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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un système de culture 3D basé sur Insérer Filtre rapide pour Prostate primaire Différenciation Cellulaire

Published: February 13, 2017 doi: 10.3791/55279
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Oncology, Lombardi Comprehensive Cancer Center, 2Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

Abstract

cellules conditionnellement reprogrammées (CRC) fournissent une méthode durable pour la culture cellulaire primaire et la capacité de développer de vastes "biobanques de vie» des patients provenant des lignées cellulaires. Pour de nombreux types de cellules épithéliales, diverses approches en trois dimensions (3D) de la culture ont été décrits qui soutiennent une amélioration de l'état différencié. Alors que CRCs conservent leur engagement lignée du tissu à partir duquel ils sont isolés, ils ne parviennent pas à exprimer un grand nombre de marqueurs de différenciation associés au tissu d'origine lorsqu'elles sont cultivées dans deux conditions (2D) de la culture tridimensionnelle normale. Afin d'améliorer l'application des CRCs patient dérivées pour la recherche sur le cancer de la prostate, un format de culture 3D a été défini qui permet une différenciation rapide (2 semaines au total) luminale des cellules dans les cellules épithéliales prostatiques normales et tumorales dérivées. Ici, un format à base d'insert de filtre est décrit pour la culture et la différenciation des deux CRCs de la prostate normales et malignes. A deDescription queue des procédures requises pour la collecte des cellules et le traitement pour la coloration immunohistochimique et immunofluorescence sont fournis. Collectivement, le format de la culture 3D est décrit, combiné avec les lignes primaires CRC, fournit un moyen important pour High- système modèle débit pour la recherche de la prostate sur la base des échantillons biologiques.

Introduction

L'identification et l'utilisation des thérapies du cancer qui sont personnalisés aux personnes sont un objectif primordial dans la recherche sur le cancer. Récemment, de nouvelles approches ont été développées qui permettent une plus grande facilité dans la mise en place de cultures de cellules primaires, ce qui pourrait fournir des moyens à la fois identifier et tester des thérapies personnalisées. Par exemple, la prostate à base de R-spondine approche organoïde 1 permet en trois dimensions (3D) la culture des cellules cancéreuses de la prostate normales et métastatiques dans une matrice extracellulaire commercial (par exemple, le Matrigel), tandis que la méthode conditionnellement reprogrammant des cellules (CRC) développé à Georgetown 2, 3 utilise plus des conditions de culture 2D standard. Plus précisément, la combinaison d'un inhibiteur de la Rho kinase (Y-27632) et de cellules irradiées J2 nourricières de fibroblastes de souris conduit à la mise en culture indéfinie CRCs de kératinocytes 2. La méthodologie CRC estextrêmement robuste, avec des lignées cellulaires primaires avec succès établies et maintenues indéfiniment de la prostate et d'autres tissus épithéliaux normaux et malins 3. Surtout, notre technologie CRC a permis l'identification rapide de la base étiologique de papillomatose respiratoire récurrente chez un patient qui avait échoué un certain nombre de traitements médicamenteux précédents. En outre, en utilisant CRCs normales et tumorales dérivées, l'identification réussie d'un médicament approuvé par la FDA, le vorinostat, a été faite dans les deux semaines de la biopsie initiale du tissu. Le patient a été placé sur le vorinostat, ce qui entraîne le traitement réussi de la maladie 4.

La glande prostatique normale est constituée d'luminale, la base et les rares cellules neuroendocrines 5. luminale des cellules forment la couche épithéliale de la glande et expriment le récepteur d'androgène (AR), ainsi que d'autres marqueurs tels que luminal cytokératines 8 et 18 et proantigène spécifique de l' état (PSA) 6. A l' inverse, les cellules basales sont localisés sous la couche luminale et expriment la cytokératine 5 et p63, mais de faibles niveaux de l'AR 5. Nous 7, 8, 9 et 10 autres ont utilisé avec succès CRC de la prostate dans précliniques mécanistes enquêtes de sensibilité aux médicaments. Toutefois, lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions de culture tissulaire standard 2D, ces cellules ne parviennent pas à engager pleinement un EA de signalisation 10. Il est important, lorsqu'il est placé sous la capsule rénale de souris immunodéficientes, le CRC a repris l'architecture glandulaire de la prostate normale et la fonction indiquant que les CRC de la prostate conservent leur engagement de lignage lorsqu'il est placé dans un environnement permissif. La mise au point du système de culture de cellules à base d'insert de filtre décrit ici permet aux rapides (2 semaines) la différenciation in vitro de CRCs de la prostate comme le montre by l'augmentation de l'expression des gènes cibles et AR AR ainsi qu'une diminution des niveaux de p63.

Les éléments filtrants utilisés contiennent des membranes de polycarbonate (taille des pores 0,4 um) qui peuvent supporter la culture de cellules de mammifères. Le système, tel que développé, utilise des CRCs de la prostate normales et malignes, des boîtes de culture de 6 puits et les éléments filtrants. Milieux de culture cellulaire conditionnés par des cellules J2 11 est placé dans les médias de fond la chambre et de la prostate différenciation dans la chambre supérieure. Les techniques décrites ici soutiennent la différenciation des cellules de la prostate luminale dans un délai de 2 semaines, compatible avec les objectifs de la médecine personnalisée. Il était également impératif de développer des méthodes qui permettent le profilage moléculaire, génétique et cellulaire complète des cultures. Approches pour isoler l'ADN, l'ARN et des protéines à partir de cellules libérées de la surface du filtre ont été développés et rationalisé pour la répétition exacte de traitement des échantillons. Finally, la méthodologie nécessaire pour retirer le filtre pour permettre l'incorporation, sectionner et pour H & E, immunohistochimique et immunofluorescence, est entièrement décrite.

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Protocol

1. Mise en place de la Cellule 3D Culture Système d'insertion

  1. Placer les inserts 2 en polycarbonate de culture cellulaire dans une orientation inversée (côté filtre vers le haut) vers le bas dans une plaque de 6 puits (figure 1A).
  2. Appliquer une fine couche de gélatine à 0,1% dans de l'eau à la face inférieure de l'insert et laisser sécher (10 à 20 min) dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité.
  3. Répétez l'étape 1.2 deux fois de plus pour un total de 3 applications de gélatine à 0,1% sur les inserts.
    NOTE: Le revêtement de gélatine va aider à limiter la diffusion entre les chambres.
  4. Pour recueillir les CRC primaires des conditions de culture standard, ajouter 5 ml de PBS pour laver le flacon de culture.
    1. Trypsiniser les cellules en utilisant 1 ml (pour un T-25 et de 2 ml pour un T-75) 0,25% de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C. Tapoter doucement le côté du flacon pour aider à déloger les cellules. Ensuite, passez à arrêter la réaction de la trypsine et de recueillir les cellules en ajoutant 5 ml de DMEM complet.
    2. Collecte les cellules dans un tube de 15 ml. Centrifuger le tube à 4 ° C et 188 xg et compter l'aide d'un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre.
    3. Re-suspendre 600.000 CRC dans 250 pi médias (CM) conditionnés et ajouter à la orientée correctement (côté filtre vers le bas) culture insert (figure 1B). Ceci est désigné comme la chambre intérieure.
      Note: CM-F milieux conditionnés par des cellules irradiées J2 et contient 10 um Y-27632 comme décrit précédemment 7, 8, 9, 11.
  5. Appliquer 2 ml de CM à la chambre extérieure de la plaque 6 puits et incuber à 37 ° C pendant la nuit (pendant au moins 18 h).
  6. Retirez délicatement le CM sur la chambre intérieure avec un mL 1 ou 200 pi pipette et ajouter lentement les médias de différenciation (DM) à la chambre intérieure avec une pipette 1 mL jusqu'au complet. Faites attention à ne pas perturber la couche cellulaire.
le "> 2. Entretien des cultures 3D

  1. Vérifiez les cultures tous les jours. Les cellules saines apparaissent comme représenté sur la figure 2.
  2. Changer le CM dans la chambre extérieure tous les jours ou tous les deux jours suivant le métabolisme des cellules.
  3. Lorsque les médias de l'intérieur de couleur (jaune) change de chambre, retirer délicatement les médias sur la chambre de filtre interne avec un mL 1 ou 200 pi pipette.
  4. Aspirer les médias dans la chambre extérieure 6 plaque bien avec une pointe d'aspiration.
  5. En utilisant une pipette de 1 mL, appliquer lentement DM frais à la chambre intérieure jusqu'au complet. Veillez à ne pas gratter ou autrement déloger la couche cellulaire.
  6. Remplacez le support dans la chambre extérieure avec 2 ml de CM frais.
  7. Maintenir les cultures pendant 2 semaines, et ensuite procéder à un traitement pour l'isolement bimoléculaire souhaité.
    NOTE: Chaque ligne de la plaque 6 puits, un total de six inserts (figure 1B), doit être traité par expérience pour acquérir suffisamment de cellules pour DNUn ARN ou d'une protéine pour l'analyse.
  8. Aspirer le milieu dans la chambre extérieure et rincer avec 2 ml du tampon phosphate salin (PBS).
  9. Retirez délicatement les médias de la chambre intérieure avec un mL 1 ou 200 pi pipette et ajouter 500 ul de PBS. Évitez de raclage ou autrement perturber les cellules sur la membrane.
  10. Aspirer PBS à partir de la chambre extérieure et retirez le PBS de la chambre intérieure avec un 1 ml ou 200 ul pipette. Une fois que le PBS a été retiré, passez directement à l'application appropriée détaillé ci-dessous. Ne pas laisser la membrane sécher. La culture peut être maintenue brièvement dans le PBS jusqu'à ce que l'application est prête à commencer.

3. Traitement des Filtres pour Pellet Banking

  1. Ajouter 100 ul de 0,25% de trypsine-EDTA à chaque chambre intérieure et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C.
  2. En bref et soigneusement agiter / racler les cellules sur la surface de la membrane avec une pipette de 200 pi pendant pipetage vers le haut et vers le bas (pour éviter puncturation la membrane). Incuber pendant 1 min à 37 ° C.
  3. Ajouter 250 ul de CM à la première chambre intérieure et la pipette de haut en bas doucement pour rincer le filtre.
  4. Le transfert des cellules remises en suspension dans la chambre de filtre adjacente qui contient les mêmes conditions de presse et répéter pipetage vers le haut et vers le bas.
  5. Répétez cette procédure pour chacun des inserts d'une seule condition. Collecter et transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml.
  6. Rincer chaque chambre intérieure avec un 100-200 ul supplémentaire de CM pour recueillir toutes les cellules restantes. Ajouter au tube de 1,5 ml centrifugeuse à l'étape 3.5.
  7. Faire tourner les cellules à 423 x g dans une microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 5 min.
  8. Aspirer le surnageant et laver le culot cellulaire une fois avec 1000 ul de PBS.
  9. Spin à nouveau à 423 xg dans une microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 5 min.
  10. Aspirer PBS et congélation à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

4. Traitement des filtres à ARN ou ADN Isolation

Ajouter 200 pi de thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme ou le réactif d'extraction similaire à la chambre intérieure et agiter brièvement les cellules à la surface de la membrane par pipetage vers le haut et vers le bas.
  • Incuber dans le réactif d'extraction pendant 5 min à température ambiante avec la chambre extérieure sèche.
    1. Comme le filtre peut se dissocier de l'insert, laver la membrane filtrante dissociées par pipetage de la solution d'extraction vers le haut et vers le bas. Recueillir autant du réactif d'extraction possible en inclinant la plaque à 6 puits et aspirer tout liquide résiduel.
  • Suivre le protocole du fabricant pour la purification et la récupération de l'ADN, l'ARN ou une protéine.

    • 5. Traitement des Filtres pour Protein Isolation

    1. Placer la cartouche filtrante dans la plaque à 6 puits sur de la glace. À la chambre intérieure, ajouter 10 ul de tampon de lyse protéine supplémenté avec 1 mM de fluorure de sodium (NaF), 1 mM de vanadate de sodium (NaV), 100 mM dithiothreitol (DTT) et 100 ul d'un cocktail anti-protéase.
    2. Agiter / gratter les cellules sur la surface de la membrane avec une pipette 20 ul pendant le pipetage vers le haut et vers le bas. Éviter de générer des bulles dans le tampon de lyse.
    3. Incuber la plaque à 6 puits avec des inserts de filtre sur la glace pendant 10 min.
    4. Répéter le grattage, puis rincer la surface de la membrane avec le tampon de lyse.
    5. Ramassez les lysats des 6 inserts et transfert à un tube de 1,5 ml centrifugeuse sur la glace.
    6. Rincer la première membrane avec un 10 pi supplémentaires de tampon de lyse et le transfert à l'autre filtre.
    7. Répétez l'étape 5.6 pour tous les inserts, collecte toute solution résiduelle de tampon de lyse et ajouter au tube de 1,5 ml (étape 5.5).
    8. Incuber l'échantillon sur de la glace pendant 5 minutes supplémentaires.
    9. Spin à la vitesse maximale (16873 xg dans une centrifugeuse de table) pendant 15 min à 4 ° C.
    10. Pipette lysat surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml.
    11. Procéder à l'analyse de la concentration en protéine ou store lysats à -80 ° C.

    6. Traitement pour H & E et Immuno-coloration

    1. Ajouter 500 ul et 1 ml de 10% FBN (neutre de formol tamponné) à la chambre intérieure et extérieure et laisser incuber une nuit à 4 ° C.
    2. Aspirer le FBN de la chambre extérieure et ajouter 1 mL hydroxyéthyl agarose (HEA) traitement du gel à une centrifugeuse de 1,5 ml. Faire fondre lentement l'agarose dans un micro-ondes en utilisant une faible puissance et répété 10-20 de les impulsions jusqu'à ce que l'agarose soit fondu.
    3. Gardez le HEA dans un bain chaud à 37 ° C pour empêcher la solidification jusqu'à utilisation.
    4. Retirez la FBN de la chambre intérieure et appliquer 25 ul de HEA fondu à la chambre intérieure et permettre à l'agarose à solidifier pendant 2-5 min.
    5. Wet pads histologiques 2 de mousse à 10% FBN et placer un tampon dans une cassette incorporation (voir la figure 3D).
    6. Utilisez une lame scalpel n ° 11 (qui a une lame très forte, pointe fine) pour marquer le filtre du côté inférieur de l'insertchambre, en libérant partiellement de la chambre d'insertion en plastique.
    7. Placer une petite quantité (100-200 pi) de FBN dans une boîte de Pétri et immerger le filtre partiellement délogé dans la FBN (figure 3A).
    8. Avec une lame scalpel # 10, appuyez doucement contre le milieu du filtre, de l'intérieur de la chambre d'insertion, pour déloger complètement le filtre de l'insert canon (figure 3B). S'il y a une partie du filtre qui est toujours fixée au canon, rompre avec le scalpel.
    9. Couper le filtre HEA revêtu en deux avec la lame de scalpel n ° 10 (figure 3C).
    10. Placer chaque moitié du filtre sur le tampon de mousse dans la cassette d'histologie préparé à l' étape 6.4 (figure 3D).
    11. Ajouter la seconde 10% FBN éponge imbibée de la cassette, intercalant le filtre.
    12. Snap sceller la cassette, dans FBN, et incuber pendant la nuit.
    13. les filtres de processus dans des blocs de paraffine pour sectionner et coloration comme12 décrit précédemment.

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    Representative Results

    Le système basé sur insert de culture cellulaire est une procédure relativement simple et rapide pour produire des cultures 3D de la prostate CRCs qui soutient la différenciation des cellules luminale. Un schéma du système est représenté (figure 1A) mettant en évidence l'application de la couche de gélatine sur la surface inférieure de la cartouche filtrante. Les inserts ne sont renversées pour l'application de la gélatine. Dans la figure 1B les filtres sont dans l'orientation appropriée pour la culture. L' utilisation d' un insert de cellule transparente, une image représentative d'une culture de la prostate CRC 3D sain est représenté (10X) (Figure 2). La superposition dense de CRCs sains démontré est typique après l'établissement et peut être visualisé en utilisant la microscopie optique standard. Au cours de l'établissement initial, il est essentiel de visualiser la couche de cellules formées pour faire en sorte que le procédé est compatible avec une lignée cellulaire donnée, et que la fixation appropriée etYering de cellules se sont produits.

    HEA est appliquée à l'intérieur de l'insert tel que décrit ci-dessus. Après application de la HEA, des précautions doivent être prises lors marquant le filtre pour le supprimer de l'insert (figures 3A, 3B). Dans toutes les étapes (figures 3A-3D), les soins doit également être exercé pour réduire au minimum les mouvements inutiles de la couche de HEA sur le filtre avec les cellules. La couche CRC peut être facilement perturbé et endommagé pendant le transfert à l'H & E cassette (Figure 3D). Après excision du filtre HEA revêtu du cylindre en matière plastique (figures 3A à 3C), le filtre peut être réduit de moitié et traitée pour sectionner et de coloration en utilisant des cassettes d' encastrement standard (Figure 3D). Fractionnement du filtre dans la moitié est important de maximiser la surface disponible pour la coupe transversale sur H & E et IF.

    coloration immunofluorescenteainsi que le champ lumineux (BF) des images des cellules cultivées sur la couche de filtre ont été recueillies à l'aide d'un microscope avec DSU (unité de numérisation du disque) disque rotatif capacités confocale. Des résultats représentatifs pour l' histologie et la coloration H & E sont représentés dans une section transversale de l'insert de filtre et des cellules (20X) (figure 4). Avec des soins appropriés, nous démontrons qu'une couche CRC sur les inserts de filtre peut être sectionné et coloré, comme pratique courante pour l'histologie des tissus. Pendant la coupe, il est possible pour le CRC à se détacher du filtre en tant que couche intacte de cellules comme le montre (Figure 4). L'image BF montre les couches de cellules à plusieurs couches sur le dessus de la membrane poreuse (figure 5A). Les images individuelles fluorescentes pour les noyaux (DAPI, figure 5B), p63 (Figure 5C) et l'AR (Figure 5D) sont représentés, de même que la fusion des trois marqueurs de fluorescence (Figure 5E). Enfin, un composite BF et IF superposition est représenté (figure 5F), l' établissement de la localisation du signal de fluorescence par rapport aux cellules et le filtre. La superposition de la tache DAPI avec le p63 IF coloration démontre clairement certaines cellules encore dans un état prolifératif. La localisation des AR IF coloration dans le noyau est une indication de la réactivation fonctionnelle des AR dans les cellules de la prostate.

    Une comparaison entre l'IF du système d'insertion de filtre et d' un tissu de la prostate est représentée en coupe (figures 6A, 6B) afin de démontrer la similitude dans le développement de la couche d'insertion de CRC à celle de l'épithélium de la prostate. Le conduit de la prostate montre l'expression de p63, compatible avec les cellules de la prostate basales. p63 coloration est également observée dans les CRC sur l'insert. Un pourcentage plus élevé de cellules exprimant p63 a été observée dans la pièce rapportée par rapport à la section de tissu intact. En outre, à la fois nucléaire et cytoplasmique AR sont vus dans le tis de la prostate poursuivre la section et tandis que les CRC sur le spectacle d'insertion de filtre expression moins générale des AR, à la fois l'expression d'AR nucléaire et une coloration cytoplasmique est considérée, similaire à la prostate intacte.

    Figure 1
    Figure 1: Images représentatives du 6 puits Culture Dish et Insert qui constituent le système Culture 3D. (A) des inserts renversées pour l' application du revêtement de gélatine sur la face inférieure du filtre (flèche). Une image plus grande de l'insert et le filtre est show (encadré). (B) inserts correctement placés. Les chambres intérieure et extérieure du système sont représentés (flèches). La ligne en boîte en B montre comment les échantillons multiples sont obtenus pour une condition expérimentale donnée. A la fin de la période de croissance de 2 semaines ces inserts peuvent être regroupés pour donner suffisamment de matériau pour l'analyse."Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2: une image représentative d'une couche de santé CRC ensemencée sur un filtre à membrane transparente est montré. Les deux chambres intérieure et extérieure contenaient un milieu conditionné. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    figure 3
    Figure 3: une image représentative d'un filtre en moitiés en deux sections et placé dans une cassette de paraffine pour les Embedding. (A) Filtre insert avec revêtement HEA après avoir marqué et avant l' enlèvement. (B) La cartouche filtrante libéré du cylindre de polycarbonate. ( (D) Le positionnement correct et l' orientation des deux moitiés à l' intérieur de la cassette d'intégration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4: Section Stained Cross Représentant H & E de l'insert de filtre et de cellules (20X). Tant la membrane (en bas) et la couche de cellule (en haut) sont présentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5: Une série de Représentant lumineux Champ (BF) et immunofluorescence (IF) Images deLes cellules sectionnées sur le filtre (40X). des coupes transversales du filtre et les cellules sont montrées. Une image BF non colorées des cellules sur la surface du filtre (5A) est accompagné d'images pour le noyau DAPI colorant (5B) et une coloration immunofluorescente pour deux protéines différentes, p63 (5C) et le récepteur androgénique (AR, 5D). Un revêtement composite des sections de cellule (5E, F) qui définit la localisation des signaux IF dans le contexte des cellules et filtre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 6
    Figure 6: Un représentant immunofluorescence (IF) Image de cellules sectionnées sur le filtre par rapport à une section de la prostate Epithelium de tissus (20X).Une image en coupe transversale de notre élément filtrant est représenté (figure 6A) par rapport aux couches epitheliales canalaires d'une prostate intacte (figure 6B). La coloration de la p63, l'AR et le noyau a été effectué comme dans la figure 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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    Discussion

    lignées de cellules primaires sont une plate-forme importante et en développement rapide pour la recherche sur le cancer. Le système de culture 3D basé insert de culture soutient la différenciation des CRC primaires de la prostate dans un délai de deux semaines. La méthode du filtre CRC représente une nouvelle méthode, de débit moyen pour la recherche de la prostate. modèles PDX de souris existantes sont longues et extrêmement coûteux, et beaucoup d'échantillons PDX ne peuvent pas être cultivées en culture, ce qui limite l'expérimentation menée à l'initiative et leur utilité. En outre, alors que les taux d'établissement PDX de réussite varient considérablement 13, la méthode CRC a un taux élevé de succès dans l' établissement de lignées cellulaires 3. Nous considérons que notre système soit complémentaire de l'approche organoide la prostate à base de R-spondine; cependant, un manque de succès en ce qui concerne l' établissement d'organites de cancer de la prostate primaire a été rapporté 14. En outre, les médias, les méthodes d'établissement,et l'entretien des CRC sont nettement plus simple que la prostate approche organoide basée R-spondine. Comme un avantage supplémentaire, les CRC peuvent être établies et utilisées pour tester les cultures normales et tumorales appariées pour les comparaisons moléculaires directes.

    Quelques problèmes techniques restent à régler lors de l'établissement de ce système. Tout d'abord, la couche de gélatine appliquée sur la face inférieure de l'élément filtrant est utile, mais ne l'élimine pas, la diffusion des médias à travers la membrane. Les changements fréquents de médias sont utilisées pour maintenir le gradient respectif de la différenciation (couche supérieure de la cellule ou apicale) en fonction de la croissance (couche inférieure ou de base de cellules) , les conditions dans la chambre. Deuxièmement, les cultures 3D CRC succès requis une densité relativement élevée de l'ensemencement des cellules. Des densités plus faibles densités de semis ont donné des résultats médiocres en ce qui concerne l'intégrité de la couche cellulaire qui se développe sur la surface du filtre. Ceci est une considération commune lors de la culture des CRC, à mesure qu'ils grandissent le plus vigoureusement lorsqu'il est maintenu unt de fortes densités cellulaires. Enfin, l'élimination subséquente de la paraffine appropriée et l'incorporation de la couche cellulaire intacte était essentielle pour définir le degré de différenciation cellulaire. L'addition d'agarose hydroxyéthyle (HEA) a diminué à la fois la perte de cellules et d'améliorer la morphologie globale des cellules par rapport aux filtres non incorporé (non représenté). Une fois correctement intégré, les filtres ont été sectionnés et traitées de manière indiscernable à partir d'échantillons de cellules et de tissus typiques.

    Nous commençons tout juste à imiter l'architecture de l'épithélium de la prostate en utilisant cette méthode de filtrage. Des modifications supplémentaires aux conditions de culture, aux médias et au substrat sont garantis, qui peuvent être facilement pris en compte. Par exemple, les médias de différenciation reformulés qui peuvent mieux promouvoir luminal vs différenciation basale peuvent être testés rapidement. Comme l' infection lentiviral du CRC a été réalisée aussi facilement qu'avec les cellules cancéreuses commerciales 7 et 2D ont al CRCsalors été transfectées avec des vecteurs de technologie de montage cas9 / gène CRISPR pour modifier de façon permanente le génome de la cellule (données non représentées), l'effet des gènes mutés, supprimés ou réparés peuvent être testés. De même, le suivi de la lignée peut être rendue possible par l'introduction de gènes rapporteurs spécifiques de la lignée.

    En plus de modifier les médias ou les cellules, des modifications à la surface du filtre peuvent également être testés. Différents substrats de membranes de filtration sont disponibles dans le commerce. En outre, nous avons découvert que la matrice extracellulaire du commerce fournit un environnement de croissance approprié lorsqu'il est appliqué à l'intérieur du filtre. Comme l'un des objectifs du système d'insertion est de mieux modéliser le microenvironnement de la prostate, peut-être les modifications les plus intéressantes pourraient être l'introduction de cellules stromales normales ou tumorales dérivées, soit en co-culture avec les CRC dans les limites de l'insert ou dans la chambre inférieure pour conditionner le milieu de croissance. Modification de l'insert et avec des sections ole tissu de la prostate décellularisé f est également possible. Dans cette approche, les interactions épithéliales stromales / pourraient permettre aux cellules primaires d'utiliser le tissu décellularisé comme un échafaudage pour la croissance.

    La capacité d'établir des cellules primaires et de fournir ultérieurement les conditions de leur différenciation est un format idéal pour la recherche biologique plus pertinente dans le développement glandulaire normal et pour la recherche sur le cancer. Le système décrit ici fournit une plate-forme par laquelle un nombre illimité de types cellulaires et des modifications peuvent être combinés pour adapter le système aux besoins expérimentaux individuels et à recueillir de manière fiable les échantillons pour les analyses.

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    Disclosures

    Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

    Acknowledgments

    Cette recherche a été soutenue par T32 (CA 9686-18) et TL1 (TL1TR001431) l'attribution des subventions de formation postdoctorale (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), ainsi que U01 PAR-12-095 (Kumar) et P30 CA051008-21 (Weiner). fixation de l'échantillon, sectionner et la coloration a été réalisée dans le Lombardi Comprehensive Cancer Centre histologie et de tissus de ressources partagées. Nous remercions Richard Schlegel pour des discussions utiles. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national du cancer ou de la National Institutes of Health.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Corning Costar Snapwell Culture Inserts Corning 3801
    Millicell Cell Culture Inserts Millipore PIHP01250
    Multiwell 6 Well Falcon 353046
    Gelatin 0.1% in water Stemcell Technologies 7903
    Sterile Saftey Scapel 10 Blade Integra Miltex 4-510
    Sterile Standard Scalpel 11 Blade Integra Miltex 4411
    RIPA Lysis and Extraction Buffer Thermofisher Scientific 89900
    Sodium Fluoride Fishcer Scientific S299-100
    Sodium Vanadate Fishcer Scientific 13721-39-6
    Dithiothreitol Sigma-Aldrich 3483123
    Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) Sigma-Aldrich P8340
    0.25% Trypsin-EDTA (1x) Thermofisher Scientific 25200-056
    DMEM Thermofisher Scientific 11965-092
    FBS Sigma-Aldrich F2442
    Glutamine Thermofisher Scientific 25030081 
    Penicillin Streptomycin Thermofisher Scientific 15140-122
    F-12 Nutrient Mix Media Thermofisher Scientific 11765054
    Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor Enzo ALX-270-333-M025
    Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888
    EGF Thermofisher Scientific PHG0315
    Insulin Thermofisher Scientific 12585-014
    Cholera Toxin Sigma-Aldrich C3012
    Gentamicin Thermofisher Scientific 15710-064
    Fungizone Fisher Scientific BP264550
    Trizol Reagent Invitrogen 15596026
    Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) Thermo Scientific HG-4000-012
    Non-Adherent Dressing Telfa KDL2132Z
    Cell Culture Dish Sigma SIAL0167
    HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes Crystalgen CG-M492

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    References

    1. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
    2. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
    3. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
    4. Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
    5. Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
    6. Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. Prostate cancer stem cells. J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).
    7. Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
    8. Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
    9. Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
    10. Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
    11. Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
    12. Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
    13. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
    14. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).

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    Recherche de culture de cellules de la prostate primaire du cancer Différenciation Androgen Receptor cellule Luminal 3D Filter Insert
    Un système de culture 3D basé sur Insérer Filtre rapide pour Prostate primaire Différenciation Cellulaire
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    Tricoli, L., Berry, D. L., Albanese, … More

    Tricoli, L., Berry, D. L., Albanese, C. A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (120), e55279, doi:10.3791/55279 (2017).

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