Abstract
Betinget omprogrammerede celler (CRC'er) give en bæredygtig metode til primær cellekultur og evnen til at udvikle omfattende "levende biobanker" af patient afledt cellelinjer. For mange typer af epitelceller har forskellige tredimensionelle (3D) kultur tilgange blevet beskrevet, at støtte forbedret differentieret tilstand. Mens CRCs bevarer deres linjeforpligtelse til det væv, hvorfra de er isolerede, de undlader at udtrykke mange af differentieringsmarkører forbundet med vævet for oprindelse ved dyrkning under normale to dimensional (2D) dyrkningsbetingelser. For at styrke anvendelsen af patient-afledte CRC'er for prostatakræft forskning, har en 3D-kultur format blevet defineret som muliggør en hurtig (2 uger i alt) luminale celledifferentiering i både normale og tumor-afledte prostata epitelceller. Heri er en filterindsats-baseret format beskrevet for dyrkning og differentiering af både normale og maligne prostata CRCs. En detailed beskrivelse af de procedurer, der kræves for celle indsamling og behandling til immunhistokemisk og immunfluorescensfarvning leveres. Kollektivt 3D kultur format beskrevet, kombineret med de primære CRC linjer, giver et vigtigt mellem- at fremhæve throughput modelsystem for biospecimen-baserede prostata forskning.
Introduction
Identifikation og brug af behandlinger mod kræft, der er skræddersyet til den enkelte er et primært mål i kræftforskning. For nylig er der udviklet nye metoder, der giver mulighed for en større lethed i etableringen af primære cellekulturer, potentielt give måder både at identificere og afprøve personlige behandlinger. For eksempel R-spondin-baserede prostata organoide fremgangsmåde 1 giver mulighed for tredimensionale (3D) dyrkning af normale og metastatiske prostatacancerceller i en kommerciel ekstracellulær matrix (f.eks Matrigel), mens Betinget Reprogramming Celler (CRC) metode udviklet på Georgetown 2, 3 anvender flere standard 2D dyrkningsbetingelser. Specifikt kombinationen af en Rho-kinase-inhibitor (Y-27632) og bestrålede J2 murine fibroblast feeder-celler føre til ubestemt dyrkning af keratinocytceller CRCs 2. CRC metode eryderst robust, med primære cellelinjer succes etableret og opretholdes på ubestemt tid fra prostata og mange andre normale og maligne epitelvæv 3. Vigtigere er det, vores CRC teknologi tilladt for hurtig identifikation af den etiologiske grundlag for tilbagevendende respiratorisk papillomatosis i en patient, som havde undladt en række tidligere medicinsk behandling. Hertil kommer, ved hjælp af normale og tumor-afledte CRC'er, vellykket identifikation af en FDA-godkendt lægemiddel, vorinostat, blev indgivet inden to uger indledende væv biopsi. Patienten blev placeret på vorinostat, hvilket resulterer i en vellykket behandling af deres sygdom 4.
Den normale prostata kirtel består af luminale, basal og de sjældne neuroendokrine celler 5. Luminale celler danner søjleformede epitel lag af kirtlen og udtrykke androgen receptor (AR), samt andre luminale markører, såsom cytokeratiner 8 og 18 og prostate-specifikt antigen (PSA) 6. Omvendt er basale celler lokaliseret under den luminale lag og ekspres cytokeratin 5 og P63, men lave niveauer af AR 5. Vi 7, 8, 9 og andre 10 har med succes brugt prostata CRC'er i prækliniske mekanistisk stof følsomhed undersøgelser. Men når der dyrkes under standard 2D væv dyrkningsbetingelser, disse celler ikke fuldt ud at engagere AR signalering 10. Vigtigere, når det placeres under nyrekapslen af immunsvækkede mus, den CRCs genvandt normale prostata glandulær arkitektur og funktion indikerer, at prostata CRCs bevarer deres linjeforpligtelse når de anbringes i en eftergivende miljø. Udviklingen af filterindsatsen-baserede cellekultur her beskrevne system muliggør hurtige (2 uger) in vitro differentiering af prostata- CRCs som påvist By den forøgede ekspression af AR og AR målgener samt nedsatte niveauer af P63.
De filterindsatse anvendte indeholde polycarbonatmembraner (porestørrelse, 0,4 um), der kan understøtte dyrkningen af pattedyrceller. Systemet, som er udviklet, gør brug af normale og maligne prostata CRCs, 6 såvel dyrkningsskåle og filterindsatse. Cellekulturmedier konditioneret af J2 celler 11 er placeret i den nederste kammer og prostata differentierende medier i den øverste kammer. De heri beskrevne teknikker støtter prostata luminale celledifferentiering inden for en to uger tidsramme, i overensstemmelse med målene for skræddersyet medicin. Det var også nødvendigt at udvikle de metoder, der giver mulighed for omfattende molekylære, genetiske og cellulære profilering af kulturerne. Metoder til isolering af DNA, RNA og protein fra celler, der frigives fra filteroverfladen er blevet udviklet og strømlinet til nøjagtig gentagelse prøve behandling. Finally, den metode er nødvendig for at fjerne filteret for at aktivere indlejring, sektionering og for H & E, immunhistokemisk og immunfluorescensfarvning, er fuldt beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etablering af 3D Cell Culture Insert System
- Place 2 polycarbonat cellekultur indsætter i en vendt orientering (filter opad) ned i en plade med 6 brønde (figur 1A).
- Påfør et tyndt lag af 0,1% gelatine i vand til undersiden af indsatsen og lad den tørre (10-20 min) i et biologisk sikkerhedsskab at opretholde sterilitet.
- Gentag trin 1.2 to gange mere for i alt 3 anvendelser af 0,1% gelatine på indsatsene.
BEMÆRK: gelatine belægning vil hjælpe grænse diffusion mellem kamre. - At indsamle de primære CRC'er fra almindelige dyrkningsbetingelser, tilsættes 5 ml PBS for at vaske kulturen kolben.
- Trypsinisér cellerne under anvendelse (1 ml for en T-25 og 2 ml for en T-75) 0,25% trypsin-EDTA i 5 minutter ved 37 ° C. Bank forsigtigt på siden af kolben til støtte i at løsne cellerne. Derefter fortsættes for at standse trypsin reaktion og opsamle cellerne ved tilsætning af 5 ml komplet DMEM.
- Indsamle cellerne i en 15 ml rør. Centrifugeres røret ved 4 ° C og 188 x g og tælle anvendelse af en automatiseret celletæller eller et hæmocytometer.
- Resuspender 600.000 CRCs i 250 pi konditioneret medium (CM) og tilsæt til korrekt orienteret (filter nedad) kultur insert (figur 1B). Dette betegnes som det indre kammer.
Bemærk: CM er F-medier konditioneret med bestrålede J2 celler og indeholder 10 um Y-27632 som beskrevet tidligere 7, 8, 9, 11.
- Påfør 2 ml CM til det ydre kammer af brønden pladen 6 og inkuber ved 37 ° C natten over (i mindst 18 timer).
- Fjern forsigtigt CM på det indre kammer med en 1 ml eller 200 pi pipette og tilsæt langsomt differentiering medier (DM) til det indre kammer med en 1 ml pipette, indtil fuldt. Vær omhyggelig med ikke at forstyrre celle lag.
- Tjek kulturerne hver dag. Raske celler vises som vist i Figur 2.
- Ændre CM i ydre kammer hver dag eller hver anden dag alt efter cellernes metabolisme.
- Når medierne af den indre kammer skifter farve (gul), forsigtigt fjerne mediet på den indre filter kammer med en 1 ml eller 200 uL pipette.
- Aspirer medierne i den ydre 6 brønde kammer med en opsugning spids.
- Ved hjælp af en 1 ml pipette, langsomt anvende frisk DM til den indre kammer indtil fuld. Pas på ikke at skrabe eller på anden måde fjerne cellelaget.
- Udskift medierne i det ydre kammer med 2 ml frisk CM.
- Opretholde kulturer i 2 uger, og derefter gå videre til behandling for den ønskede bimolekylære isolation.
BEMÆRK: Hver række i 6 brønde, i alt seks indsatser (figur 1B), skal behandles pr eksperiment for at erhverve nok celler til DNA, RNA eller protein til analyse. - Aspirer medier i det ydre kammer og skylles med 2 ml phosphatbufret saltvand (PBS).
- Fjern forsigtigt medier fra det indre kammer med en 1 ml eller 200 pi pipette og tilsæt 500 pi PBS. Undgå skrabning eller på anden måde forstyrre cellerne på membranen.
- Aspirer PBS fra det ydre kammer og fjern forsigtigt PBS fra indre kammer med en 1 ml eller 200 uL pipette. Når PBS er blevet fjernet, direkte videre til det relevante program beskrevet nedenfor. Lad ikke membranen til at tørre ud. Kulturen kan holdes kortvarigt i PBS indtil ansøgningen er klar til at begynde.
3. Behandling af Filtre til Pellet Banking
- Tilsæt 100 pi 0,25% trypsin-EDTA til hver indre kammer og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C.
- Kort fortalt og omhyggeligt agitere / skrabe cellerne på membranoverfladen med en 200 pi pipette mens pipettering op og ned (undgå puncturing membranen). Der inkuberes i 1 minut ved 37 ° C.
- Tilsæt 250 pi CM til det første inderkammer og pipette op og ned forsigtigt at skylle filteret.
- Overførsel resuspenderes celler til den tilstødende filterkammeret, der indeholder de samme medier betingelser og gentag pipettere op og ned.
- Gentag denne procedure for hver af de inserter af en enkelt tilstand. Indsamle og overføre cellerne til et 1,5 ml centrifugerør.
- Skyl hvert indre kammer med en ekstra 100-200 pi CM til at indsamle de resterende celler. Føje til 1,5 ml centrifugerør i trin 3.5.
- Spin cellerne ved 423 xg i en mikrocentrifuge ved 4 ° C i 5 min.
- Aspirer supernatanten og vask cellepelleten en gang med 1000 pi PBS.
- Spin igen ved 423 x g i en mikrocentrifuge ved 4 ° C i 5 min.
- Aspirer PBS og fryses ved -80 ° C til senere brug.
4. Behandling af Filtre til RNA eller DNA Isolation
- Som filtret kan dissociere fra indsatsen, vaskes adskilles filtermembranen ved pipettering ekstraktionsopløsningen op og ned. Indsamle så meget af ekstraktionen reagens som muligt ved at vippe 6-brønds plade og aspiration af enhver resterende væske.
5. Behandling af Filtre til Protein Isolation
- Placer filterindsatsen i 6 brønds plade på is. Til det indre kammer, der tilsættes 10 pi protein lyseringsbuffer suppleret med 1 mM natriumfluorid (NaF), 1 mM natriumvanadat (NAV), 100 mM dithiothreitol (DTT) og 100 pi anti-protease cocktail.
- Agitere / skrabe cellerne på membranoverfladen med en 20 pi pipette mens pipettere op og ned. Undgå at generere bobler i lysisbuffer.
- Inkubér 6 brønds plade med filterindsatse på is i 10 min.
- Gentag skrabning og derefter skylles membranens overflade med lysisbuffer.
- Saml lysaterne fra de 6 indsatse og overføre til et 1,5 ml centrifugerør på is.
- Skyl den første membran med yderligere 10 uL lysisbuffer og overførsel til næste filter.
- Gentag trin 5.6 for alle skær, indsamling eventuelt tilbageværende lysepuffer opløsning og føje til 1,5 ml rør (trin 5.5).
- Prøven inkuberes på is i yderligere 5 min.
- Centrifugering ved maksimal hastighed (16.873 x g i en bordcentrifuge) i 15 minutter ved 4 ° C.
- Pipette lysatsupernatant i et frisk 1,5 ml rør.
- Fortsæt til analysen af koncentration eller sto proteinre lysater ved -80 ° C.
6. Behandling for H & E og Immuno-farvning
- Tilføj 500 pi og 1 ml 10% NBF (neutral bufret formalin) til den indre og ydre kammer og lad inkuber natten over ved 4 ° C.
- Sug NBF fra det ydre kammer og tilsæt 1 ml hydroxyethyl agarose (HEA) behandling gel til et 1,5 ml centrifuge. Langsomt smelte agarose i en mikrobølgeovn ved hjælp lavt strømforbrug og gentages 10-20 s pulser indtil agarosen er smeltet.
- Hold HEA i et 37 ° C varmt bad for at forhindre størkning indtil den er klar til brug.
- Fjern NBF fra det indre kammer og anvende 25 pi af smeltet HEA til det indre kammer og tillade agarose at størkne i 2-5 min.
- Wet 2 skum histologi pads i 10% NBF og placere en pude i en indlejring kassette (se figur 3D).
- Brug en # 11 klinge skalpel (som har en meget skarp, fin-spids klinge) at score filteret fra undersiden af indsatsenkammer, delvist frigøre det fra plastindsats kammer.
- Placer en lille mængde (100-200 gi) af NBF i en petriskål og fordybe den delvist løsnet filter i NBF (figur 3A).
- Med en # 10 klinge skalpel, tryk forsigtigt mod midten af filteret, fra indersiden af indsatsen kammeret, til fuldt ud at fjerne filteret fra indsatsen tønde (figur 3B). Hvis der er nogen del af filteret, der stadig er fastgjort til cylinderen, afskære det med skalpel.
- Skær HEA-coated filter i halvdelen med # 10 klinge skalpel (figur 3C).
- Placer hver halvdel af filteret på skumpuden i histologi kassetten fremstillet i trin 6.4 (figur 3D).
- Tilsæt den anden 10% NBF gennemblødt svamp til kassetten, sandwiching filteret.
- Snap forsegle kassetten, sted i NBF, og inkuberes natten over.
- Proces filtre i paraffin blokke til sektionering og farvning sombeskrevet tidligere 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den celledyrkningsinsert baseret system er en forholdsvis enkel og hurtig procedure til fremstilling af 3D-kulturer af prostata CRCs der understøtter luminal celledifferentiering. En skematisk af systemet er vist (figur 1A) understrege anvendelsen af gelatineovertræk til bundfladen af filterindsatsen. Skærene er kun væltet for anvendelsen af gelatinen. I figur 1B filtrene er i den rigtige retning for dyrkning. Ved hjælp af en transparent celle indsætte, er et repræsentativt billede af en sund 3D prostata CRC kultur vist (10X) (figur 2). Den tætte lagdeling af sunde CRC'er demonstreret er typisk efter etablering og kan visualiseres ved hjælp af standard lysmikroskopi. Under første etablering, er det kritisk at visualisere lag af celler dannet for at sikre, at fremgangsmåden er kompatibel med en given cellelinje, og at passende fastgørelse og laYering af celler er forekommet.
HEA påføres på indersiden af indsatsen som skitseret ovenfor. Efter påføring af HEA, skal man passe på, når scorer det filter for at fjerne den fra indsatsen (figur 3A, 3B). I alle trin (figur 3A-3D), skal passe også udvises for at minimere unødvendig bevægelse af HEA lag på filteret med celler. CRC lag kan let forstyrret og beskadiget under overførslen til H & E kassette (figur 3D). Efter udskæring af HEA-coatede filteret fra plast tønde (figur 3A-3C), kan filteret halveres og behandles til sektionering og farvning ved anvendelse af standard indlejring kassetter (figur 3D). Opdeling af filteret i halvdelen er vigtigt at maksimere den tilgængelige overflade for cross sektionering på H & E og IF.
immunfluorescensfarvningsamt lyse felt (BF) blev opsamlet billeder af celler dyrket på filteret lag ved hjælp af et mikroskop med DSU (Disk scanningsenheden) rotationsskive konfokale kapaciteter. Repræsentative resultater for histologi og H & E-farvning er vist i et tværsnit af filterindsatsen og celler (20X) (figur 4). Med den rette pleje, viser vi, at en CRC lag på filteret indstik kan sektioneret og farves, som er standard praksis for væv histologi. Ved skæring, er det muligt, at CRCs løsrives fra filteret som et intakt lag af celler som påvist (figur 4). BF Billedet viser flerlaget celle lag oven på den porøse membran (figur 5A). De enkelte fluorescerende billeder af kerner (DAPI, figur 5B), P63 (figur 5C) og AR (figur 5D) er vist, som er sammenfletningen af alle tre fluorescens markører (figur 5E). Endelig en Composite BF og IF overlay vises (figur 5F), oprettelse lokaliseringen af fluorescenssignalet i forhold til cellerne, og filteret. Den overlejring af DAPI pletten med P63 IF farvningen viser klart nogle celler stadig i en proliferativ tilstand. Lokaliseringen af AR IF farvning i kernen indikerer funktionel reaktivering af AR i prostata celler.
En sammenligning mellem IF vor filterindsats system og en sektioneret prostata væv er vist (figur 6A, 6B) at påvise ensartetheden i udviklingen af vores CRC insert lag til den for prostata epitel. Prostata kanal viser ekspression af P63 i overensstemmelse med prostata basale celler. P63-farvning ses også i de CRCs på indsatsen. En højere procentdel P63 udtrykkende celler blev observeret i vores insert sammenlignet med det intakte væv sektion. Desuden er både nuklear og cytoplasmatisk AR set i prostata tis sue sektion og mens CRCs på filterindsatsen show mindre samlet AR ekspression, både nuklear AR ekspression og cytoplasmatisk farvning ses, ligner den intakte prostata.
Figur 1: Repræsentative billeder af 6-brønds dyrkningsplade og Indsæt der omfatter 3D Culture System. (A) Inverted skær til påføring af gelatineovertræk til undersiden af filteret (pil). En større billede af indsatsen og filteret er show (indsat). (B) Korrekt placeret indsatser. De indre og ydre kamre af systemet er vist (pile). Den indrammede række i B viser, hvordan flere prøver opnås for en given eksperimentel tilstand. Ved afslutningen af den to uger vækstperioden disse indstik kan samles til at give tilstrækkeligt materiale til analyse."Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: En repræsentant Billede af et lag af Sund CRC'er podet på en gennemsigtig Filter Membrane vises. Både indre og ydre kamre indeholdt konditionerede medier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: En repræsentant Billede af en Filter Halveret i to sektioner og placeres i en Paraffin kassette for Embedding. (A) filterindsats med HEA belægning efter scoring og før fjernelse. (B) Det frigivne filterindsats fra polycarbonat tønde. (
Figur 4: En repræsentant H & E Stained tværsnit af Filter Indsæt og celler (20X). Både membranen (nederst) og cellelag (øverst) er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: En Series of repræsentant Bright Field (BF) og Immunofluorescens (IF) Billeder afCeller Sektioneret på Filter (40X). Tværsnit af filteret og celler er vist. En ufarvet BF billede af cellerne på filteroverfladen (5A) ledsages af billeder til DAPI farvede kerne (5B) og immunfluorescensfarvning for to forskellige proteiner, P63 (5C) og androgenreceptoren (AR, 5D). Et sammensat overlejring af cellen sektioner (5E, F) definerer lokalisering af IF-signaler i sammenhæng med cellerne og filter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: En repræsentant Immunofluorescens (IF) Billede Celler sektioneret på Filter versus en sektion af prostata epitel fra Tissue (20X).Et tværsnit billede af vores filterindsats er vist (figur 6A) sammenlignet med de duktale epitel lag af en intakt prostata (figur 6B). Farvningen af P63 blev AR og kernen udført som i figur 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primære cellelinjer er en vigtig og i rivende udvikling platform for kræftforskning. Kulturen insert-baserede 3D kultur understøtter differentiering af primære prostata CRC'er inden for en to-ugers tidsramme. CRC filter metode repræsenterer en ny, medium throughput fremgangsmåde til prostata forskning. Eksisterende mus PDX modeller er tidskrævende og meget dyrt, og mange af de PDX prøver kan ikke dyrkes i kultur, begrænser investigator-initieret eksperimenter og deres anvendelighed. Derudover mens succesrater for oprettelse PDX variere meget 13, CRC-metoden har en høj succesrate i at etablere cellelinier 3. Vi anser vores system til at supplere R-spondin-baserede prostata organoide tilgang; dog har en manglende succes med hensyn til etablering af organoids fra primær prostatacancer rapporteret 14. Derudover medierne, metoder til etablering,og vedligeholdelse af CRCs er betydeligt enklere end den R-spondin-baserede prostata organoide tilgang. Som en ekstra fordel, kan de CRC'er etableres og bruges til at teste matchede normale og tumor kulturer til direkte molekylære sammenligninger.
Nogle tekniske problemer endnu ikke blevet behandlet ved etablering af dette system. Første, gelatineovertræk påført på undersiden af filterindsatsen hjælper, men fjerner ikke, diffusion af medierne over membranen. Hyppige medieændringer bruges til at opretholde den respektive gradient af differentiering (øvre eller apikale cellelag) vs vækst (lavere eller basale lag af celler) betingelser i kammeret. For det andet, succesrige 3D CRC kulturer kræves en relativt høj cellepodning densitet. Lavere seeding densiteter gav dårlige resultater med hensyn til integriteten af cellelaget, der udvikler sig på filteroverfladen. Dette er en fælles overvejelse, når dyrkning CRC'er, som de vokser mest energisk når opretholdt ent høj celledensiteter. Endelig korrekt fjernelse og efterfølgende paraffinindlejring af den intakte cellelag var kritisk for fastlæggelsen af celledifferentiering. Tilsætningen af hydroxyethyl agarose (HEA) begge faldt celletab og forbedret den samlede cellernes morfologi sammenlignet med ikke-integrerede filtre (ikke vist). Når korrekt indlejret blev filtrene sektioneret og behandles på en måde til at skelne fra typiske celle- og vævsprøver.
Vi er lige begyndt at efterligne arkitekturen af prostata epitel ved hjælp af denne filter metode. Yderligere ændringer af dyrkningsbetingelser, til medierne og til underlaget er berettiget, som let kan behandles. For eksempel kan omformuleret differentiering medier, der kan bedre fremme luminale vs basal differentiering hurtigt testes. Da lentiviral infektion af CRCs er udført lige så let som med kommercielle cancerceller 7 og 2D CRCs har alså blevet transficeret med CAS9 / CRISPR gen redigering teknologi vektorer til permanent at ændre cellens genom (data ikke vist), virkningen af muterede, deleterede eller reparerede gener kan testes. Tilsvarende kan afstamning sporing gøres muligt ved at indføre linjespecifikke reportergener.
Ud over ændring af medier eller cellerne, kan modifikationer af filteroverfladen også testes. Forskellige filtermembran substrater er kommercielt tilgængelige. Desuden har vi fundet, at kommercielle ekstracellulære matrix tilvejebringer et egnet vækstmiljø når de påføres på indersiden af filteret. Som et af målene for indsatsen er at bedre modellere prostata mikromiljø, måske de mest interessante ændringer kunne være indførelse af normale eller tumor-afledte stromaceller, enten i co-kultur med CRC'er inden for rammerne af indsatsen eller i nederste kammer for at konditionere vækstmedierne. Ændring indsatsen godt med sektioner of decellulariseret prostatavæv er også muligt. I denne fremgangsmåde kunne stromale / epiteliale interaktioner tillade de primære celler for at bruge decellulariserede væv som et stillads for vækst.
Evnen til at etablere primære celler og efterfølgende give betingelserne for deres differentiering er et ideelt format til mere biologisk relevant forskning i normal kirtel udvikling og for kræftforskning. Den heri beskrevne system giver en platform, hvorpå et ubegrænset antal celletyper og modifikationer kan kombineres til at skræddersy systemet til individuelle eksperimentelle behov og pålideligt indsamle prøver til analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af T32 (CA 9686-18) og TL1 (TL1TR001431) postdoc uddannelse tilskud awards (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) samt U01 PAR-12-095 (Kumar) og P30 CA051008-21 (Weiner). Prøve fiksering, sektionering og farvning blev udført i Lombardi Comprehensive Cancer Center Histologi og Tissue delte ressource. Vi takker Richard Schlegel for nyttige diskussioner. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Cancer Institute eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T.
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
