù per ripetere il lavaggio. Eseguire un totale di 5 lavaggi. Alla fine del lavaggio del 5 ° , rimuovere il tampone di lavaggio posizionando i fori contenenti microfuge sul supporto magnetico1 minuto.
5. Ligation di prossimità
- Aggiungere 1 mL di tampone polinucleotide chinasi T4 a freddo (PNK) ai branchi lavati e incubare le perline per 5 minuti a 4 ° C, con rotazione fine a fine. Posizionare il tubo microfugo contenente le perle sulla striscia magnetica per un minuto e rimuovere delicatamente il buffer T4 PNK. Ripetere questo passaggio per un totale di 2 lavaggi e rimuovere il buffer PN4 T4 dopo l'ultimo lavaggio.
- Aggiungere i tamponi alle perle, secondo la tabella 1 . Per consentire che le estremità 3 'del frammento RNA siano legate a 3' adattatori di seguito, incubare le perle nel tampone a 37 ° C per 4 ore con agitazione costante per convertire il gruppo fosfato ciclico 3 'alla fine dell'RNA a 3 'OH.
- Aggiungere i buffers alla reazione precedente, secondo la tabella 2 . Per consentire l'5 'estremità dei frammenti RNA per essere competente, incubare la reazione a 37 ° C per 1 h con agitazione costante in presenza di ATP, Per convertire 5 'OH sul RNA a 5' fosfato.
- Aggiungere la tampone alla reazione precedente per eseguire la legatura di prossimità, secondo la tabella 3 . Incubare la reazione a 16 ° C per 16 h, con agitazione costante,
- Posizionare il microfuge contenente l'RNA ligato su un supporto magnetico per 1 minuto. Rimuovere con cura il surnatante e aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio a temperatura ambiente ai talloni. Riposizionare pipettando verso l'alto e verso il basso.
- Posizionare il tubo del microfugo sul supporto magnetico per 1 min e rimuovere attentamente il tampone di lavaggio. Eseguire un totale di 2 lavaggi e rimuovere il tampone di lavaggio dalle perle alla fine del secondo lavaggio.
- Aggiungere 100 μL di RNA PK Buffer alle perle e riposare pipettando verso l'alto e verso il basso. Riscaldare i campioni a 95 ° C per 10 minuti su un blocco termico.
- Far raffreddare il campione in ghiaccio per 1 min e aggiungere 500 μL di tiocianato-fenolo-cloroformio guanidino al campione. Mescolare vorticando vigorosamente per 10 s. Incubare il miscuglioA temperatura ambiente per 10 min.
Punto di pausa: RNA può essere immagazzinato in tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidina a -80 ° C per un paio di mesi. - Aggiungere 100 μl di cloroformio ai campioni estratti di guanidinium tiocianato-fenolo-cloroformio. Vortice vigorosamente per 10 s. Centrifugare i campioni a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C.
- Trasferire 400 μl dello strato acquoso in un nuovo tubo microfuge da 1,5 ml. Aggiungere 800 μL (2 volumi) di etanolo al 100% e mescolare pipettando verso l'alto e verso il basso.
- Trasferire la soluzione RNA alle colonne di pulitura RNA e recuperare l'RNA seguendo le istruzioni del produttore, assicurando che anche i piccoli RNA siano mantenuti. Eluire l'RNA in 100 μl di acqua priva di nucleasi.
Punto di pausa: L'RNA può essere conservato a -80 ° C dopo il congelamento in azoto liquido.
6. Reverse crosslinking di Psoralen biotinilato
- Trasferire il 100 μL di campioni eluiti in un pozzetto di un pozzetto di 24 pozzmangiò. Rimuovere la copertura e irradiare il campione sotto UV 254 nm, per 5 minuti in ghiaccio.
- Trasferire il campione reticolato retroscopico in un tubo microfugo pulito. Aggiungere 10 μl di acetato di sodio, 1 μl di glicogeno e 300 μl di etanolo al 100% e precipitare l'RNA a -20 ° C per almeno 1 h o durante la notte.
Punto di pausa: RNA può essere precipitato in etanolo a tempo indeterminato a -20 ° C. - Centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C per recuperare l'RNA. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo a freddo del 70% per lavare il pellet RNA.
- Centrifugare il pellet lavato a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 4,25 μl di acqua libera da nucleasi per risospendere l'RNA. Trasferire l'RNA in un tubo PCR da 0,2 ml.
Punto di pausa: L'RNA può essere conservato a -80 ° C dopo il congelamento in azoto liquido.
7. Trascrizione inversa e circolarizzazione cDNA
- Aggiungere 0,75 μLDi RNA linker (0,5 μg / μL) al campione riutilizzato in tubo PCR e scaldare a 80 ° C per 90 s. Posizionare il campione in ghiaccio per 2 min.
- Aggiungere i buffers al campione denaturato per la legatura adattatore 3 ', secondo la tabella 4 . Incubare la reazione a 25 ° C per 2,5 ore.
- Trasferire la reazione a un tubo microfuge da 1,5 ml. Aggiungere la reazione a 90 μL di acqua libera da nucleasi, seguita da 10 μl di acetato di sodio, 1 μl di glicogeno e 300 μl di etanolo al 100%. Precipitare l'RNA a -20 ° C per almeno 1 h o durante la notte.
Punto di pausa: RNA può essere precipitato in etanolo a tempo indeterminato a -20 ° C. - Centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C per recuperare l'RNA. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo a freddo del 70% per lavare il pellet RNA.
- Centrifugare il pellet lavato a 20.000 g per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere il tampone di lavaggio risospendere il pellet in 5 μL di nuclease free wAter.
- Aggiungere 5 μL di colorante di carica RNA al RNA recuperato nel tubo microfuge. Riscaldare l'RNA con il colorante di carica RNA a 95 ° C per 3 minuti e metterlo su ghiaccio per 2 min.
- Aggiungere 3 μL di colorante di carica RNA a 0,25 μL di scala del DNA da 10 nt in un tubo a microfuga. Scaldare la scaletta a 95 ° C per 3 minuti e metterlo su ghiaccio per 2 min.
- Eseguire la frazionamento di dimensione usando 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE gel urea come nei passaggi 3.3 e 3.4.
- Visualizzare il gel macchiato con macchia di acido nucleico utilizzando il transilluminatore e tagliare una fetta di gel corrispondente a 110-140 nt sulla scala. Trasferire la fetta di gel nel tubo microfuge da 0.6 ml perforato nel tubo microfuge da 2 ml e seguire il protocollo dai passaggi 3.6- 3.9.
- Aggiungere 5 μl di acqua libera da nucleasi per risospendere il pellet RNA. Trasferire l'RNA in un tubo PCR da 0,2 ml.
Punto di pausa: L'RNA può essere conservato a -80 ° C dopo il congelamento in azoto liquido. - Aggiungere 1 μl di primer RT a 1,2581; M all'RNA nel tubo PCR e scaldare a 80 ° C per 2 min. Posizionare il campione in ghiaccio per 2 min.
- Aggiungere i buffer per la trascrizione inversa secondo la tabella 5 . Incubare la reazione a 50 ° C per 30 min.
- Aggiungere 1,1 μL di 1 N NaOH alla reazione e scaldare a 98 ° C per 20 minuti. Mettere la reazione sul ghiaccio.
- Trasferire la reazione a un tubo microfuge da 1,5 ml. Aggiungere la reazione a 90 μL di acqua libera da nucleasi, seguita da 10 μl di acetato di sodio, 1 μl di glicogeno e 300 μl di etanolo al 100%. Precipitare il DNA a -20 ° C per almeno 1 h o durante la notte.
Punto di pausa: il DNA può essere precipitato in etanolo a tempo indeterminato a -20 ° C. - Centrifugare il DNA precipitato a 20.000 g per 30 minuti a 4 ° C per recuperare il DNA. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo a freddo del 70% per lavare il pellet di DNA. Centrifugare il pellet lavato a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere il tampone di lavaggio riposizionare la pellicolaLasciare in 5 μL di acqua libera da nucleasi.
- Eseguire la frazionamento di dimensione usando 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE gel urea come nei passaggi 3.3 e 3.4.
- Visualizzare il gel post-macchiato utilizzando il transilluminatore e tagliare una fetta di gel corrispondente a 200-240 nt sulla scala. Il cDNA trascritto trasversale è ora 96 basi più lungo del frammento RNA a causa dell'aggiunta del primer di 96 basi RT. Trasferire la fetta di gel nel tubo microfuge da 0.6 ml forato nel tubo microfuge da 2 mL.
- Centrifugare le fettine di gel a 12.000 xg a temperatura ambiente per 2 minuti per strappare la fetta di gel e raccogliere nel tubo microfuge da 2 mL. Scartare il tubo vuoto da 0,6 ml di microfuge.
- Aggiungere 700 μl di tampone di eluizione alla fetta di gel triturata nel tubo microfuge da 2 mL e incubare a 37 ° C per 2 ore con rotazione costante. Seguire il protocollo come descritto nei passaggi 3.7-3.8.
- Aggiungere 6 μl di acqua libera da nucleasi per risospendere il pellet di DNA. Trasferire il DNA in un tubo PCR da 0,2 ml.
- Aggiungere i buffers alla reazione per la circularizzazione del cDNA, secondo la tabella 6 . Incubare la reazione a 60 ° C per 1 h e scaldare a 80 ° C per 10 minuti per inattivare la reazione.
- Trasferire la reazione a un tubo microfuge da 1,5 ml. Purificare il cDNA circolare utilizzando una colonna di pulizia del DNA seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere 20 μL di acqua nulcile libera alla colonna per eluire il cDNA purificato.
Punto di pausa: il DNA può essere conservato a -20 ° C per un paio di mesi.
8. Amplificazione PCR (PCR a piccola scala)
- Aggiungere i buffer alla reazione secondo la tabella 7 per l'amplificazione PCR per testare il numero minimo di cicli necessari per l'amplificazione della biblioteca.
- Impostare le condizioni di ciclo di PCR secondo la tabella 8 . Sospendere la reazione e trasferire 5 μL diLa reazione PCR a 10, 15 e 20 cicli, in tubi separati da 1,5 ml di microfuge.
- Aggiungere 1 μL di colorante carica gel a DNA da 6x a ciascuna delle 5 μl di reazione PCR nei vari cicli. Eseguire l'elettroforesi gel su un gel agarosio del 3% a 120 V per 1 h per visualizzare i prodotti PCR.
- Utilizzare il numero più basso di cicli PCR (Y) che mostrano l'amplificazione a circa 250 basi (nella figura 3 vi è una banda forte a 15 cicli di amplificazione e una debole banda a 10 cicli. Generare abbastanza materiale per la sequenza profonda in quanto la quantità di cDNA utilizzata è di 10 volte quella di amplificazione PCR a piccola scala).
9. Amplificazione PCR (Large Scale PCR) e Purificazione
- Aggiungere i buffers alla reazione secondo la tabella 9 per l'amplificazione PCR per PCR di grandi dimensioni.
- Impostare le condizioni di ciclo di PCR in base aTabella 10 .
- Aggiungere 5 μl di colorante carica gel del DNA da 6x alla 25 μL di reazione PCR e caricare in un pozzetto di un gel agaroso del 3%. Caricare una scala del DNA di 1 kb più in un pozzetto separato. Eseguire l'elettroforesi a gel a 100 V, per 1,5 h.
- Visualizzare il gel completo con un transilluminatore UV.
- Dimensione estrarre una fetta di gel contenente prodotti PCR da 200- 300 basi e trasferire il gel in un tubo microfugo pulito da 2 ml.
- Aggiungere 1 ml di tampone di solubilità gel, da un kit di estrazione del gel di DNA, alla fetta di gel e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, o fino a quando il gel si dissolve, con agitazione costante.
- Aggiungere 200 μL di isopropanolo al gel dissolto e mescolare bene pipettando. Trasferire 700 μl del campione in una colonna di pulizia di estrazione del gel di DNA e centrifugare a 13.000 xg per 30 s. Tenere il trasferimento del campione disciolto alla colonna finché tutto il campione è stato caricato sulla colonna.
- Aggiungere 500 μL di tampone di solubilità in gel,Seguita da 700 μL di tampone di lavaggio in colonna, alla colonna, secondo il protocollo del produttore. Aggiungere 12 μL di acqua priva di nucleasi al centro della colonna per eludere il DNA. Punto di pausa: il DNA può essere conservato a -20 ° C.
- Quantitate la concentrazione del DNA usando la quantificazione fluorometrica. Se vengono create molteplici librerie e raggruppate insieme per il sequenziamento, aggiungere una quantità uguale di ciascun campione alla piscina, per la sequenza di rendimenti elevata.
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Representative Results
La figura 1 rappresenta lo schema del flusso di lavoro SPLASH. Dopo l'aggiunta di psoralene biotinilato in presenza di 0,01% di digitonina e di reticolazione UV, viene estratto un totale di RNA dalle cellule e viene eseguita una macchia di punti per assicurare che il collegamento a biotinilato con l'RNA sia accaduto in modo efficace ( Figura 2 ). Utilizziamo oligosini biotinilati 20 come controlli positivi per titolare la quantità di psoralen biotinilato da aggiungere alle cellule, in modo tale che circa 1 su ogni 150 basi sia reticolato.
Poiché altri eventi di duplicazione PCR tendono a verificarsi con un aumento dei cicli di amplificazione PCR, eseguiamo un'amplificazione PCR a piccole dimensioni usando diversi cicli di PCR per determinare il numero più basso di cicli di amplificazione che fornirà materiale sufficiente per la sequenza profonda. In un processo di preparazione della libreria efficiente siamoIn grado di amplificare una libreria di sequenziamento cDNA da un ingresso di RNA selezionato di dimensioni di 1,5 μg in meno di 15 cicli di amplificazione PCR ( Figura 3 ). La biblioteca viene quindi sequenziata usando 2x 150 base di letture in una macchina di sequenziamento ad alta velocità e le letture di sequenza vengono quindi elaborate secondo la pipeline computazionale di Figura 4 . Il risultato finale è un elenco di interazioni chimeriche filtrate che includono sia le interazioni RNA-RNA intramolecolari e intermolecolari nel transcriptome ( Tabella 11 ).
Figura 1 : Schema del flusso di lavoro sperimentale di SPLASH 15 . Le interazioni PNA-RNA all'interno della cellula sono reticolate utilizzando psoralene biotinilato sotto la luce UV a 365 nm. RNA incrociato è thEn estratto e frammentato a circa 100 basi. Le regioni di interazione che contengono i crosslinks psoralen biotinilati sono arricchiti da legame a branchi di streptavidina e legati insieme. In caso di reticolazione inversa sotto la luce UV a 265 nm, i RNA chimerici vengono poi clonati in una libreria cDNA per la sequenza profonda. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Controllo dell'efficienza di reticolazione biotinilata mediante blot di punti 15 . Dot blot di RNA reticolato psoralen biotinilato in vivo in presenza di 1% di digitonina. Diverse concentrazioni di RNA reticolato (20-2000 ng) sono scoperti sulla membrana. Diverse concentrazioni di biotinilati 20 basiOligo sono individuati come controlli positivi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Amplificazione biblioteca su piccola scala per SPLASH. 1 μL di cDNA dalla reazione RT viene utilizzato per PCR a piccola scala. Le reazioni vengono prelevate a 10, 15 e 20 cicli ed eseguite su un gel agarosico del 3% per determinare il numero minimo di cicli di amplificazione necessari per la generazione della libreria. In questo esempio specifico, 10 cicli di amplificazione usando 10 μL di cDNA in una grande reazione di PCR genereranno abbastanza ampliconi per la sequenza profonda.
| reagenti | Volume (μL) | Finale |
| Acqua libera da nucleasi | 64 | |
| Buffer 10x T4 PNK | 8 | 1x |
| Rnase Inibitore (20 U / μL) | 4 | 1 U / μL |
| T4 PNK (10 U / μL) | 4 | 0,5 U / μL |
| Totale | 80 |
Tabella 1: Reagenti per la riparazione a 3 '.
| reagenti | Volume (μL) | Finale |
| Reazione PNK | 80 | |
| Acqua libera da nucleasi | 3 | |
| Buffer 10x T4 PNK | 2 | 1x |
| 10 mM ATP | 10 | 1 mM |
| T4 PNK (10 U / μL) | 5 | 0,5 U / μL |
| Totale | 100 |
Tabella 2: Reattivi per la riparazione a 5 '.
| reagenti | Volume (μL) | Finale |
| Reazione PNK | 100 | |
| 10x T4 RNA ligase buffer | 6 | 1x |
| 10 mM ATP | 6 | 1 mM |
| Inibitore della Rnase (20 U / μL) | 4 | 0,5 U / μL |
| T4 Rnl1 (10 U / μL) | 40 | 2,5 U / μL |
| Nuclease freE acqua | 4 | |
| Totale | 160 |
Tabella 3: Reagenti per la legatura di prossimità.
| Componente | Importo per reazione (μL) | Finale |
| RNA e linker | 5 | |
| T4 Rnl2 buffer (10x) | 1 | 1x |
| PEG 8000 (50%, wt / vol) | 3 | 15% (wt / vol) |
| Inibitore della Rnase (20 U / μL) | 0.5 | 1 U / μL |
| T4 Rnl2 (tr) (200 U / μL) | 0.5 | 10 U / μ; L |
| Totale | 10 |
Tabella 4: Reagenti per la legatura dell'adattatore.
| Componente | Importo per reazione (μL) | Finale |
| Legatura e primer | 6 | |
| Tampone di primo strato (5x) | 2 | 1x |
| DNTPs (10 mM) | 0.5 | 0,5 mM |
| DTT (0,1 M) | 0.5 | 5 mM |
| Inibitore della Rnase (20 U / μL) | 0.5 | 1 U / μL |
| Transcriptasi inversa (200 U / μL) | 0.5 | 10 U / μL |
| Totale | 10 |
Tabella 5: Reagenti per la trascrizione inversa.
| Componente | Importo per reazione (μL) | Finale |
| CDNA di prima fascia | 6 | |
| Tampone ligasi DNA a singolo filamento (10x) | 1 | 1x |
| Betaina (5 M) | 2 | 1 M |
| MnCl 2 (50 mM) | 0.5 | 2,5 mM |
| Ligasi DNA a singolo filamento (100U / μL) | 0.5 | 5U / ml |
| Totale | 10 |
Tabella 6: Reagenti per la circularizzazione del cDNA.
| Componente | Importo per reazione (μL) | Finale |
| Prodotto del DNA ligato | 1 | |
| Acqua libera da nucleasi | 10.5 | |
| Miscela master del polimero DNA di High-Fidelity 2x | 12.5 | 1x |
| Primer universale PCR (10 μM) | 0.5 | 0,02 μM |
| Indice (X) Primer (10 μM) | 0.5 | 0,02 μM |
| Totale | 25 |
Tabella 7: Reagenti utilizzati per PCR a piccola scala.
| Passo | Temperatura | Tempo | cicli |
| Denaturazione iniziale | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturazione | 98 ° C | 10 s | |
| ricottura | 65 ° C | 30 s | 25 |
| Estensione | 72 ° C | 30 s | |
| Estensione finale | 72 ° C | 5 minuti | |
| tenere | 4 ° C | ∞ |
Tabella 8: Condizioni utilizzate per PCR a piccola scala.
| Componente | Importo per reazione (μL) | Finale |
| Prodotto del DNA ligato | 5 | |
| Acqua libera da nucleasi | 6.5 | |
| Miscela master del polimero DNA di High-Fidelity 2x | 12.5 | 1x |
| Primer universale PCR (10 μM) | 0.5 | 0,02 μM |
| Indice (X) Primer (10 μM) | 0.5 | 0,02 μM |
| Totale | 25 |
Tabella 9: Reagenti utilizzati per PCR su larga scala.
| Passo | Temperatura | Tempo | cicli |
| Denaturazione iniziale | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturazione | 98 ° C | 10 s | |
| ricottura | 65 ° C | 30 s | Y |
| Estensione | 72 ° C | 30 s | |
| Estensione finale | 72 ° C | 5 minuti | |
| tenere | 4 ° C | ∞ |
Tabella 10: Condizioni utilizzate per PCR su larga scala.
Tabella 11: Output analisi della pipeline computazionale. "SAM flag split read 1" = 0 indica che la lettura è mappata sul filo positivo del trascrittome. "Identità dell'RNA 1" si riferisce all'identità dell'RNA della sinistra della chimera. La "posizione iniziale RNA 1" si riferisce alla posizione iniziale al quale è stata mappata la lettura lungo l'RNA 1. "Posizione finale di RNA 1" si riferisce alla posizione finale alla quale viene mappata la lettura lungo l'RNA 1. Si riferisce "Mapping score split read 1" Al punteggio di mappatura della lettura che è stata mappata all'RNA 1. "Separazione di sigari letto 1"Indica il numero di basi che sono state ritagliate dalla lettura "S" e il numero di basi mappate alla lettura "M". "Split read 1" indica la sequenza che è stata mappata all'RNA 1. La stessa nomenclatura è stata utilizzata per il lato destro della chimera, denominata RNA 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.
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Discussion
Qui descriviamo in dettaglio il flusso di lavoro sperimentale e computazionale per SPLASH, un metodo che ci permette di identificare le interazioni RNA a due mani in modo genico-wide. Abbiamo utilizzato con successo SPLASH nelle colture batteriche, lieviti e umane e anticipo che la strategia possa essere ampiamente applicata a organismi diversi in diversi stati cellulari. Uno dei passaggi critici del protocollo è quello di iniziare con almeno 20 μg di RNA reticolato per avere materiale adeguato per i processi a valle. L'RNA viene quindi frammentato su 100 basi e selezionato in formato PAGE. Questi passaggi sono importanti per noi per arricchire preferenzialmente le chimere legate, piuttosto che i monomeri durante il processo di generazione della libreria. Di solito recuperiamo circa 1,5 μg di RNA dopo la frammentazione e la selezione di prima dimensione e l'RNA viene quindi convertito in una libreria cDNA secondo il flusso di lavoro SPLASH. Troviamo che questa quantità di RNA di partenza ci permette di generare materiale sufficiente per hSequenza di by-pass attraverso meno di 15 cicli di amplificazione PCR. Poiché il numero di eventi di duplicazione PCR aumenta drammaticamente con un aumento dei cicli di PCR, mantenere basso il numero di cicli di amplificazione è fondamentale per poter estrarre utili e chimere uniche nell'analisi a valle.
Contrariamente alle altre strategie basate su psoralene a livello genomico, SPLASH utilizza una versione biotinilata di psoralen per raggruppare frammenti RNA accoppiati da base a vicenda. Poichè abbiamo titolato la quantità di reticolazione a circa un reticolato per cento e cinquanta basi, possiamo arricchire per regioni RNA reticolate usando branchi di streptavidina dopo la frammentazione di RNA. Inoltre, eseguire reazioni enzimatiche mentre i RNA sono legati alle perle ci hanno permesso anche di eseguire scambi di tamponi e di lavaggi convenientemente. Tuttavia, una delle limitazioni della strategia è che il psoralen biotinilato è meno efficace a penetrare nelle cellule di psoralen o 4'-aminometil triOxsalen (AMT). In quanto tale, è fondamentale assicurare che il psoralen biotinilato sia entrato nelle cellule e ricollegato gli RNA in modo efficiente. Eseguiamo regolarmente macchie a punti su RNA reticolati e estratti, insieme a oligos biotinilati come controlli positivi, per garantire che i nostri RNA siano correttamente reticolati. Nel caso in cui il reticolazione sia debole, strategie per permeare la membrana cellulare, come l'aggiunta di basse concentrazioni di digitonina (allo 0,01%) per 5 minuti, possono essere utilizzate per consentire il psoralene biotinilato per entrare in modo efficiente le cellule. Poiché il psoralene assorbe alla stessa lunghezza d'onda degli acidi nucleici (UV 260 nm), usiamo tipicamente sistemi di quantificazione fluorometrica piuttosto che assorbimento UV per la quantificazione di RNA reticolato.
Una limitazione delle strategie di reticolazione basata su psoralene è che i psoralen preferiscono crosslinks alle uridine (U). Come tali, le regioni di abbinamento base che sono povere U potrebbero essere perse durante la reticolazione. Quindi, durante la rilevazione di un evento di reticolazione bTra due fili che forniscono prove che si verifica un'interazione, una mancanza di reticolazione non equivale a una mancanza di interazione. Nel nostro protocollo SPLASH, catturiamo piccole interazioni microRNA-mRNA e basse quantità di interazioni lncRNA. Poiché i mRNA legati al microRNA sono probabilmente ridotti a livello dell'espressione genica e i lncRNA sono tipicamente poco espressi, la loro scarsa rappresentazione nei nostri dati è dovuta principalmente alla profondità di sequenza insufficiente. Di solito sequenza almeno 200 milioni di letture finali accoppiate per ogni libreria di transcriptome umano per ogni replica. A questa profondità, la maggior parte dei nostri sequenziamenti ricade su RNA abbastanza abbondanti. Prevediamo che l'utilizzo di strategie di arricchimento per popolazioni specifiche di RNA migliorerà notevolmente il segnale per questi RNA abbondanti relativamente bassi. Un'altra sfida che abbiamo osservato nell'analizzare i dati chimerici è distinguere tra veri eventi chimerici interagenti contro le chimere generate da splicing. Per evitare la contaminazione oF splicing legge nella nostra lista chimerica, filtriamo via tutte le letture che sono vicine ai siti di splicing noti conosciuti nel transcriptome. Si prevede che con annotazioni di splicing più complete, l'elenco finale delle chimere diventerà ancora più accurato.
Diverso da strategie precedenti che si sono concentrate sulle interazioni RNA specifiche di una singola specie RNA o di una singola proteina di legame RNA, la capacità di SPLASH di mappare interazioni RNA-RNA in un modo genomico ampio per tutti gli RNA ci permette di studiare RNA di grande scala Reti di interazione e per identificare nuove interazioni RNA intramolecolari e intermolecolari per la prima volta. Utilizzando SPLASH, abbiamo ottenuto migliaia di interazioni intramolecolari e intermolecolari nei transcriptomi umani e nel lievito, permettendoci di intravedere nell'organizzazione e nella dinamica del interactome RNA in vivo . I progressi nell'integrazione di questi dati di interazione RNA a lungo raggio in algoritmi di modellazione della struttura RNA sono probabiliPerfezionare i nostri modelli attuali di organizzazione RNA in vivo . Incorporare SPLASH in algoritmi di previsione RNA intermolecolari, come i programmi di previsione snoRNA, possono anche migliorare l'accuratezza di queste previsioni. Prevediamo che futuri usi di SPLASH su altri organismi complessi e sistemi dinamici continueranno a far luce sulle complessità della regolazione genica basata su RNA in biologia.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del laboratorio di Wan e il laboratorio di Nagarajan per le discussioni informative. N.Nagarajan è supportato da finanziamenti da A * STAR. Y.Wan è sostenuto da finanziamenti da A * STAR e dalla Società in borsa Science-Branco Weiss.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20% SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2x RNA fragmentation buffer | |||
| 18 mM MgCl2 | |||
| 450 mM KCl | |||
| 300 mM Tris-Cl pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC |
|||
| RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
|||
References
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