Abstract
الخلايا المعاد برمجتها مشروط (مراكز التأهيل المجتمعي) توفر طريقة مستدامة لزراعة الخلايا الأولية والقدرة على تطوير "المصارف البيولوجية الحية" واسعة من المريض المستمدة من خطوط الخلايا. لأنواع عديدة من الخلايا الظهارية، وقد وصفت مختلف المناهج ثلاثية الأبعاد، (3D) الثقافة التي تدعم تحسين حالة متباينة. بينما مراكز التأهيل المجتمعي تحتفظ التزام نسبهم إلى الأنسجة التي تكون معزولة، فإنها تفشل في التعبير عن العديد من علامات التمايز المرتبطة الأنسجة الأصلية عندما نمت في ظل شرطين الأبعاد (2D) ثقافة العادية. لتعزيز تطبيق مراكز التأهيل المجتمعي المستمدة من المريض لأبحاث السرطان البروستاتا، وقد تم تحديد شكل ثقافة 3D تمكن السريع (2 أسابيع الإجمالي) اللمعية تمايز الخلايا في كل من الخلايا الظهارية البروستاتا العادية والمشتقة من الورم. هنا، يتم وصف شكل على أساس إدراج مرشح للزراعة والتفريق بين كل من مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا الطبيعية والخبيثة. وديويقدم وصفا الذيل من الإجراءات المطلوبة لجمع الخلايا وتجهيزها لتلطيخ المناعى ومناعي. بشكل جماعي شكل ثقافة 3D وصفها، جنبا إلى جنب مع خطوط اتفاقية حقوق الطفل الأساسية، يوفر متوسطة المهم تسليط نظام نموذجي الخرج للبحث البروستاتا القائم على biospecimen.
Introduction
تحديد واستخدام علاجات السرطان التي يتم الشخصية للأفراد هي الهدف الأساسي في أبحاث السرطان. مؤخرا، تم وضع مناهج جديدة تسمح لسهولة أكبر في إنشاء مزارع الخلايا الأولية، وتوفير يحتمل سبل كلا تحديد واختبار علاجات شخصية. على سبيل المثال، البروستاتا استنادا R-spondin-نهج عضوي الشكل 1 يسمح للثلاثي الأبعاد (3D) زراعة خلايا سرطان البروستاتا العادية والمنتشر في المصفوفة خارج الخلية التجارية (على سبيل المثال، Matrigel)، في حين أن مشروطة إعادة برمجة خلايا (CRC) طريقة وضعت في جورج تاون 2، 3 ويستخدم أكثر من الشروط ثقافة 2D القياسية. على وجه التحديد، والجمع بين كيناز رو (Y-27632) والخلايا الليفية تغذية الفئران J2 المشع يؤدي إلى زراعة غير محددة من مراكز التأهيل المجتمعي القرنية 2. منهجية اتفاقية حقوق الطفل هيقوية للغاية، مع خطوط الخلايا الأولية إنشاء بنجاح والحفاظ عليها إلى ما لا نهاية من البروستاتا وغيرها من العديد من الأنسجة الطلائية العادية والخبيثة 3. الأهم من ذلك، تكنولوجيا CRC لدينا سمحت للالتعرف السريع على أساس المسببة لحليمي الجهاز التنفسي المتكررة في المريض الذي قد فشل عدد من العلاجات الدوائية السابقة. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام مراكز التأهيل المجتمعي العادية والمشتقة من الورم، وافق على تحديد الناجح لادارة الاغذية والعقاقير المخدرات، vorinostat، قدم في غضون أسبوعين من خزعة الأنسجة الأولي. تم وضع المريض على vorinostat، مما أدى إلى نجاح العلاج من المرض (4).
وتتألف غدة البروستاتا الطبيعية من اللمعية، القاعدية والخلايا الغدد الصم العصبية النادرة 5. الخلايا اللمعية تشكل طبقة الطلائية للغدة وتعبر عن مستقبلات الاندروجين (AR)، فضلا عن غيرها من علامات اللمعية مثل cytokeratins 8 و 18 و المؤيدمستضد محددة للدولة (PSA) 6. على العكس من ذلك، يتم ترجمة الخلايا القاعدية تحت طبقة اللمعية والتعبير عن cytokeratin 5 و p63، ولكن انخفاض مستويات ع 5. لدينا 7، استخدمت 8 و 9 و 10 آخرين بنجاح مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا في التحقيقات حساسية العقاقير الميكانيكية قبل السريرية. ومع ذلك، عندما نمت في ظل ظروف زراعة الأنسجة 2D القياسية، تفشل هذه الخلايا بشكل كامل الانخراط AR يشير 10. الأهم من ذلك، عندما وضعت تحت كبسولة الكلى من الفئران العوز المناعي، استعاد مراكز التأهيل المجتمعي العادية البروستاتا العمارة غدي وظيفة مشيرا إلى أن مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا تحتفظ التزام نسبهم عند وضعها في بيئة متساهلة. تطوير نظام زراعة الخلايا استنادا إدراج مرشح الموصوفة هنا تسمح لالسريعة (2 أسابيع) في المختبر التفريق بين مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا وب يتضحذ زيادة التعبير عن الجينات المستهدفة AR AR وكذلك انخفاض مستويات p63.
لإدراج مرشح المستخدمة تحتوي على أغشية البولي (حجم المسام، 0.4 ميكرومتر) التي يمكن أن تدعم زراعة الخلايا الثديية. النظام، كما وضعت، يجعل من استخدام مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا الطبيعية والخبيثة، أطباق ثقافة 6 جيدا وإدراج مرشح. وسائل الإعلام ثقافة الخلية مكيفة من قبل خلايا J2 11 يوضع في الغرفة والبروستاتا التفريق وسائل الإعلام القاع في الغرفة العليا. وصف تقنيات تدعم هذه الوثيقة البروستاتا اللمعية تمايز الخلايا في إطار زمني 2 الأسبوع، بما يتفق مع أهداف الطب الشخصي. وكان أيضا لا بد من تطوير المنهجيات التي تسمح للتنميط شامل الجزيئي، وراثي والخلوية من الثقافات. وقد تم تطوير المناهج لعزل DNA و RNA والبروتين من الخلايا التي صدرت من سطح مرشح ومبسطة لتجهيز العينات دقيقة تكرار. فيناLLY، والمنهجية اللازمة لإزالة مرشح لتمكين التضمين، باجتزاء ول H & E، المناعى وتلطيخ مناعي، يتم وصفه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنشاء خلية 3D الثقافة إدراج نظام
- ضع إدراج ثقافة خلية 2 البولي في التوجه المقلوب (فلتر جانب متابعة) بانخفاض في 6 لوحة جيدا (الشكل 1A).
- تطبيق طبقة رقيقة من 0.1٪ الجيلاتين في الماء إلى الجانب السفلي من إدراج والسماح ليجف (10-20 دقيقة) في خزانة السلامة البيولوجية للحفاظ على عقم.
- كرر الخطوة 1.2 مرتين أخريين ليصبح المجموع 3 طلبات من الجيلاتين 0.1٪ على إدراج.
ملاحظة: سوف طلاء الجيلاتين يساعد حد الانتشار بين الغرف. - لجمع مراكز التأهيل المجتمعي الأولية من الظروف والثقافة القياسية، إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني لغسل القارورة الثقافة.
- يعرض للتريبسين الخلايا باستخدام (1 مل لT-25 و 2 مل لT-75) 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. اضغط برفق على جانب من قارورة للمساعدة في طرد الخلايا. ثم المضي قدما لوقف رد الفعل التربسين، وجمع الخلايا عن طريق إضافة 5 مل من DMEM كاملة.
- تجميع خلايا في أنبوب 15 مل. أنبوب الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 188 x ج والعد باستخدام عداد الخلية الآلي أو عدادة الكريات.
- اعادة تعليق 600،000 مراكز التأهيل المجتمعي في 250 ميكرولتر مكيفة وسائل الاعلام (CM) وإضافة إلى المنحى بشكل صحيح (الجانب مرشح لأسفل) إدراج الثقافة (الشكل 1B). هذا ويشار إليها باسم الغرفة الداخلية.
ملاحظة: CM هو F-وسائل الإعلام مشروطة خلايا J2 المشع ويحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 كما هو موضح سابقا 7، 8، 9، 11.
- تطبيق 2 مل من سم إلى الغرفة الخارجية للوحة 6 جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل (لمدة 18 ساعة على الأقل).
- إزالة بعناية سم في الغرفة الداخلية مع 1 مل أو ماصة 200 ميكرولتر وإضافة ببطء وسائل الإعلام التمايز (DM) إلى الغرفة الداخلية مع مل ماصة 1 حتى الشبع. كن حذرا حتى لا تعكر صفو طبقة الخلايا.
- تحقق ثقافات كل يوم. تظهر الخلايا السليمة كما هو مبين في الشكل 2.
- تغيير سم في الغرفة الخارجية كل يوم او كل يومين اعتمادا على عملية الأيض في الخلايا.
- عندما وسائل الإعلام من داخل يتغير لون الغرفة (الصفراء)، وإزالة بعناية وسائل الإعلام على غرفة مرشح الداخلية مع 1 مل أو 200 ماصة ميكرولتر.
- نضح في وسائل الإعلام في غرفة وحة جيدا الخارجي 6 مع تلميح الشفط.
- باستخدام ماصة 1 مل، وتطبيق ببطء DM جديدة للغرفة الداخلية حتى الشبع. يجب الحرص على عدم كشط أو إزاحة طبقة الخلايا.
- استبدال وسائل الإعلام في غرفة الخارجي مع 2 مل من CM جديدة.
- الحفاظ على الثقافات لمدة 2 أسابيع، ومن ثم الشروع في معالجة لعزل ثنائي الجزيء المطلوب.
ملاحظة: كل صف في لوحة 6 جيدا، ما مجموعه ستة إدراج (الشكل 1B)، يجب أن تتم معالجتها في التجربة للحصول على ما يكفي من الخلايا لDNA، RNA أو البروتين للتحليل. - وسائل الاعلام نضح في الغرفة الخارجية وشطف مع 2 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- إزالة بعناية وسائل الإعلام من الغرفة الداخلية مع 1 مل أو 200 ماصة ميكرولتر وإضافة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. تجنب إلغاء أو إزعاج وإلا فإن الخلايا على الغشاء.
- نضح في برنامج تلفزيوني من الغرفة الخارجية وإزالة بعناية برنامج تلفزيوني من الغرفة الداخلية مع 1 مل أو 200 ماصة ميكرولتر. مرة واحدة تمت إزالة برنامج تلفزيوني، الانتقال مباشرة إلى التطبيق المناسب المفصلة أدناه. لا تسمح للغشاء لتجف. ثقافة يمكن أن تبقى لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني حتى الطلب على استعداد للبدء.
3. معالجة المرشحات لبيليه المصرفية
- إضافة 100 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA لكل غرفة الداخلية واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- لفترة وجيزة وبعناية تحرض / تتخلص من الخلايا على سطح الغشاء مع ماصة 200 ميكرولتر في حين pipetting صعودا وهبوطا (تجنب puncتورينج الغشاء). احتضان لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 250 ميكرولتر من سم إلى أول الغرفة الداخلية وماصة صعودا وهبوطا بلطف لشطف التصفية.
- نقل معلق الخلايا إلى غرفة مرشح المجاورة التي تحتوي على الشروط وسائل الإعلام نفسها وتكرار pipetting صعودا وهبوطا.
- كرر هذا الإجراء لكل من يدرج في حالة واحدة. جمع ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
- شطف كل الغرفة الداخلية مع 100-200 ميكرولتر إضافية من سم إلى جمع أي الخلايا المتبقية. إضافة إلى أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي في الخطوة 3.5.
- تدور الخلايا في 423 x ج في microcentrifuge عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف ويغسل بيليه الخلايا مرة واحدة مع 1000 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني.
- تدور مرة أخرى في 423 x ج في microcentrifuge عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- نضح في برنامج تلفزيوني وتجميد في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
4. معالجة المرشحات لRNA أو DNA عزل
- وبما أن المرشح قد تنأى من إدراج، وغسل غشاء فلتر نأت من قبل pipetting الحل استخراج صعودا وهبوطا. جمع أكبر قدر من كاشف استخراج ممكن عن طريق إمالة لوحة 6 جيدا والشفط أي السائل المتبقي.
5. معالجة المرشحات لعزل بروتين
- ضع إدراج مرشح في لوحة 6 جيدا على الجليد. إلى الغرفة الداخلية، إضافة 10 ميكرولتر من العازلة البروتين تحلل تستكمل مع 1 ملم فلوريد الصوديوم (ناف)، 1 ملم الصوديوم فانادات (NAV)، و 100 ملي dithiothreitol (DTT) و 100 ميكرولتر من الكوكتيل مكافحة البروتيني.
- تستنهض الهمم / تتخلص من الخلايا على سطح الغشاء مع ماصة 20 ميكرولتر في حين pipetting صعودا وهبوطا. تجنب توليد فقاعات في المنطقة العازلة تحلل.
- احتضان لوحة 6 جيدا مع إدراج مرشح على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- كرر كشط ثم شطف سطح الغشاء مع تحلل العازلة.
- جمع لست] من 6 إدراج ونقل إلى أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي على الجليد.
- شطف الغشاء الأول مع 10 ميكرولتر إضافية من تحلل العازلة ونقل إلى تصفية المقبل.
- كرر الخطوة 5.6 لجميع الملاحق، وجمع أي حل العازلة تحلل المتبقية وإضافة إلى أنبوب 1.5 مل (الخطوة 5.5).
- احتضان العينة على الجليد لمدة 5 دقائق إضافية.
- تدور في أقصى سرعة (16873 x ج في أعلى الجدول الطرد المركزي) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- ماصة المحللة طاف في الطازجة 1.5 مل أنبوب.
- انتقل إلى تحليل تركيز البروتين أو ستوإعادة لست] في -80 درجة مئوية.
6. تجهيز لH & E والمناعية تلطيخ
- إضافة 500 ميكرولتر و 1 مل من 10٪ بنك الفجيرة الوطني (محايد مخزنة الفورمالين) إلى الغرفة الداخلية والخارجية والسماح احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- نضح بنك الفجيرة الوطني من الغرفة الخارجية وإضافة 1 مل هيدروكسي الاغاروز (هيئة التعليم العالي) معالجة هلام إلى 1.5 مل الطرد المركزي. تذوب ببطء الاغاروز في الميكروويف باستخدام الطاقة المنخفضة وكرر 10-20 الصورة البقول حتى ذاب الاغاروز.
- حافظ على هيئة التعليم العالي في حمام دافئ 37 درجة مئوية إلى منع التصلب حتى جاهزة للاستخدام.
- إزالة بنك الفجيرة الوطني من الغرفة الداخلية وتطبيق 25 ميكرولتر من هيئة التعليم العالي المنصهر إلى الغرفة الداخلية والسماح للالاغاروز ليصلب لمدة 2-5 دقيقة.
- الرطب منصات الأنسجة 2 رغوة في 10٪ بنك الفجيرة الوطني وتضع وسادة واحدة في كاسيت تضمينها (انظر الشكل 3D).
- استخدام شفرة مشرط رقم 11 (التي لديها حادة جدا، شفرة غرامة الرؤوس) ليسجل مرشح من الجانب السفلي للإدراجغرفة، والإفراج جزئيا عليه من الغرفة إدراج البلاستيكية.
- ضع كمية صغيرة (100-200 ميكرولتر) من بنك الفجيرة الوطني في طبق بتري وتزج مرشح فكها جزئيا في بنك الفجيرة الوطني (الشكل 3A).
- بشفرة مشرط رقم 10، اضغط بلطف على منتصف مرشح، من داخل غرفة ملحقة، لإزاحة الكامل لمرشح من إدراج برميل (الشكل 3B). إذا كان هناك أي جزء من التصفية التي لا تزال تعلق على برميل، قطع مع مشرط.
- قطع مرشح المغلفة هيئة التعليم العالي في نصف مع # 10 مشرط شفرة (الشكل 3C).
- وضع كل نصف من مرشح على وسادة رغوة في الكاسيت الأنسجة أعد في خطوة 6.4 (الشكل 3D).
- إضافة الثاني 10٪ بنك الفجيرة الوطني الإسفنج غارقة في الكاسيت، يقحم التصفية.
- التقط ختم كاسيت، مكان في بنك الفجيرة الوطني، واحتضان بين عشية وضحاها.
- مرشحات العملية إلى كتل البارافين لباجتزاء وتلطيخ كماسبق وصفها 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نظام إدراج الثقافة خلية مقرها هو إجراء بسيط نسبيا وسريع لإنتاج الثقافات 3D من مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا التي تدعم تمايز الخلايا اللمعية. ويرد التخطيطي للنظام (الشكل 1A) تسليط الضوء على تطبيق طلاء الجيلاتين على السطح السفلي من إدراج مرشح. وألغت إدراج فقط لتطبيق الجيلاتين. في الشكل 1B من المرشحات في الاتجاه المناسب للزراعة. باستخدام إدراج خلية شفافة، يتم عرض صورة تمثل ثقافة البروستاتا CRC صحية 3D (10X) (الشكل 2). طبقات كثيفة من مراكز التأهيل المجتمعي صحية أثبتت نموذجية بعد إنشاء ويمكن تصور باستخدام معيار المجهر الضوئي. أثناء إنشاء الأولي، فمن الأهمية بمكان أن تصور طبقة من الخلايا التي شكلت لضمان أن الأسلوب هو متوافق مع خط خلية معينة وذلك المرفق المناسب ولاوقعت يرينج من الخلايا.
يتم تطبيق هيئة التعليم العالي إلى الداخل من إدراج النحو المبين أعلاه. بعد تطبيق هيئة التعليم العالي، يجب توخي الحذر عند تسجيله مرشح لإخراجه من (3A الأرقام، 3B) إدراج. في جميع الخطوات (أرقام 3A-3D)، كما يجب الحرص على تقليل حركة لا لزوم لها طبقة هيئة التعليم العالي على مرشح مع الخلايا. طبقة CRC يمكن أن تتعطل بسهولة وتضررت خلال نقلها إلى H & E كاسيت (الشكل 3D). بعد استئصال مرشح المغلفة هيئة التعليم العالي، من البرميل البلاستيك (أرقام 3A-3C)، ومرشح يمكن أن يكون النصف وتجهيزها لباجتزاء وتلطيخ باستخدام أشرطة تضمين القياسية (الشكل 3D). تقسيم مرشح في نصف المهم تحقيق أقصى قدر من السطحية المتاحة لباجتزاء عبر عن H & E وIF.
مناعي تلطيخوكذلك حقل مشرق (BF) تم جمع الصور من الخلايا المستزرعة على طبقة تصفية باستخدام المجهر مع DSU (القرص وحدة المسح الضوئي) القرص الغزل قدرات مبائر. وتظهر نتائج تمثيلية للالأنسجة و H & E تلطيخ في المقطع العرضي للإدراج مرشح والخلايا (20X) (الشكل 4). مع الرعاية المناسبة، علينا أن نبرهن على طبقة اتفاقية حقوق الطفل المتعلق إدراج مرشح يمكن مقطوع وملطخة، كما هو الممارسة القياسية لالأنسجة الأنسجة. خلال باجتزاء، فمن الممكن لمراكز التأهيل المجتمعي لتصبح بعيدة عن تصفية كطبقة سليمة من الخلايا كما هو موضح (الشكل 4). تظهر الصورة BF طبقات الخلايا متعددة المستويات على قمة غشاء مسامي (الشكل 5A). وتظهر الصور الفردية الفلورسنت لالنوى (دابي، الشكل 5B)، p63 (الشكل 5C) وAR (الشكل 5D)، كما هو دمج جميع علامات مضان الثلاثة (الشكل 5E). وأخيرا، فيوزاتالبريد BF وإذا ثبت تراكب (الشكل 5F)، وإنشاء توطين إشارة مضان نسبة إلى الخلايا والتصفية. تراكب من وصمة عار دابي مع p63 إذا تلطيخ يدل بوضوح على بعض الخلايا لا تزال في حالة التكاثري. توطين AR إذا تلطيخ في النواة يدل على تنشيط الوظيفي للAR في خلايا البروستاتا.
وتعرض مقارنة بين الإطار المتكامل للنظام إدراج مرشح لدينا وأنسجة البروستاتا مقطوع (أرقام 6A، 6B) للتدليل على التشابه في تطوير لدينا طبقة إدراج اتفاقية حقوق الطفل على أن الظهارة البروستاتا. يظهر القناة البروستاتا التعبير من p63، بما يتفق مع خلايا البروستاتا القاعدية. وينظر الى تلطيخ p63 أيضا في مراكز التأهيل المجتمعي على إدراج. ولوحظ وجود أعلى نسبة p63 معربا عن الخلايا في إدراج لدينا مقارنة مع قسم الأنسجة سليمة. وبالإضافة إلى ذلك، تعتبر كل من الطاقة النووية وAR حشوية في تيس البروستاتا مقاضاة القسم وبينما ينظر إلى مراكز التأهيل المجتمعي على إدراج مرشح تظهر التعبير AR أقل عموما، سواء التعبير AR النووي وتلطيخ حشوية، على غرار البروستاتا سليمة.
الشكل 1: صور التمثيلية للصحن الثقافة 6 جيدا وإدراج التي تشكل نظام الثقافة 3D. (أ) إدراج مقلوب لتطبيق طلاء الجيلاتين على الجانب السفلي من مرشح (السهم). صورة أكبر من إدراج والمرشح هو عرض (الشكل). (ب) إدراج وضعها بشكل صحيح. وتظهر الدوائر الداخلية والخارجية للنظام (السهام). ويظهر في الصف محاصر في B كيف عينات متعددة يتم الحصول عليها لحالة تجريبية معينة. في ختام فترة النمو 2 الاسبوع هذه الملاحق يمكن تجميع لانتاج مادة كافية للتحليل."الهدف =" _ فارغة "> الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم عرض صورة تمثل طبقة من الصحة مراكز التأهيل المجتمعي المصنفة على الأغشية تصفية شفاف: الرقم 2. مجلسي الداخلية والخارجية الواردة سائل الإعلام مكيفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: صورة التمثيلية للمرشح النصف إلى قسمين وضعت في كاسيت البارافين لتضمينها. (A) تصفية تضاف مع طلاء هيئة التعليم العالي بعد تسجيله وقبل الإزالة. (ب) صدر مرشح إدراج من برميل البولي. (
الرقم 4: الممثل H & E القسم الملون صليب إدراج تصفية وخلايا (20X). كلاهما أظهرت الغشاء (القاع) وطبقة الخلايا (أعلى). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: سلسلة من الميدان الممثل برايت (BF) والمناعي (IF) صورخلايا مقطوع على تصفية (40X). وأظهرت المقاطع العرضية للمرشح والخلايا. ويرافق صورة BF غير ملوثين من الخلايا على سطح المرشح (5A) من خلال الصور للنواة دابي الملون (5B) وتلطيخ مناعي لاثنين من البروتينات المختلفة، p63 (5C) ومستقبلات الاندروجين (AR، 5D). تراكب مركب من أقسام الخلية (5E، F) يحدد توطين إشارات IF في سياق الخلايا والتصفية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6: الممثل المناعي (IF) صورة من الخلايا مقسم على تصفية مقابل القسم البروستاتا الظهارة من الأنسجة (20X).وأظهرت صورة مقطعية للمرشح إدراج لدينا (الشكل 6A) مقارنة مع طبقات الظهارية الأقنية من البروستاتا سليمة (الشكل 6B). تلوين p63، تم إجراء AR والنواة كما في الشكل (5). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوط الخلايا الأولية هي منصة هامة والتطور السريع لأبحاث السرطان. نظام الثقافة 3D على أساس إدراج الثقافة يدعم التفريق بين مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا الابتدائية في إطار زمني لمدة أسبوعين. يمثل طريقة تصفية اتفاقية حقوق الطفل، طريقة الإنتاجية المتوسطة جديد للبحث البروستاتا. القائمة نماذج الماوس PDX هي مضيعة للوقت ومكلفة للغاية، والعديد من العينات PDX لا يمكن زراعتها في الثقافة، والحد من التجريب بدأ المحقق وفائدتها. وبالإضافة إلى ذلك، في حين تختلف معدلات نجاح إنشاء PDX كثيرا 13، وطريقة CRC لديها نسبة عالية من النجاح في إنشاء خطوط الخلايا 3. ونحن نعتبر النظام لدينا ليكون مكملا لنهج عضوي الشكل البروستاتا استنادا R-spondin؛ ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن عدم النجاح فيما يتعلق بإنشاء organoids من سرطان البروستاتا الابتدائية 14. بالإضافة إلى ذلك، وسائل الإعلام، وطرق إنشاء،وصيانة مراكز التأهيل المجتمعي هي أبسط بكثير من البروستاتا نهج عضوي الشكل القائم R-spondin. وكميزة إضافية، ومراكز التأهيل المجتمعي لا يمكن إنشاء واستخدامها لاختبار مطابقة الثقافات العادية وورم لإجراء المقارنات الجزيئية مباشرة.
ولا تزال بعض المسائل الفنية التي يتعين معالجتها عند وضع هذا النظام. أولا، تطبيق طلاء الجيلاتين على الجانب السفلي من مرشح إدراج يساعد، ولكن لا تلغي ونشرها في وسائط الإعلام عبر الغشاء. وتستخدم وسائل الاعلام التغييرات المتكررة للحفاظ على التدرج منها التمايز (العلوي أو قمية طبقة الخلايا) مقابل نمو (الطبقة السفلى أو القاعدية من الخلايا) الأوضاع داخل الغرفة. ثانيا، تحتاج الناجحة الثقافات 3D CRC عالية نسبيا كثافة الخلية البذر. أسفرت أقل كثافة البذر النتائج السيئة فيما يتعلق بسلامة طبقة الخلايا التي تنشأ على سطح المرشح. هذا هو الاعتبار السليم عند زراعة مراكز التأهيل المجتمعي، لأنها تنمو على نحو أكثر نشاطا عندما حافظت علىر كثافات عالية الخلية. وأخيرا، فإن إزالة المناسبة ولاحق تضمين البارافين من طبقة الخلايا سليمة حاسمة لتحديد مدى تمايز الخلايا. إضافة هيدروكسي الاغاروز (هيئة التعليم العالي) على حد سواء انخفض فقدان الخلية وتحسين الصرف الكلي للخلايا مقارنة مع مرشحات غير مضمنة (لا يظهر). مرة واحدة جزءا لا يتجزأ بشكل صحيح، ومقطوع المرشحات ومعالجتها بطريقة لا يمكن تمييزها من عينات الأنسجة والخلايا العادية.
نحن مجرد بداية لمحاكاة الهندسة المعمارية للظهارة البروستاتا باستخدام هذه الطريقة التصفية. هناك ما يبرر تعديلات إضافية للشروط الثقافة والإعلام والركيزة التي يمكن معالجتها بسهولة. على سبيل المثال، إعادة صياغة سائل الإعلام التمايز التي قد تشجع أفضل اللمعية مقابل التمايز القاعدية يمكن اختبار بسرعة. منذ تم تنفيذها عدوى lentiviral من مراكز التأهيل المجتمعي بالسهولة مع الخلايا السرطانية التجارية (7) و2D مراكز التأهيل المجتمعي لديهم آللذلك تم transfected مع ناقلات CAS9 / كريسبر الجينات تكنولوجيا التحرير لتعديل جينوم الخلية (لا تظهر البيانات)، وتأثير الجينات الطافرة، حذف أو إصلاح يمكن اختبارها بشكل دائم. وبالمثل، يمكن تتبع النسب من الممكن عن طريق إدخال نسب الجينات مراسل محددة.
بالإضافة إلى تغيير وسائل الإعلام أو الخلايا، تعديلات على سطح مرشح يمكن أيضا اختبار. تختلف ركائز غشاء فلتر المتاحة تجاريا. وبالإضافة إلى ذلك، فقد وجدنا أن المصفوفة خارج الخلية التجارية يوفر بيئة نمو مناسبة عندما تطبق على الداخل من التصفية. باعتبارها واحدة من أهداف نظام إدراج هو نموذج أفضل المكروية البروستاتا، وربما التعديلات الأكثر إثارة للاهتمام يمكن أن تكون مقدمة من خلايا انسجة طبيعية أو المستمدة من الورم، إما في ثقافة مشتركة مع مراكز التأهيل المجتمعي في كنف إدراج أو في الغرفة السفلى إلى حالة وسائل الإعلام نمو. تعديل إدراج جيدا مع أقسام سو أنسجة البروستاتا decellularized ممكنة أيضا. في هذا النهج، يمكن أن انسجة / التفاعلات الظهارية تسمح الخلايا الأولية لاستخدام الأنسجة decellularized بمثابة سقالة للنمو.
إن القدرة على تأسيس الخلايا الأولية وتوفير وقت لاحق شروط المفاضلة الخاصة بهم هي الصيغة المثالية لإجراء المزيد من البحوث ذات الصلة بيولوجيا في التنمية غدي العادية ولأبحاث السرطان. النظام الموصوفة هنا يوفر منصة التي من خلالها عدد غير محدود من أنواع الخلايا والتعديلات يمكن الجمع بين لتكييف النظام لاحتياجات التجريبية الفردية وجمع موثوق العينات للتحاليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل T32 (CA 9686-18) وTL1 (TL1TR001431) جوائز تدريب ما بعد الدكتوراه منحة (LT)، وزارة الدفاع PC140268 (CA)، W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA)، وكذلك U01 PAR-12-095 (كومار) وCA051008-21 P30 (وينر). تم إجراء تثبيت العينة، باجتزاء وتلطيخ في لومباردي الشامل للسرطان مركز علم الأنسجة والموارد المشتركة الأنسجة. نشكر ريتشارد شليغل لإجراء مناقشات مفيدة. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T.
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
