Abstract
सशर्त reprogrammed कोशिकाओं (सीआरसी) प्राथमिक सेल संस्कृति और रोगी व्युत्पन्न सेल लाइनों के व्यापक "जी biobanks" विकसित करने की क्षमता के लिए एक स्थायी तरीका प्रदान करते हैं। उपकला कोशिकाओं के कई प्रकार के लिए विभिन्न तीन आयामी (3 डी) संस्कृति दृष्टिकोण वर्णित किया गया है कि एक बेहतर भेदभाव राज्य समर्थन करते हैं। जबकि सीआरसी ऊतक, जहां से वे अलग कर रहे हैं करने के लिए उनके वंश प्रतिबद्धता को बनाए रखने, वे जब सामान्य दो आयामी (2 डी) संस्कृति परिस्थितियों में विकसित मूल के ऊतक के साथ जुड़े भेदभाव मार्करों के कई व्यक्त करने के लिए असफल। प्रोस्टेट कैंसर अनुसंधान के लिए रोगी व्युत्पन्न सीआरसी के आवेदन को बढ़ाने के लिए, एक 3 डी संस्कृति प्रारूप में परिभाषित किया गया है कि एक तेजी से (2 सप्ताह कुल) ल्यूमिनल सेल दोनों सामान्य और ट्यूमर व्युत्पन्न प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं में भेदभाव सक्षम बनाता है। इस के साथ साथ, एक फिल्टर डालने आधारित प्रारूप संवर्धन और दोनों सामान्य और घातक प्रोस्टेट सीआरसी के भेदभाव के लिए वर्णित है। एक डेप्रक्रियाओं सेल संग्रह और immunohistochemical और immunofluorescent धुंधला के लिए प्रसंस्करण के लिए आवश्यक की पूंछ विवरण प्रदान की जाती हैं। सामूहिक रूप से 3 डी संस्कृति प्रारूप में वर्णित है, प्राथमिक सीआरसी लाइनों के साथ संयुक्त, एक महत्वपूर्ण मध्यम biospecimen आधारित प्रोस्टेट अनुसंधान के लिए throughput मॉडल प्रणाली उच्च करने के लिए प्रदान करता है।
Introduction
पहचान और कैंसर के उपचार के उपयोग कि व्यक्तियों को व्यक्तिगत कर रहे हैं कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में एक प्राथमिक लक्ष्य कर रहे हैं। हाल ही में, नए तरीकों को विकसित किया गया है कि प्राथमिक सेल संस्कृतियों की स्थापना में अधिक से अधिक आराम के लिए अनुमति देते हैं, संभवतः दोनों की पहचान करने और व्यक्तिगत उपचारों का परीक्षण करने के तरीके प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, आर spondin आधारित प्रोस्टेट organoid दृष्टिकोण 1 की अनुमति देता है के लिए एक वाणिज्यिक बाह्य मैट्रिक्स में सामान्य और मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के तीन आयामी (3 डी) संवर्धन (जैसे, Matrigel), कोशिकाओं की सशर्त प्रोग्रामिंग (सीआरसी) विधि है, जबकि जॉर्ज टाउन 2 में विकसित की है, 3 और मानक 2 डी संस्कृति की स्थिति का इस्तेमाल करता है। विशेष रूप से, एक रो kinase अवरोध (वाई 27,632) और विकिरणित J2 murine fibroblast फीडर कोशिकाओं के संयोजन keratinocyte सीआरसी 2 के अनिश्चितकालीन संवर्धन के लिए सीसा। सीआरसी पद्धति हैबेहद मजबूत, साथ प्राथमिक सेल लाइनों को सफलतापूर्वक स्थापित किया है और प्रोस्टेट और कई अन्य सामान्य और घातक उपकला ऊतकों 3 से अनिश्चित काल के लिए बनाए रखा। महत्वपूर्ण बात है, हमारे सीआरसी प्रौद्योगिकी एक मरीज जो पिछले दवा उपचार के एक नंबर में विफल रहा था में आवर्तक श्वसन papillomatosis के लिए etiological आधार की तेजी से पहचान के लिए अनुमति दी। इसके अलावा, सामान्य और ट्यूमर व्युत्पन्न सीआरसी का उपयोग कर, एक एफडीए के सफल पहचान दवा को मंजूरी दे दी vorinostat, प्रारंभिक ऊतक बायोप्सी के दो सप्ताह के भीतर बनाया गया था। रोगी vorinostat पर रखा गया था, उनकी बीमारी 4 का सफल इलाज हो जाती है।
सामान्य प्रोस्टेट ग्रंथि ल्यूमिनल, बेसल और दुर्लभ neuroendocrine कोशिकाओं 5 के शामिल है। Luminal कोशिकाओं ग्रंथि के स्तंभ उपकला परत फार्म और एण्ड्रोजन रिसेप्टर (ए आर), साथ ही इस तरह cytokeratins 8 और 18 और समर्थक के रूप में अन्य ल्यूमिनल मार्करों व्यक्तराज्य विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) 6। इसके विपरीत, बेसल कोशिकाओं ल्यूमिनल परत के नीचे स्थानीय और cytokeratin 5 और P63, लेकिन एआर 5 के निम्न स्तर को व्यक्त कर रहे हैं। हम 7, 8, 9 और अन्य 10 को सफलतापूर्वक प्रोस्टेट सीआरसी preclinical यंत्रवत दवा संवेदनशीलता जांच में इस्तेमाल किया है। हालांकि, जब मानक 2 डी टिशू कल्चर की स्थिति के अधीन हो, इन कोशिकाओं को पूरी तरह से संलग्न 10 सिगनल एआर के लिए असफल। महत्वपूर्ण बात है, जब immunodeficient चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत रखा गया है, सीआरसी सामान्य प्रोस्टेट ग्रंथियों वास्तुकला और समारोह आ दर्शाता है कि प्रोस्टेट सीआरसी उनके वंश प्रतिबद्धता जब एक अनुमोदक वातावरण में रखा बरकरार रहती है। फिल्टर डालने के आधार पर सेल संस्कृति प्रणाली यहाँ वर्णित के विकास के तेजी से (2 सप्ताह) के लिए अनुमति देता है इसका सबूत ख के रूप में प्रोस्टेट सीआरसी की इन विट्रो भेदभावY एआर और एआर लक्ष्य जीन की वृद्धि की अभिव्यक्ति के रूप में अच्छी तरह से कमी आई है के रूप में P63 के स्तर।
फिल्टर का इस्तेमाल किया सम्मिलित पॉली कार्बोनेट झिल्ली (ताकना आकार, 0.4 माइक्रोन) कि स्तनधारी कोशिकाओं के संवर्धन का समर्थन कर सकते हैं शामिल। प्रणाली, के रूप में विकसित की है, सामान्य और घातक प्रोस्टेट सीआरसी, 6 अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन और फिल्टर आवेषण का उपयोग करता है। J2 कोशिकाओं 11 से वातानुकूलित सेल संस्कृति मीडिया शीर्ष कक्ष में नीचे कक्ष और प्रोस्टेट फर्क मीडिया में रखा गया है। तकनीक के साथ साथ एक 2 सप्ताह समय सीमा के भीतर प्रोस्टेट ल्यूमिनल सेल भेदभाव, व्यक्तिगत दवा के लक्ष्यों के अनुरूप समर्थन का वर्णन किया। यह भी तरीके में है कि संस्कृतियों के व्यापक, आणविक और सेलुलर आनुवंशिक रूपरेखा के लिए अनुमति देने के लिए विकसित करने के लिए जरूरी था। फिल्टर सतह से जारी कोशिकाओं से डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के लिए अलग दृष्टिकोण विकसित और सटीक दोहराने नमूना प्रसंस्करण के लिए सुव्यवस्थित किया गया है। Finally, कार्यप्रणाली, एम्बेडिंग सक्षम करने के लिए फिल्टर को दूर करने के लिए सेक्शनिंग और एच ई, प्रतिरक्षाऊतकरसायन और immunofluorescent धुंधला के लिए आवश्यक है, पूरी तरह से वर्णन किया गया है।
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Protocol
1. 3 डी सेल की स्थापना संस्कृति डालने प्रणाली
- एक औंधा अभिविन्यास (अप फिल्टर पक्ष) एक 6 अच्छी तरह से थाली (चित्रा 1 ए) में नीचे में 2 पॉली कार्बोनेट सेल संस्कृति सम्मिलित रखें।
- डालने के नीचे की ओर करने के लिए पानी में 0.1% जिलेटिन की एक पतली परत लागू करें और (10-20 मिनट) सूखे के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझपन बनाए रखने के लिए अनुमति देते हैं।
- दोहराएँ कदम 1.2 सम्मिलित करता है पर 0.1% जिलेटिन की 3 अनुप्रयोगों की कुल के लिए दो बार।
ध्यान दें: जिलेटिन कोटिंग कक्षों के बीच सीमा का प्रसार में मदद मिलेगी। - मानक संस्कृति की स्थिति से प्राथमिक सीआरसी इकट्ठा करने के लिए, संस्कृति कुप्पी धोने के लिए पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.25% trypsin EDTA (एक टी 25 और टी 75 के लिए 2 एमएल के लिए 1 एमएल) का उपयोग कोशिकाओं Trypsinize। धीरे कोशिकाओं dislodging में सहायता करने के लिए कुप्पी की ओर नल। तब trypsin प्रतिक्रिया को रोकने और पूरा DMEM के 5 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए आगे बढ़ें।
- लीजिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं। 4 डिग्री सेल्सियस और 188 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और एक स्वचालित सेल काउंटर या एक hemocytometer का उपयोग गिनती।
- 250 μL वातानुकूलित मीडिया (मुख्यमंत्री) में 600,000 सीआरसी पुनः निलंबित और ठीक से उन्मुख (फिल्टर नीचे की ओर) संस्कृति डालने (चित्रा 1 बी) में जोड़ें। यह भीतरी कक्ष के रूप में जाना जाता है।
नोट: मुख्यमंत्री एफ मीडिया विकिरणित J2 कोशिकाओं से वातानुकूलित है और जैसा कि पहले 7, 8, 9, 11 में वर्णित 10 माइक्रोन वाई 27,632 शामिल हैं।
- 6 अच्छी तरह से थाली के बाहरी कक्ष में मुख्यमंत्री के 2 एमएल लागू करें और (कम से कम 18 घंटे के लिए) रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- ध्यान से एक 1 एमएल या 200 μL विंदुक के साथ भीतरी कक्ष पर मुख्यमंत्री को हटाने और धीरे-धीरे पूरी होने तक 1 एमएल विंदुक के साथ भीतरी कोठरी में भेदभाव मीडिया (डीएम) जोड़ें। सेल परत को परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहें।
- हर दिन संस्कृतियों की जाँच करें। के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया स्वस्थ कोशिकाओं दिखाई देते हैं।
- हर दिन या कोशिकाओं के चयापचय के आधार पर हर दूसरे दिन बाहरी कक्ष में मुख्यमंत्री बदलें।
- भीतरी कक्ष परिवर्तन रंग (पीला) की मीडिया, ध्यान से एक 1 एमएल या 200 μL पिपेट के साथ भीतरी फिल्टर कक्ष पर मीडिया को दूर करते हैं।
- एक Aspirating टिप के साथ बाहरी 6 अच्छी तरह से थाली कक्ष में मीडिया aspirate।
- 1 एमएल पिपेट का उपयोग करना, धीरे-धीरे पूरी होने तक भीतरी कक्ष के लिए ताजा डीएम लागू होते हैं। परिमार्जन करने के लिए नहीं है या अन्यथा सेल परत को बेदखल सावधान रहें।
- ताजा मुख्यमंत्री के 2 एमएल के साथ बाहरी कक्ष में मीडिया बदलें।
- 2 सप्ताह के लिए संस्कृतियों को बनाए रखने, और तब इच्छित bimolecular अलगाव के लिए प्रसंस्करण के लिए आगे बढ़ें।
नोट: 6 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक पंक्ति, छह सम्मिलित करता है (चित्रा 1 बी) के एक कुल, डी.एन. के लिए पर्याप्त कक्षों का अधिग्रहण करने के प्रयोग के प्रति कार्रवाई की जानी चाहिएए, शाही सेना या विश्लेषण के लिए प्रोटीन। - बाहरी कक्ष में महाप्राण मीडिया और 2 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ कुल्ला।
- ध्यान से एक 1 एमएल या 200 μL विंदुक के साथ भीतरी कक्ष से मीडिया को हटाने और 500 μL पीबीएस जोड़ें। स्क्रैप या अन्यथा झिल्ली पर कोशिकाओं को परेशान करने से बचें।
- बाहरी कक्ष से महाप्राण पीबीएस और ध्यान से एक 1 एमएल या 200 μL विंदुक के साथ भीतरी कक्ष से पीबीएस को हटा दें। एक बार पीबीएस हटा दिया गया है, नीचे विस्तृत उचित आवेदन करने के लिए सीधे आगे बढ़ना। झिल्ली बाहर सुखाने के लिए अनुमति न दें। संस्कृति पीबीएस में संक्षेप में रखा जा सकता है जब तक आवेदन शुरू करने के लिए तैयार है।
3. गोली बैंकिंग के लिए फिल्टर प्रसंस्करण
- प्रत्येक भीतरी कक्ष के लिए 100 μL 0.25% trypsin EDTA जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- संक्षेप में और ध्यान से आंदोलन / एक 200 μL विंदुक के साथ झिल्ली सतह पर कोशिकाओं परिमार्जन जबकि ऊपर और नीचे pipetting (punc से बचनेझिल्ली ट्यूरिंग)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए सेते हैं।
- फिल्टर कुल्ला करने के लिए पहली भीतरी कक्ष को मुख्यमंत्री के 250 μL जोड़ें और विंदुक ऊपर और नीचे धीरे।
- स्थानांतरण आसन्न फिल्टर कक्ष है कि एक ही मीडिया शर्तों में शामिल है और ऊपर pipetting दोहराने और नीचे करने के लिए कोशिकाओं resuspended।
- एक भी शर्त का सम्मिलित करता है में से प्रत्येक के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। लीजिए और एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण।
- मुख्यमंत्री के एक अतिरिक्त 100-200 μL के साथ प्रत्येक भीतरी कक्ष कुल्ला किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए। 3.5 चरण में 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़े।
- 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक microcentrifuge में 423 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 1000 μL पीबीएस के साथ एक बार सेल गोली धो लें।
- फिर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक microcentrifuge में 423 XG पर स्पिन।
- महाप्राण पीबीएस और बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
4. शाही सेना या डीएनए अलगाव के लिए फिल्टर प्रसंस्करण
- फिल्टर डालने से अलग कर देना कर सकते हैं, निष्कर्षण समाधान ऊपर और नीचे pipetting द्वारा disassociated फिल्टर झिल्ली धो लें। 6 अच्छी तरह से थाली झुकने और किसी भी अवशिष्ट तरल aspirating द्वारा संभव के रूप में निकासी अभिकर्मक के रूप में ज्यादा ले लीजिए।
5. प्रोटीन अलगाव के लिए फिल्टर प्रसंस्करण
- बर्फ पर 6 अच्छी तरह से थाली में फिल्टर डालने रखें। भीतरी कोठरी में जोड़ने के लिए, 10 प्रोटीन lysis बफर 1 मिमी सोडियम फ्लोराइड (NAF), 1 मिमी सोडियम vanadate (एनएवी), 100 मिमी dithiothre के साथ पूरक की μLitol (डीटीटी) और विरोधी प्रोटीज कॉकटेल के 100 μL।
- आंदोलन / जबकि ऊपर और नीचे pipetting एक 20 μL विंदुक के साथ झिल्ली सतह पर कोशिकाओं परिमार्जन। lysis बफर में बुलबुले पैदा करने से बचें।
- 10 मिनट के लिए बर्फ पर फिल्टर आवेषण के साथ 6 अच्छी तरह से थाली सेते हैं।
- स्क्रैप दोहराएँ और फिर lysis बफर के साथ झिल्ली सतह कुल्ला।
- 6 सम्मिलित से lysates लीजिए और बर्फ पर एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण।
- एक अतिरिक्त 10 अगले फिल्टर करने के लिए lysis बफर और हस्तांतरण की μL के साथ पहली बार झिल्ली कुल्ला।
- सभी आवेषण के लिए दोहराएँ कदम 5.6, किसी भी अवशिष्ट lysis बफर समाधान इकट्ठा करने और 1.5 एमएल ट्यूब (5.5 कदम) के लिए जोड़ें।
- एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अधिकतम गति (एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में 16,873 XG) पर स्पिन।
- एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में पिपेट lysate सतह पर तैरनेवाला।
- प्रोटीन एकाग्रता या एसटू का विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें-80 डिग्री सेल्सियस पर lysates रहे हैं।
6. एच ई और इम्यूनो-धुंधला के लिए प्रसंस्करण
- 500 μL और 10% के 1 एमएल NBF (तटस्थ बफर formalin) भीतरी और बाहरी कक्ष में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते करते हैं।
- बाहरी कक्ष से NBF Aspirate और 1 एमएल hydroxyethyl agarose (HEA) एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र प्रसंस्करण जेल जोड़ें। धीरे-धीरे कम बिजली का उपयोग कर एक माइक्रोवेव में agarose पिघल और 10-20 रों दालों दोहराया जब तक agarose पिघल रहा है।
- का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक solidification को रोकने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म स्नान में HEA रखें।
- भीतरी कक्ष से NBF निकालें और भीतरी कोठरी में पिघला हुआ HEA का 25 μL लागू करते हैं और agarose 2-5 मिनट के लिए जमना करने की अनुमति।
- 10% NBF में गीले 2 फोम ऊतक विज्ञान पैड और एक embedding कैसेट में एक पैड जगह (चित्रा 3 डी देखें)।
- डालने के नीचे की ओर से फिल्टर स्कोर करने के लिए एक # 11 ब्लेड छुरी का उपयोग करें (जो एक बहुत ही तेज है, ठीक उठाई ब्लेड है)चैम्बर, आंशिक रूप से प्लास्टिक डालने कक्ष से यह जारी है।
- एक पेट्री डिश में NBF की एक छोटी राशि (100-200 μL) प्लेस और NBF (चित्रा 3 ए) में आंशिक रूप से उखाड़ फेंकना फिल्टर विसर्जित कर दिया।
- एक # 10 ब्लेड छुरी के साथ, धीरे डालने के कक्ष के अंदर से, फिल्टर के बीच के खिलाफ प्रेस, पूरी तरह से सम्मिलित बैरल (चित्रा 3 बी) से बेदखल करने के लिए फिल्टर। अगर वहाँ फिल्टर है कि अभी भी प्रति बैरल से जुड़ा हुआ है के किसी भी भाग है, छुरी के साथ इसे तोड़।
- # 10 ब्लेड छुरी (चित्रा 3 सी) के साथ आधे में HEA लेपित फिल्टर कटौती।
- फिल्टर के प्रत्येक आधा कदम 6.4 (चित्रा 3 डी) में तैयार ऊतक विज्ञान कैसेट में फोम पैड पर रखें।
- कैसेट के लिए दूसरा 10% NBF भिगो स्पंज जोड़ें, फिल्टर sandwiching।
- स्नैप कैसेट, NBF में जगह सील, और रातोंरात सेते हैं।
- सेक्शनिंग और के रूप में धुंधला के लिए पैराफिन ब्लॉकों में प्रक्रिया फिल्टरपहले 12 में वर्णित है।
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Representative Results
सेल संस्कृति डालने आधारित प्रणाली प्रोस्टेट सीआरसी ल्यूमिनल सेल भेदभाव का समर्थन करता है कि 3 डी संस्कृतियों के उत्पादन के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और तेजी से प्रक्रिया है। प्रणाली का एक योजनाबद्ध (चित्रा 1 ए) फिल्टर डालने के नीचे की सतह के लिए जिलेटिन कोटिंग के आवेदन पर प्रकाश डाला दिखाया गया है। सम्मिलित केवल जिलेटिन के आवेदन के लिए पलट कर रहे हैं। चित्रा 1 बी में फिल्टर संवर्धन के लिए उचित अभिविन्यास में हैं। एक पारदर्शी सेल डालने का उपयोग करना, एक स्वस्थ प्रोस्टेट 3 डी सीआरसी संस्कृति का एक प्रतिनिधि छवि में दिखाया गया है (10X) (चित्रा 2)। स्वस्थ सीआरसी के घने लेयरिंग प्रदर्शन स्थापना के बाद ठेठ और मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर देखे जा सकते हैं। प्रारंभिक स्थापना के दौरान, यह सुनिश्चित करने के लिए कि विधि एक दिया सेल लाइन के साथ संगत है का गठन कोशिकाओं की परत और कहा कि उचित लगाव और ला कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण हैकोशिकाओं के Yering हुई है।
जैसा कि ऊपर उल्लिखित HEA डालने के अंदर करने के लिए लागू किया जाता है। HEA के आवेदन के बाद, ध्यान जब डालने (आंकड़े 3 ए, 3 बी) से इसे हटाने के लिए फिल्टर स्कोरिंग लिया जाना चाहिए। सभी चरणों (आंकड़े 3 ए 3 डी) में, देखभाल भी कोशिकाओं के साथ फिल्टर पर HEA परत के अनावश्यक आंदोलन को कम करने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए। सीआरसी परत आसानी से बाधित और एच ई कैसेट (चित्रा 3 डी) करने के लिए स्थानांतरण के दौरान क्षतिग्रस्त हो सकता है। प्लास्टिक बैरल (आंकड़े 3 ए -3 सी) से HEA लेपित फिल्टर के छांटना के बाद, फिल्टर आधा कर दिया और सेक्शनिंग और मानक embedding कैसेट (चित्रा 3 डी) का उपयोग धुंधला करने के लिए कार्रवाई की जा सकती। छमाही में फिल्टर बंटवारे एच ई और अगर पर पार सेक्शनिंग के लिए उपलब्ध सतह को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है।
immunofluorescent धुंधलाके रूप में अच्छी तरह से उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) के रूप में कोशिकाओं फिल्टर परत पर सुसंस्कृत की छवियों DSU (डिस्क स्कैन यूनिट) कताई डिस्क confocal क्षमताओं के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकत्र किए गए थे। ऊतक विज्ञान और एच एंड ई धुंधला के लिए प्रतिनिधि परिणाम फिल्टर डालने और कोशिकाओं (20X) (चित्रा 4) के एक क्रॉस सेक्शन में दिखाया जाता है। उचित देखभाल के साथ, हम है कि फिल्टर सम्मिलित करता है पर एक सीआरसी परत sectioned जा सकता है और दाग, ऊतक ऊतक विज्ञान के लिए मानक अभ्यास है के रूप में प्रदर्शित करता है। सेक्शनिंग के दौरान, यह सीआरसी के रूप में प्रदर्शन किया (चित्रा 4) कोशिकाओं की एक परत के रूप में बरकरार फिल्टर से अलग बनने के लिए संभव है। बीएफ की छवि झरझरा झिल्ली (चित्रा 5 ए) के शीर्ष पर बहुस्तरीय सेल तबके से पता चलता है। नाभिक के लिए अलग-अलग फ्लोरोसेंट छवियों (DAPI, चित्रा 5 ब), P63 (चित्रा 5C) और एआर (चित्रा 5 डी) दिखाए जाते हैं, के रूप में सभी तीन प्रतिदीप्ति मार्कर (चित्रा 5E) के मर्ज है। अंत में, एक compositई बीएफ और यदि ओवरले दिखाया गया है (चित्रा 5F), कोशिकाओं और फिल्टर करने के लिए प्रतिदीप्ति संकेत रिश्तेदार के स्थानीयकरण की स्थापना। P63 के साथ DAPI दाग की ओवरले धुंधला स्पष्ट रूप से एक proliferative राज्य में अभी भी कुछ कोशिकाओं को दर्शाता है। एआर के स्थानीयकरण यदि नाभिक में धुंधला प्रोस्टेट कोशिकाओं में एआर के कार्यात्मक पुनर्सक्रियन का संकेत है।
हमारे फिल्टर डालने प्रणाली की है और एक sectioned प्रोस्टेट ऊतक के बीच एक तुलना प्रोस्टेट उपकला की है कि हमारे सीआरसी डालने परत के विकास में समानता प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है (आंकड़े 6A, 6B)। प्रोस्टेट वाहिनी P63 की अभिव्यक्ति, प्रोस्टेट बेसल कोशिकाओं के साथ लगातार चलता। P63 धुंधला भी डालने पर सीआरसी में देखा जाता है। एक उच्च प्रतिशत P63 कोशिकाओं को व्यक्त बरकरार ऊतक खंड की तुलना में हमारे डालने में मनाया गया। इसके अलावा, दोनों परमाणु और cytoplasmic एआर प्रोस्टेट आज़ादी में देखा जाता है खंड के खिलाफ मुकदमा और जब तक फिल्टर डालने के शो कम समग्र एआर अभिव्यक्ति, दोनों परमाणु एआर अभिव्यक्ति और cytoplasmic धुंधला पर सीआरसी, देखा जाता है बरकरार प्रोस्टेट के समान है।
चित्रा 1: 6 अच्छी तरह से संस्कृति डिश और सम्मिलित है कि 3 डी संस्कृति प्रणाली शामिल की प्रतिनिधि छवियाँ। (ए) फिल्टर (तीर) के नीचे करने के लिए जिलेटिन कोटिंग लागू करने के लिए उलटा सम्मिलित करता है। डालने और फिल्टर की एक बड़ी छवि शो (इनसेट) है। (बी) ठीक से रखा सम्मिलित करता है। प्रणाली के भीतरी और बाहरी कक्षों (तीर) दिखाए जाते हैं। बी में बॉक्सिंग पंक्ति से पता चलता है कि कैसे कई नमूने एक दिया प्रयोगात्मक हालत के लिए प्राप्त कर रहे हैं। 2 सप्ताह विकास की अवधि के समापन पर इन सम्मिलित विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री उपज के लिए जमा किया जा सकता है।"लक्ष्य =" _blank "> यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
चित्रा 2: एक पारदर्शी फ़िल्टर झिल्ली पर स्वस्थ सीआरसी वरीयता प्राप्त की एक परत के एक प्रतिनिधि छवि दिखाया गया है। दोनों आंतरिक और बाहरी कक्षों वातानुकूलित मीडिया निहित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एक फिल्टर का एक प्रतिनिधि छवि को दो भागों में आधी रह गई है और embedding के लिए एक आयल कैसेट में रखा। (ए) फ़िल्टर स्कोरिंग के बाद और हटाने से पहले HEA कोटिंग के साथ सम्मिलित है। (बी) पॉली कार्बोनेट बैरल से रिहा फिल्टर डालने। (
चित्रा 4: एक प्रतिनिधि एच एंड ई दाग क्रॉस फ़िल्टर डालने और प्रकोष्ठों की धारा (20X)। दोनों झिल्ली (नीचे) और सेल परत (ऊपर) दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) और immunofluorescence (यदि) की एक श्रृंखला की छवियाँप्रकोष्ठों फ़िल्टर (40X) पर sectioned। फिल्टर और कोशिकाओं के पार वर्गों दिखाए जाते हैं। फिल्टर सतह (5 ए) पर कोशिकाओं का एक बेदाग छवि के बीएफ DAPI दाग नाभिक (5 ब) और दो अलग अलग प्रोटीन, P63 (5C) और एण्ड्रोजन रिसेप्टर (ए आर, 5 डी) के लिए immunofluorescent धुंधला के लिए छवियों के साथ है। सेल वर्गों (5E, एफ) की एक समग्र ओवरले कोशिकाओं और फिल्टर के संदर्भ में अगर संकेतों के स्थानीयकरण परिभाषित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: फिल्टर एक (20X) ऊतक से प्रोस्टेट उपकला की धारा बनाम पर sectioned कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) छवि।हमारे फिल्टर डालने के एक क्रॉस अनुभागीय छवि में दिखाया गया है (चित्रा 6A) एक अक्षुण्ण प्रोस्टेट (चित्रा 6B) के नलीपरक उपकला परतों की तुलना में। P63 का धुंधला, एआर और नाभिक चित्रा 5 में के रूप में प्रदर्शन किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्राथमिक सेल लाइनों कैंसर अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण और तेजी से विकसित मंच हैं। संस्कृति डालने आधारित 3 डी संस्कृति प्रणाली एक दो सप्ताह की समय सीमा के भीतर प्राथमिक प्रोस्टेट सीआरसी के भेदभाव का समर्थन करता है। सीआरसी फिल्टर विधि प्रोस्टेट अनुसंधान के लिए एक नए, मध्यम throughput विधि का प्रतिनिधित्व करता है। मौजूदा माउस PDX मॉडल समय लगता है और बेहद महंगी हैं, और PDX नमूनों की कई संस्कृति में विकसित नहीं किया जा सकता, अन्वेषक द्वारा आरंभ किए गए प्रयोग और उनकी उपयोगिता सीमित। इसके अलावा, जबकि PDX की स्थापना की सफलता दर बहुत 13 अलग अलग है, सीआरसी विधि सेल लाइनों 3 स्थापित करने में सफलता की एक उच्च दर है। हम समझते हैं हमारी प्रणाली आर-spondin आधारित प्रोस्टेट organoid दृष्टिकोण के पूरक हो सकता है, हालांकि, प्राथमिक प्रोस्टेट कैंसर से organoids की स्थापना के संबंध के साथ सफलता की कमी 14 सूचित किया गया है। इसके अतिरिक्त, मीडिया, स्थापना के तरीकों,और सीआरसी के रखरखाव के आर-spondin आधारित प्रोस्टेट organoid दृष्टिकोण की तुलना में काफी सरल कर रहे हैं। एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, सीआरसी की स्थापना की और प्रत्यक्ष आणविक तुलना के लिए मिलान सामान्य और ट्यूमर संस्कृतियों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
कुछ तकनीकी मुद्दों जब इस प्रणाली की स्थापना को संबोधित किया जा रह है। सबसे पहले, जिलेटिन कोटिंग फिल्टर डालने में मदद करता है के नीचे करने के लिए आवेदन किया है, लेकिन खत्म नहीं करता, झिल्ली भर में मीडिया का प्रसार। अक्सर मीडिया परिवर्तन भेदभाव (ऊपरी या शिखर सेल परत) विकास बनाम के संबंधित ढाल (कोशिकाओं के निचले या बेसल परत) कक्ष के भीतर की स्थिति बनाए रखने के लिए किया जाता है। दूसरा, सफल 3 डी सीआरसी संस्कृतियों एक अपेक्षाकृत उच्च सेल बोने घनत्व की आवश्यकता है। लोअर बोने घनत्व सेल परत है कि फिल्टर सतह पर विकसित की अखंडता के लिए संबंध के साथ गरीब परिणाम सामने आए। यह एक आम विचार है, जब सीआरसी संवर्धन है, वे सबसे अधिक सख्ती जब एक बनाए रखा बढ़ने के रूप मेंटी उच्च सेल घनत्व। अंत में, उचित हटाने और बरकरार सेल परत के बाद आयल एम्बेडिंग सेल भेदभाव की हद को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण था। hydroxyethyl agarose (HEA) के अलावा दोनों सेल नुकसान में कमी आई और गैर एम्बेडेड फिल्टर की तुलना में कोशिकाओं के समग्र आकृति विज्ञान में सुधार (नहीं दिखाया गया है)। एक बार ठीक से एम्बेडेड, फिल्टर sectioned और एक तरह से ठेठ सेल और ऊतकों के नमूनों से पृथक में प्रोसेस किया गया।
हम सिर्फ इस फिल्टर विधि का उपयोग प्रोस्टेट उपकला की वास्तुकला का अनुकरण करने की शुरुआत कर रहे हैं। संस्कृति की स्थिति के लिए अतिरिक्त संशोधनों, मीडिया और सब्सट्रेट करने के लिए warranted रहे हैं, जो आसानी से संबोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पुनर्निर्मित भेदभाव medias कि बेहतर ल्यूमिनल बनाम बेसल भेदभाव को बढ़ावा कर सकते तेजी से परीक्षण किया जा सकता है। चूंकि सीआरसी के lentiviral संक्रमण वाणिज्यिक कैंसर की कोशिकाओं को 7 और 2 डी सीआरसी के साथ के रूप में के रूप में आसानी से प्रदर्शन किया गया है अल हैइसलिए CAS9 / CRISPR जीन संपादन प्रौद्योगिकी वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट दिया स्थायी रूप से सेल जीनोम (डेटा) नहीं दिखाया, उत्परिवर्तित जीन नष्ट कर दिया या मरम्मत के प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है संशोधित करने के लिए। इसी तरह, वंश ट्रैकिंग वंश विशेष रिपोर्टर जीन को शुरू करने से संभव बनाया जा सकता है।
मीडिया या कोशिकाओं में फेरबदल के अलावा, फिल्टर सतह के लिए संशोधन भी परीक्षण किया जा सकता है। अलग फिल्टर झिल्ली substrates व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इसके अलावा, हमने पाया है कि वाणिज्यिक बाह्य मैट्रिक्स एक उपयुक्त विकास पर्यावरण जब फिल्टर के अंदर करने के लिए लागू प्रदान करता है। डालने प्रणाली के लक्ष्यों में से एक बेहतर प्रोस्टेट microenvironment मॉडल करने के लिए है, शायद सबसे दिलचस्प संशोधनों सामान्य या ट्यूमर व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं की शुरूआत, या तो डालने के दायरे के भीतर या सीआरसी के साथ सह-संस्कृति में हो सकता है नीचे कक्ष में हालत के विकास मीडिया। वर्गों के साथ अच्छी तरह से सम्मिलित संशोधित ओएफ decellularized प्रोस्टेट ऊतक भी संभव है। इस दृष्टिकोण में, stromal / उपकला बातचीत प्राथमिक कोशिकाओं के विकास के लिए एक पाड़ के रूप में decellularized ऊतक का उपयोग करने की अनुमति दे सकता है।
प्राथमिक कोशिकाओं स्थापित करने के लिए और बाद में उनके भेदभाव के लिए शर्तों प्रदान करने की क्षमता सामान्य ग्रंथियों के विकास में और कैंसर अनुसंधान के लिए और अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक अनुसंधान के लिए एक आदर्श स्वरूप है। प्रणाली के साथ साथ वर्णित एक मंच है जिसके द्वारा प्रकार की कोशिकाओं और संशोधनों के एक असीमित संख्या अलग-अलग जरूरतों के लिए प्रयोगात्मक प्रणाली दर्जी को और मज़बूती से विश्लेषण के लिए नमूने एकत्र करने के लिए जोड़ा जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध T32 (सीए 9686-18) और TL1 (TL1TR001431) postdoctoral प्रशिक्षण अनुदान पुरस्कार (एलटी), डीओडी PC140268 (सीए), W81XWH-13-1-0327 (सीए) TR000102-04 (सीए) के साथ ही द्वारा समर्थित किया गया U01 बराबर-12-095 (कुमार) और P30 CA051008-21 (वेनर)। नमूना निर्धारण, सेक्शनिंग और धुंधला लोम्बार्डी व्यापक कैंसर केंद्र प्रोटोकॉल और ऊतक साझा संसाधन में प्रदर्शन किया गया था। हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए रिचर्ड श्लेगल धन्यवाद। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
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