Abstract
le cellule riprogrammate condizionale (CRC) forniscono un metodo sostenibile per la coltura di cellule primarie e la capacità di sviluppare ampie "biobanche di vita" di pazienti derivate linee cellulari. Per molti tipi di cellule epiteliali, vari approcci tridimensionale (3D) di coltura sono stati descritti che supporta uno stato differenziato migliorata. Mentre CRC mantengono la loro lineage committment al tessuto dal quale sono isolati, non riescono ad esprimere molti dei marcatori di differenziazione associate al tessuto di origine quando coltivate in normali due condizioni dimensionali (2D) di coltura. Per migliorare l'applicazione della CRC paziente-derivato per la ricerca sul cancro alla prostata, un formato di cultura 3D è stato definito che consente una rapida luminale differenziazione cellulare (2 settimane in totale) in entrambe le cellule epiteliali della prostata normali e tumorali di derivazione. Qui, un formato basato su inserto del filtro è descritto per la coltura e differenziazione di entrambe le normali e maligni CRC prostata. A deDescrizione coda delle procedure richieste per la raccolta delle cellule e di elaborazione per la colorazione immunoistochimica e immunofluorescenza sono forniti. Collettivamente formato coltura 3D descritto, in combinazione con le linee CRC primari, fornisce un importante medio per evidenziare sistema modello produttività per la ricerca della prostata biospecimen-based.
Introduction
L'identificazione e l'uso di terapie del cancro che sono personalizzati per gli individui sono un obiettivo primario nella ricerca sul cancro. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi approcci che consentono una maggiore facilità nella creazione di colture cellulari primarie, fornendo potenzialmente modi sia di identificare e testare terapie personalizzate. Ad esempio, la prostata basata R-spondina approccio organoide 1 consente tridimensionale (3D) coltura di normali e metastatici cellule tumorali della prostata in una matrice extracellulare commerciale (ad esempio, Matrigel), mentre il metodo condizionale riprogrammazione delle cellule (CRC) sviluppato presso Georgetown 2, 3 utilizza più condizioni di coltura 2D standard. In particolare, la combinazione di un inibitore della chinasi Rho (Y-27632) e cellule feeder fibroblasti murini J2 irradiati portano alla coltura indefinito di CRC cheratinociti 2. La metodologia è CRCestremamente robusto, con linee cellulari primarie stabilite con successo e mantenuto a tempo indeterminato dalla prostata e molti altri tessuti epiteliali normali e maligne 3. È importante sottolineare che la nostra tecnologia CRC ha permesso la rapida identificazione della base eziologico per papillomatosi respiratoria ricorrente in un paziente che non era riuscito un certo numero di trattamenti farmacologici precedenti. Inoltre, utilizzando normali e tumorali derivate dal CRC, l'identificazione di successo di un farmaco approvato dalla FDA, vorinostat, è stata fatta entro due settimane dalla biopsia dei tessuti iniziale. Il paziente è stato posto sulla vorinostat, conseguente trattamento di successo della loro malattia 4.
La prostata normale si compone di luminale, basale e le cellule neuroendocrine rari 5. cellule luminali formano lo strato epiteliale colonnare della ghiandola ed esprimono il recettore degli androgeni (AR), così come altri marcatori luminali quali citocheratine 8 e 18 e proantigene specifico-stato (PSA) 6. Viceversa, le cellule basali sono localizzati sotto lo strato luminale ed esprimono citocheratina 5 e p63, ma bassi livelli di AR 5. Abbiamo 7, 8, 9 e altri 10 hanno utilizzato con successo CRC prostata in preclinici indagini sensibilità ai farmaci meccanicistici. Tuttavia, se coltivate in condizioni di coltura tissutale 2D standard, queste cellule non riescono a cooperare pienamente AR segnalazione 10. È importante sottolineare che, quando posto sotto la capsula renale di topi immunodeficienti, il CRC riacquistato normale prostata architettura e la funzione ghiandolare che indica che CRC prostata mantengono il loro impegno lignaggio, quando sono immessi in un ambiente permissivo. Lo sviluppo del sistema di coltura cellulare basato inserto filtro qui descritto consente rapidi (2 settimane) differenziazione in vitro di CRC prostata come evidenziato by l'aumentata espressione di geni bersaglio AR e AR, nonché diminuzione dei livelli di p63.
Gli inserti del filtro utilizzati contengono membrane di policarbonato (dimensione dei pori, 0,4 micron) che possono sostenere la coltura di cellule di mammifero. Il sistema, sviluppato, fa uso di normali e maligne CRC prostata, piastre di coltura così 6 e gli inserti del filtro. Terreni di coltura cellulare condizionati dalle cellule J2 11 è posto nei media da camera e della prostata differenziazione di fondo nella camera superiore. Le tecniche descritte nel presente documento supportano la differenziazione delle cellule della prostata luminale entro una settimana 2 lasso di tempo, in linea con gli obiettivi della medicina personalizzata. Era inoltre indispensabile sviluppare le metodologie che consentono la profilatura molecolare, genetica e cellulare completa delle culture. Approcci per isolare DNA, RNA e proteine da cellule rilasciate dalla superficie del filtro sono stati sviluppati e semplificato per l'elaborazione del campione accurata ripetizione. Finally, la metodologia necessaria per la rimozione del filtro per consentire incorporamento, sezionamento e per H & E, immunoistochimica e immunofluorescenza colorazione, è completamente descritto.
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Protocol
1. Istituzione del Cell 3D cultura sistema di inserimento
- Posizionare inserti colture cellulari 2 policarbonato in un orientamento invertita (lato filtro verso l'alto) verso il basso in un piatto ben 6 (Figura 1A).
- Applicare uno strato sottile di 0,1% di gelatina in acqua al lato inferiore dell'inserto e lasciare asciugare (10-20 min) in una cappa di sicurezza biologica per mantenere la sterilità.
- Ripetere passaggio 1.2 altre due volte per un totale di 3 applicazioni di 0,1% di gelatina sugli inserti.
NOTA: Il rivestimento di gelatina aiuterà diffusione limite tra le camere. - Per raccogliere i CRC primari da condizioni di coltura standard, aggiungere 5 ml di PBS per lavare il pallone di coltura.
- Trypsinize le cellule utilizzando (1 mL per un T-25 e 2 mL di T-75) 0,25% tripsina-EDTA per 5 min a 37 ° C. toccare delicatamente il lato del pallone per aiutare a sloggiare le cellule. Quindi procedere per bloccare la reazione tripsina e raccogliere le cellule con l'aggiunta di 5 ml di DMEM completo.
- Raccogliere le cellule in una provetta da 15 ml. Centrifugare la provetta a 4 ° C e 188 XG e contare utilizzando un contatore di cellule automatico o un emocitometro.
- Risospendere 600.000 CRC in 250 microlitri mezzi (CM) condizionati e aggiungere alla correttamente orientata (lato del filtro verso il basso) la cultura inserto (Figura 1B). Questo è indicato come la camera interna.
Nota: CM è F-mezzi condizionati dalle cellule irradiate J2 e contiene 10 micron Y-27632 come precedentemente descritto 7, 8, 9, 11.
- Applicare 2 ml di CM alla camera esterna del 6 pozzetti e incubare a 37 ° C per una notte (per almeno 18 h).
- Rimuovere accuratamente il CM sulla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta e aggiungere lentamente supporti differenziamento (DM) alla camera interna con una mL pipetta 1 fino completa. Fare attenzione a non disturbare lo strato di cellule.
- Controllare le culture ogni giorno. Le cellule sane appaiono come mostrato in Figura 2.
- Modificare il CM nella camera esterna ogni giorno o ogni altro giorno a seconda del metabolismo delle cellule.
- Quando i media del interiore cambia colore da camera (giallo), rimuovere con attenzione i media sulla camera di filtro interno con un 1 mL o 200 microlitri pipetta.
- Aspirare il supporto nel esterna 6 ben camera di piatto con una punta di aspirazione.
- Usando una pipetta 1 ml, applicare lentamente DM fresco alla camera interna fino al completo. Fare attenzione a non graffiare o altrimenti rimuovere lo strato di cellule.
- Sostituire i media nella camera esterna con 2 ml di CM fresco.
- Mantenere le culture per 2 settimane, e quindi procedere al trattamento per l'isolamento bimolecular desiderato.
NOTA: Ogni riga nella piastra 6 bene, un totale di sei inserti (Figura 1B), dovrebbe essere processato per esperimento per acquisire abbastanza cellule per DNA, RNA o proteine per l'analisi. - mezzi Aspirare nella camera esterna e risciacquare con 2 ml di tampone fosfato salino (PBS).
- Rimuovere con attenzione dei media dalla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta e aggiungere 500 microlitri di PBS. Evitare di raschiare o comunque disturbare le cellule sulla membrana.
- Aspirare PBS dalla camera esterna e trasferire PBS dalla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta. Una volta che il PBS è stato rimosso, procedere direttamente alla applicazione appropriata descritto di seguito. Non lasciare che la membrana si asciughi. La coltura può essere mantenuto brevemente in PBS finché l'applicazione è pronto per iniziare.
3. L'elaborazione dei Filtri per Pellet Banking
- Aggiungere 100 microlitri 0,25% tripsina-EDTA per ogni camera interna e incubare per 5 min a 37 ° C.
- In breve e con attenzione agitano / raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta 200 microlitri mentre pipettando su e giù (evitare puncturing la membrana). Incubare per 1 min a 37 ° C.
- Aggiungere 250 ml di CM alla prima camera interna e pipetta su e giù delicatamente per lavare il filtro.
- Trasferimento risospesa celle alla camera del filtro adiacente che contiene le stesse condizioni di media e ripetere pipettando su e giù.
- Ripetere questa procedura per ciascuno di detti inserti di un'unica condizione. Raccogliere e trasferire le cellule in una provetta da 1,5 centrifuga.
- Lavare ogni camera interna con un ulteriore 100-200 ml di CM per raccogliere tutte le cellule rimanenti. Aggiungere alla provetta da 1,5 mL centrifuga nel passaggio 3.5.
- Spin le cellule a 423 xg in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min.
- Aspirare il surnatante e lavare il pellet di cellule una volta con 1000 ml di PBS.
- Spin nuovo a 423 xg in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min.
- Aspirare PBS e congelamento a -80 ° C per un uso successivo.
4. L'elaborazione dei Filtri per RNA o DNA Isolation
- Poiché il filtro può dissociarsi dal dell'inserto, lavare la membrana del filtro dissociato pipettando la soluzione di estrazione su e giù. Raccogliere quanto più del reagente di estrazione possibile inclinando la piastra ben 6 ed aspirando il liquido residuo.
5. L'elaborazione dei Filtri per l'isolamento delle proteine
- Posizionare la cartuccia del filtro nella piastra 6 bene su ghiaccio. Per la camera interna, aggiungere 10 ml di tampone proteine lisi integrato con 1 fluoruro di sodio mM (NaF), 1 mM di sodio vanadato (NAV), 100 mM dithiothreitol (DTT) e 100 ml di cocktail di anti-proteasi.
- Agitare / raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta 20 ml mentre pipettando su e giù. Evitare di generare bolle nel tampone di lisi.
- Incubare la piastra 6 bene con cartucce filtranti in ghiaccio per 10 min.
- Ripetere raschiatura e quindi risciacquare la superficie della membrana con il tampone di lisi.
- Raccogliere i lisati dai 6 inserti e trasferire in una provetta da 1,5 ml centrifuga sul ghiaccio.
- Risciacquare la prima membrana con altri 10 ml di tampone di lisi e trasferimento al filtro successivo.
- Ripetere il passaggio 5.6 per tutti gli inserti, la raccolta di qualsiasi soluzione tampone di lisi residuo e aggiungere al 1,5 ml di tubo (passo 5,5).
- Incubare il campione in ghiaccio per un ulteriore 5 min.
- Spin alla massima velocità (16.873 xg in una centrifuga da tavolo) per 15 min a 4 ° C.
- Pipetta lisato surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml.
- Procedere all'analisi di concentrazione di proteine o store lisati a -80 ° C.
6. elaborazione per H & E e Immuno-colorazione
- Aggiungere 500 microlitri e 1 ml di 10% NBF (formalina neutra tamponata) alla camera interna ed esterna e lasciate incubare una notte a 4 ° C.
- Aspirare il NBF dalla camera esterna e aggiungere 1 ml di agarosio idrossietil (HEA) l'elaborazione di gel per un mL centrifuga 1.5. Lentamente sciogliere l'agarosio in un forno a microonde con bassa potenza e ripetuto 10-20 s impulsi fino a quando l'agarosio è sciolto.
- Tenere il HEA in un bagno caldo a 37 ° C per evitare la solidificazione fino al momento dell'uso.
- Rimuovere il NBF dalla camera interna e applicare 25 ml di HEA fusa alla camera interna e consentire l'agarosio solidificare per 2-5 min.
- Wet 2 schiuma pastiglie istologia a 10% NBF e mettere un pad in una cassetta embedding (vedi Figura 3D).
- Utilizzare un # 11 bisturi (che ha una lama a punta fine molto forte) di segnare il filtro dal lato inferiore dell'insertocamera, parzialmente svincolandola dalla camera inserto in plastica.
- Mettere una piccola quantità (100-200 ml) di NBF in una capsula di Petri e immergere il filtro parzialmente sloggiato nel NBF (Figura 3A).
- Con # 10 bisturi, premere delicatamente contro il centro del filtro, dall'interno della camera di inserto, per rimuovere completamente il filtro dal inserto barilotto (Figura 3B). Se non vi è alcuna parte del filtro che è ancora attaccato alla canna, tagliare con il bisturi.
- Tagliare il filtro HEA rivestita a metà con il # 10 bisturi lama (Figura 3C).
- Disporre ciascuna metà del filtro sul tappetino in gomma nella cassetta istologia preparato al punto 6.4 (Figura 3D).
- Aggiungere il secondo il 10% NBF spugna imbevuta alla cassetta, sandwich il filtro.
- Snap sigillare la cassetta, posto in NBF, e incubare durante la notte.
- filtri di processo in blocchi di paraffina per il sezionamento e la colorazione comedescritto in precedenza 12.
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Representative Results
Il sistema basato su inserto coltura cellulare è una procedura relativamente semplice e rapida per la produzione di colture 3D di CRC prostata che supporta la differenziazione delle cellule del lume. Uno schema del sistema è mostrato (Figura 1A) evidenziando l'applicazione del rivestimento di gelatina alla superficie inferiore della cartuccia filtrante. Gli inserti sono ribaltati solo per l'applicazione della gelatina. Nella Figura 1B i filtri sono nell'orientamento appropriato per la coltura. Utilizzando un inserto cellulare trasparente, un'immagine rappresentativa di una sana cultura prostata CRC 3D è mostrato (10X) (Figura 2). La densa stratificazione di CRC sani dimostrato è tipico, dopo la fondazione e può essere osservata con un microscopio di luce standard. Durante insediamento, è fondamentale per visualizzare il livello di celle formate per garantire che il metodo è compatibile con una data linea cellulare e che l'attaccamento appropriato e laYering delle cellule si sono verificati.
HEA viene applicata all'interno dell'inserto come sopra. Dopo l'applicazione del HEA, bisogna fare attenzione quando aver eseguito il filtro per rimuoverlo dalla inserto (Figure 3A, 3B). In tutte le fasi (figure 3A-3D), cura deve essere esercitato per minimizzare i movimenti inutili dello strato HEA sul filtro con celle. Lo strato CRC può essere facilmente interrotto e danneggiato durante il trasferimento al H & E cassette (Figura 3D). Dopo asportazione del filtro HEA rivestita dalla canna di plastica (Figure 3A-3C), il filtro può essere dimezzato e trattati per sezionamento e colorazione con cassette incorporare standard (Figura 3D). Dividere il filtro a metà è importante per massimizzare la superficie disponibile per il sezionamento trasversale su H & E e IF.
immunofluorescenza colorazionenonché campo chiaro (BF) immagini delle cellule coltivate sul livello filtro sono stati raccolti usando un microscopio confocale a disco con funzionalità filatura DSU (Disk Scan Unit). Risultati rappresentativi per istologia e H & E colorazione sono mostrati in una sezione trasversale dell'inserto filtro e cellule (20X) (Figura 4). Con una cura adeguata, dimostriamo che uno strato CRC sugli inserti filtro può essere sezionato e macchiato, come è pratica standard per l'esame istologico dei tessuti. Durante sezionamento, è possibile che il CRC a distaccarsi dal filtro come strato intatto di cellule come dimostrato (Figura 4). L'immagine BF mostra strati cellule multistrato sopra della membrana porosa (Figura 5A). Le singole immagini fluorescenti per nuclei (DAPI, figura 5B), p63 (Figura 5C) e AR (Figura 5D) sono mostrati, come è l'unione di tutte le tre marcatori di fluorescenza (Figura 5e). Infine, un composite BF e IF sovrapposizione viene mostrato (Figura 5F), che stabilisce la localizzazione del segnale di fluorescenza relativa alle cellule e il filtro. La sovrapposizione della macchia DAPI con il p63 se la colorazione dimostra chiaramente alcune cellule ancora in uno stato proliferativo. La localizzazione di AR IF colorazione nel nucleo è indicativo di riattivazione funzionale di AR in cellule della prostata.
Un confronto tra l'IF del nostro sistema inserto filtro ed un tessuto prostatico sezionato è mostrato (figure 6A, 6B) per dimostrare la somiglianza in sviluppo del nostro strato dell'inserto CRC a quella dell'epitelio prostatico. Il condotto prostata mostra l'espressione di p63, coerente con le cellule della prostata basali. p63 colorazione è visto anche nei CRC sull'inserto. Una percentuale più elevata p63 cellule esprimenti stata osservata nel nostro inserto rispetto alla sezione di tessuto intatto. Inoltre, sia nucleare e citoplasmatica AR sono visti nel TIS prostata citare in giudizio la sezione e mentre i CRC sul inserto del filtro spettacolo espressione meno complesso AR, entrambi espressione AR nucleare e colorazione citoplasmatica è visto, simile alla prostata intatto.
Figura 1: Rappresentante immagini della cultura Dish 6-bene e Insert che compongono il sistema cultura in 3D. (A) inserti invertito per l'applicazione del rivestimento di gelatina al lato inferiore del filtro (freccia). A ingrandisci dell'inserto e filtro è spettacolo (nel riquadro). (B) inserti posizionati correttamente. Le camere interne ed esterne del sistema sono mostrate (frecce). La riga inscatolato in B mostra come campioni multipli sono ottenuti per una data condizione sperimentale. Al termine del periodo di crescita due settimane questi inserti possono essere raggruppati per produrre materiale sufficiente per l'analisi."Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: un'immagine rappresentativa di uno strato di sana CRC seminate su un trasparente filtro a membrana viene mostrato. Entrambe le camere interne ed esterne contenevano mezzi condizionata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: un'immagine rappresentativa di un filtro Dimezzato in due sezioni e messo in una cassetta di paraffina per l'incorporamento. (A) del filtro inserto con rivestimento HEA dopo il gol e prima della rimozione. (B) La cartuccia del filtro rilasciato dalla canna policarbonato. (
Figura 4: Un rappresentante H & E macchiato Sezione trasversale del filtro Inserimento e cellule (20X). Sia la membrana (basso) e strato di cellule (top) sono mostrati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Una serie di rappresentante campo luminoso (BF) e immunofluorescenza (IF) ImmaginiLe cellule sezionato sul filtro (40X). sono mostrate sezioni trasversali del filtro e le cellule. Un'immagine BF senza macchia delle cellule sulla superficie del filtro (5A) è accompagnato da immagini per il nucleo DAPI macchiato (5B) e immunofluorescenza colorazione per due diverse proteine, p63 (5C) e il recettore degli androgeni (AR, 5D). Una sovrapposizione composito sezioni cellulari (5E, F) definisce la localizzazione dei segnali IF nell'ambito delle cellule e del filtro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Un rappresentante immunofluorescenza (IF) Immagine di celle sezionati sul filtro contro una sezione di prostata Epitelio dal tessuto (20X).Una immagine in sezione trasversale di una cartuccia del filtro è mostrato (Figura 6A) rispetto agli strati epiteliali duttali di una prostata intatta (Figura 6B). La colorazione del p63, AR e il nucleo è stata eseguita come in Figura 5. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
linee cellulari primarie sono una piattaforma importante e in rapido sviluppo per la ricerca sul cancro. Il sistema di coltura 3D basato su inserto cultura sostiene la differenziazione della prostata CRC primari entro un lasso di tempo di due settimane. Il metodo del filtro CRC rappresenta un nuovo metodo di media produttività per la ricerca della prostata. Esistenti modelli del mouse PDX sono in termini di tempo ed estremamente costoso, e molti dei campioni PDX non possono essere coltivate in cultura, limitando la sperimentazione investigatore-avviato e la loro utilità. Inoltre, mentre i tassi di successo di stabilire PDX variano notevolmente 13, il metodo CRC ha un alto tasso di successo nella creazione di linee cellulari 3. Riteniamo che il nostro sistema sia complementare all'approccio organoide della prostata basate su R-spondina; Tuttavia, la mancanza di successo per quanto riguarda la creazione di organoidi da cancro alla prostata primaria stato segnalato 14. Inoltre, i media, i metodi di creazione,e manutenzione di CRC sono notevolmente più semplice rispetto all'approccio organoide prostata R-spondina-based. Come ulteriore vantaggio, i CRC possono essere definiti e impiegati per testare abbinati culture normali e tumorali per i confronti diretti molecolari.
Alcuni problemi tecnici rimangono da affrontare quando si stabilisce questo sistema. In primo luogo, il rivestimento di gelatina applicata alla parte inferiore del filtro inserto aiuta, ma non elimina, la diffusione dei media attraverso la membrana. Cambiamenti dei media frequenti sono utilizzati per mantenere il rispettivo gradiente di differenziazione (strato di cellule superiore o apicale) vs crescita (strato inferiore o basale delle cellule) condizioni all'interno della camera. In secondo luogo, successo culture 3D CRC richiesta una relativamente alta densità di semina cellulare. Bassa densità di semina diedero scarsi risultati per quanto riguarda l'integrità dello strato di cellule che si sviluppa sulla superficie del filtro. Questa è una considerazione comune quando la coltura CRC, man mano che crescono più vigorosamente quando mantenuto unalta densità di cellule T. Infine, la rimozione corretta e successiva incorporazione di paraffina dello strato di cellule intatte sia critico per definire l'estensione della differenziazione cellulare. L'aggiunta di idrossietil agarosio (HEA) sia diminuita perdita di cellule e migliorato la morfologia delle cellule nel rispetto ai filtri non incorporati (non mostrato). Una volta correttamente incorporato, i filtri sono stati sezionati e trattati in modo indistinguibile da tipici campioni di cellule e tessuti.
Stiamo appena cominciando a emulare l'architettura del dell'epitelio prostatico utilizzando questo metodo filtro. Ulteriori modifiche alle condizioni di coltura, ai media e al substrato sono garantiti, che può essere affrontato con facilità. Ad esempio, i media differenziazione riformulati che possono meglio favorire luminale vs differenziazione basale possono essere rapidamente testati. Dal momento che l'infezione lentivirale di CRC è stata eseguita con la stessa facilità con le cellule tumorali commerciali 7 e il CRC 2D avere alcosì state trasfettate con vettori di tecnologia editing CAS9 / gene CRISPR di modificare in modo permanente il genoma della cellula (dati non riportati), l'effetto dei geni mutati, eliminati o riparati possono essere testati. Allo stesso modo, il monitoraggio lignaggio può essere reso possibile con l'introduzione di specifici geni reporter lignaggio.
Oltre a modificare i media o le cellule, modifiche alla superficie del filtro possono essere testati. Diversi substrati membrana filtro sono disponibili in commercio. Inoltre, abbiamo trovato che la matrice extracellulare commerciale fornisce un ambiente di crescita adatto quando applicato alla parte interna del filtro. Come uno degli obiettivi del sistema di inserimento è di modellare meglio microambiente prostata, forse le modifiche più interessante potrebbe essere l'introduzione di cellule stromali normali o tumorali derivate, sia in co-coltura con le CRC entro i confini dell'inserto o nella camera inferiore per condizionare i mezzi di crescita. Modifica l'inserto bene con sezioni of tessuto prostatico decellularized è anche possibile. In questo approccio, stromali / interazioni epiteliali possono consentire alle cellule primarie di utilizzare il tessuto decellularized come impalcatura per la crescita.
La capacità di stabilire cellule primarie e per fornire in seguito le condizioni per la loro differenziazione è un formato ideale per la ricerca di più biologicamente rilevanti in normale sviluppo ghiandolare e per la ricerca sul cancro. Il sistema qui descritto fornisce una piattaforma per cui un numero illimitato di tipi cellulari e modifiche possono essere combinati per adeguare il sistema alle singole esigenze sperimentali e di raccogliere in modo affidabile i campioni da analizzare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da T32 (CA 9686-18) e TL1 (TL1TR001431) premi post-dottorato borsa di formazione (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), così come U01 PAR-12-095 (Kumar) e P30 CA051008-21 (Weiner). la fissazione del campione, sezionamento e colorazione è stata eseguita nel Lombardi Comprehensive Cancer Center e Istologia del tessuto Shared Resource. Ringraziamo Richard Schlegel per le discussioni utili. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Cancer Institute e il National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
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