Abstract
células condicionalmente reprogramadas (CRCs) fornecer um método sustentável para a cultura de células primária e a capacidade de desenvolver extensas "biobancos viva" do paciente derivadas linhas celulares. Para muitos tipos de células epiteliais, várias abordagens de cultura tridimensionais (3D) foram descritos que suporta um estado diferenciado melhorada. Enquanto CRCs mantêm a sua linhagem compromisso para o tecido a partir do qual eles são isolados, eles não conseguem expressar muitos dos marcadores de diferenciação associados com o tecido de origem, quando cultivada sob duas condições de cultura dimensional (2D) normais. Para melhorar a aplicação dos CRCs derivadas de pacientes para pesquisa do câncer de próstata, um formato de cultura 3D foi definido que permite uma diferenciação celular rápida (2 semanas total) luminal em ambas as células epiteliais da próstata normais e derivadas de tumores. Nisto, um formato baseado no elemento filtrante é descrito para a cultura e a diferenciação dos dois CRCs normais e malignas da próstata. Um deA inscrição cauda dos procedimentos necessários para a coleta de células e processamento de coloração imuno-histoquímica e imunofluorescência são fornecidos. Colectivamente o formato de cultura 3D descrito, combinados com as linhas CRC primárias, proporciona um médio importante destacar sistema modelo baseado em serviços para a pesquisa de próstata baseada biospecimen.
Introduction
A identificação e uso de terapias contra o câncer, que são personalizadas para os indivíduos são um objetivo principal na pesquisa do câncer. Recentemente, novas abordagens têm sido desenvolvidos para permitir uma maior facilidade no estabelecimento de culturas de células primárias, potencialmente proporcionando tanto meios de identificar e testar terapias personalizadas. Por exemplo, o da próstata com base em R-espondina abordagem organ�de 1 permite tridimensional de cultura (3D) de células normais e metastáticas de cancro da próstata em uma matriz extracelular comercial (por exemplo, Matrigel), enquanto que o método da condicionalmente reprogramação das células (CRC) desenvolvido em Georgetown 2, 3 utiliza mais condições de cultura 2D padrão. Especificamente, a combinação de um inibidor da Rho cinase (Y-27632) e células alimentadoras de fibroblastos murinos J2 irradiadas conduzir à cultura indefinido de CRCs queratinócitos 2. A metodologia é CRCextremamente robusta, com linhas de células primárias estabelecidas e mantidas indefinidamente a partir da próstata e muitos outros tecidos epiteliais normais e malignas 3 com sucesso. Importante, a nossa tecnologia de CRC permitido para a rápida identificação da base etiológica de papilomatose respiratória recorrente num doente que não tinha um número de tratamentos com drogas anteriores. Além disso, utilizando os CRCs normais e derivadas de tumores, a identificação bem sucedida de um fármaco aprovado pela FDA, vorinostat, foi feita no prazo de duas semanas de biópsia de tecido inicial. O paciente foi colocado na vorinostat, resultando no sucesso do tratamento da doença 4.
A próstata normal é composta de luminal, basal e as raras células neuroendócrinas 5. As células luminais formar a camada epitelial colunar da glândula e expressar o receptor de androgénio (AR), bem como outros marcadores tais como citoqueratinas luminais 8 e 18 e próantígeno específico de estado (PSA) 6. Por outro lado, as células basais está localizada por baixo da camada luminal e expressa citoqueratinas 5 e p63, mas níveis baixos de AR 5. Nós 7, 8, 9 e outros 10 têm usado com sucesso CRCs próstata em investigações sensibilidade a drogas mecanicistas pré-clínicos. No entanto, quando cultivada sob condições padrão de cultura de tecidos 2D, estas células não totalmente engatam AR sinalização 10. Importantemente, quando colocada sob a cápsula renal de ratos imunodeficientes, o CRCs recuperou próstata arquitectura glandular normal e função, indicando que CRCs próstata conservam a sua linhagem compromisso quando colocado num ambiente permissivo. O desenvolvimento do sistema de cultura de células à base de inserção do filtro aqui descrito permite a rápida (2 semanas) a diferenciação in vitro de CRCs próstata como evidenciado by o aumento da expressão dos genes alvo de Ar e Ar, bem como uma diminuição dos níveis de p63.
Os elementos filtrantes utilizados contêm membranas de policarbonato (tamanho de poro, 0,4 uM) que podem suportar a cultura de células de mamíferos. O sistema, tal como desenvolvido, faz uso de CRCs próstata normais e malignas, 6 bem pratos de cultura e as inserções de filtro. Meios de cultura celular condicionado por células J2 11 é colocado na mídia de câmara e de próstata diferenciação de fundo na câmara superior. As técnicas descritas aqui apoiar diferenciação celular luminal de próstata dentro de um prazo duas semanas, de acordo com os objetivos da medicina personalizada. Foi também imperativo desenvolver as metodologias que permitem a caracterização molecular, genética e celular abrangente das culturas. Abordagens para isolamento de ADN, ARN e proteína de células libertadas a partir da superfície do filtro foram desenvolvidos e simplificado para o processamento de amostras de repetição exacta. Finally, a metodologia necessária para remover o filtro para permitir a incorporação, de corte e para a H & E, imuno-histoquímica e coloração de imunofluorescência, é totalmente descrito.
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Protocol
1. Criação do celular 3D Cultura Inserir Sistema
- Coloque inserções de cultura de células 2 de policarbonato com uma orientação invertida (lado do filtro para cima) para baixo em uma placa de 6 poços (Figura 1A).
- Aplicar uma camada fina de 0,1% de gelatina em água, para o lado inferior da peça inserta e deixar secar (10-20 min) numa câmara de segurança biológica para manter a esterilidade.
- Repetir o passo 1.2 mais duas vezes para um total de 3 aplicações de 0,1% de gelatina sobre os insertos.
NOTA: O revestimento de gelatina vai ajudar a difusão limite entre as câmaras. - Para recolher os CRCs primários de condições de cultura padrão, adicionar 5 mL de PBS para lavar o frasco de cultura.
- Tripsinizar as células utilizando (1 mL para um T-25 e 2 ml de uma T-75) 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. Bater levemente a parede lateral do balão para ajudar a desalojar as células. Em seguida, proceder para parar a reacção de tripsina e recolher as células por adição de 5 mL de DMEM completo.
- coletar as células num tubo de 15 mL. Centrifuga-se o tubo a 4 ° C e 188 xg e contagem usando um contador de células automatizado ou um hemocitómetro.
- Re-suspender 600.000 CRCs em 250 mL de mídia (CM) condicionado e adicionar ao orientada corretamente (lado do filtro para baixo) inserção de cultura (Figura 1B). Isto é referido como a câmara interna.
Nota: CM é F-meios condicionados por células J2 irradiados e contém 10 um Y-27632, como descrito anteriormente 7, 8, 9, 11.
- Aplicar 2 mL de CM para a câmara exterior da placa de 6 poços e incuba-se a 37 ° C durante a noite (durante pelo menos 18 h).
- Cuidadosamente remover a CM na câmara interior com uma pipeta de 1 mL ou 200 mL e adiciona-se lentamente meios de diferenciação (DM) para a câmara interior com uma pipeta de 1 mL até completa. Tenha cuidado para não perturbar a camada de células.
- Verifique as culturas a cada dia. As células saudáveis aparecer como mostrado na Figura 2.
- Mudar o CM na câmara exterior todos os dias ou cada dois dias, dependendo do metabolismo das células.
- Quando a mídia da cor mudanças câmara interna (amarelo), retire cuidadosamente a mídia na câmara de filtro interno com um 1 mL ou 200 mL pipeta.
- Aspirar a mídia na câmara de placa de 6 exterior com uma ponta de aspiração.
- Usando uma pipeta de 1 mL, aplicam-se lentamente DM fresco para a câmara interna até integral. Tenha cuidado para não raspar ou não desalojar a camada de células.
- Substitua o material na câmara exterior com 2 mL de CM fresco.
- Manter as culturas durante 2 semanas, e então proceder ao processamento para o isolamento bimolecular desejado.
NOTA: Cada linha na placa de 6 poços, num total de seis inserções (Figura 1B), deve ser processado por experiência para adquirir células suficientes para DNUm, ARN ou proteína para análise. - Aspirar meios na câmara exterior e lavar com 2 ml de tampão fosfato salino (PBS).
- Retire cuidadosamente a mídia da câmara interna com um 1 mL ou 200 mL pipeta e adicionar 500 mL PBS. Evitar ou de outro modo raspando perturbar as células sobre a membrana.
- Aspirar PBS a partir da câmara exterior e cuidadosamente remover PBS a partir da câmara interior com um 1 ml ou 200 ul pipeta. Uma vez que o PBS foi removido, prossiga diretamente para o aplicativo apropriado detalhado abaixo. Não permitir que a membrana a secar. A cultura pode ser mantido brevemente na PBS até que o aplicativo está pronto para começar.
3. Processamento dos Filtros para Pellet Banking
- Adicionar 100 mL de 0,25% de tripsina-EDTA a cada câmara interior e incubar durante 5 min a 37 ° C.
- Resumidamente e agitar cuidadosamente / raspar as células sobre a superfície da membrana com uma pipeta 200 uL enquanto pipetando para cima e para baixo (evitar punctruturação a membrana). Incubar durante 1 min a 37 ° C.
- Adicionar 250 ul de CM para a primeira câmara interior e pipetar para cima e para baixo para lavar suavemente o filtro.
- Transferência de células ressuspensas para a câmara de filtro adjacente que contém as mesmas condições de meios e repetir pipetando para cima e para baixo.
- Repetir este procedimento para cada uma das inserções de um único estado. Recolha e transferir as células para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
- Lavar cada câmara interna com um adicional de 100-200 mL de CM para coletar as células restantes. Adicionar ao tubo de centrífuga de 1,5 mL no passo 3.5.
- Rodar as células a 423 xg numa microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e lava-se a pelete celular uma vez com 1000 mL de PBS.
- Girar novamente a 423 xg numa microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min.
- Aspirar PBS e congelamento a -80 ° C para uso posterior.
4. Processamento dos Filtros de RNA ou DNA Isolation
- À medida que o filtro pode dissociar-se do inserto, lava-se a membrana de filtro dissociado por pipetagem da solução de extracção para cima e para baixo. Recolher o máximo de o reagente de extracção quanto possível, através da inclinação da placa de 6 poços e aspirando qualquer líquido residual.
5. Processamento de Filtros para isolamento de proteínas
- Coloque a inserção do filtro na placa de 6 poços em gelo. Para a câmara interior, adicionam-se 10 mL de tampão de lise proteína suplementado com 1 mM de fluoreto de sódio (NaF), 1 mM de vanadato de sódio (NAV), 100 mM de dithiothreitol (DTT) e 100 mL de cocktail anti-protease.
- Agitar / raspar as células sobre a superfície da membrana com uma pipeta de 20 mL, enquanto pipetando para cima e para baixo. Evitar a geração de bolhas no tampão de lise.
- Incubar a placa de 6 poços com inserções de filtro em gelo durante 10 min.
- Repetir raspagem e depois enxaguar a superfície da membrana com o tampão de lise.
- Recolher os lisados das inserções 6 e transferir para um tubo de centrífuga de 1,5 ml em gelo.
- Enxaguar o primeiro membrana com um adicional de 10 mL de tampão de lise e transferência para o próximo filtro.
- Repita o passo 5.6 para todas as inserções, recolhendo qualquer solução tampão de lise residual e adicionar a 1,5 tubo mL (passo 5.5).
- Incubar a amostra em gelo durante um adicional de 5 min.
- Rotação em velocidade máxima (16873 xg numa centrífuga de topo de mesa) durante 15 min a 4 ° C.
- Pipeta lisado sobrenadante para um tubo de 1.5 ml fresco.
- Proceder à análise da concentração de proteína ou store lisados a -80 ° C.
6. Tratamento para a H & E e Imuno-coloração
- Adicionar 500 uL e 1 mL de NBF a 10% (formalina tamponada neutra) para a câmara interior e exterior e deixar incubar durante a noite a 4 ° C.
- Aspirar o NBF da câmara exterior e adicionar 1 mL de agarose hidroxietil (HEA) processando gel para um mL de centrífuga de 1,5. Lentamente derreter a agarose no microondas usando baixa potência e repetido 10-20 s pulsos até que a agarose é derretido.
- Mantenha o HEA em um banho quente 37 ° C para evitar a solidificação até estar pronto para usar.
- Remover o NBF a partir da câmara interior e aplicar 25 ul de HEA fundido para o interior da câmara e permitir que a agarose solidificar durante 2-5 min.
- Wet 2 espuma almofadas de histologia em 10% NBF e coloque uma almofada em uma cassete de incorporação (veja a Figura 3D).
- Use a # 11 bisturi com lâmina (que tem, uma lâmina fina pontas muito afiadas) para marcar o filtro do lado inferior do insertocâmara, liberando-o parcialmente da câmara de inserção de plástico.
- Colocar uma pequena quantidade (100-200 uL) de NBF numa placa de Petri e imergir o filtro parcialmente desalojado no NBF (Figura 3A).
- Com uma lâmina de bisturi # 10, exercendo uma ligeira pressão contra o meio do filtro, a partir do interior da câmara de inserção, para desalojar completamente o filtro a partir do barril de inserção (Figura 3B). Se não houver qualquer parte do filtro que está ainda ligado ao cano, cortá-la com o bisturi.
- Cortar o filtro de HEA-revestidas em meio com a lâmina de bisturi # 10 (Figura 3C).
- Colocar cada metade do filtro sobre a almofada de espuma na cassete histologia preparado no passo 6.4 (Figura 3D).
- Adicionar a segunda esponja embebida NBF a 10% para a cassete, ensanduichando o filtro.
- Snap selar a cassete, coloque em NBF, e incubar durante a noite.
- filtros de processo em blocos de parafina para seccionamento e coloração comoanteriormente descrito 12.
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Representative Results
O sistema de inserção de cultura de células com base é um procedimento relativamente simples e rápido para a produção de culturas em 3D de CRCs próstata que apoia a diferenciação celular luminal. Um diagrama esquemático do sistema é mostrado (Figura 1A) destacando a aplicação do revestimento de gelatina, para a superfície do fundo do elemento filtrante. As inserções são apenas virado para a aplicação da gelatina. Na Figura 1B, os filtros são na orientação adequada para cultura. Usando uma pastilha de célula transparente, uma imagem representativa de uma cultura saudável CRC próstata 3D é mostrado (10X) (Figura 2). As camadas densa de CRCs saudáveis demonstrou é típico após o estabelecimento e pode ser visualizada utilizando microscopia de luz padrão. Durante o estabelecimento inicial, é crítico para visualizar a camada de células formadas a assegurar que o método é compatível com uma dada linha de células e que a ligação adequada e LaYering de células ter ocorrido.
HEA é aplicada ao interior do inserto como descrito acima. Após a aplicação do HEA, cuidados devem ser tomados quando marcou o filtro para removê-lo do (3A Figuras, 3B) de inserção. Em todas as etapas (Figuras 3A-3D), o cuidado também deve ser exercido para minimizar a movimentação desnecessária da camada de HEA no filtro com células. A camada de CRC pode ser facilmente rompido ou danificado durante a transferência para a H & E cassete (Figura 3D). Após a excisão do filtro de HEA-revestido do barril de plástico (Figuras 3A-3C), o filtro pode ser reduzida para metade e processados para seccionamento e coloração utilizando cassetes de embebimento padrão (Figura 3D). Dividindo o filtro ao meio é importante para maximizar a superfície disponível para seccionamento transversal em H & E e IF.
coloração de imunofluorescênciabem como de campo claro (BF) imagens das células cultivadas na camada de filtro foram coletados por meio de um microscópio com disco rotativo DSU (Disk Unidade Scan) capacidades confocal. Os resultados representativos para histologia e coloração com H @ E são mostrados numa secção transversal da pastilha de filtro e as células (20X) (Figura 4). Com os devidos cuidados, demonstramos que uma camada de CRC nas inserções de filtro pode ser seccionado e corado, como é prática padrão para a histologia do tecido. Durante o corte, é possível para o CRCs a desprender-se do filtro como uma camada intacta de células como demonstrado (Figura 4). A imagem mostra BF estratos de células multi-camadas na parte superior da membrana porosa (Figura 5A). As imagens fluorescentes individuais para núcleos (DAPI, Figura 5B), p63 (Figura 5C) e AR (Figura 5D) são mostrados, como é a fusão de todos os três marcadores de fluorescência (Figura 5E). Finalmente, um composite BF e se a sobreposição é mostrado (Figura 5F), que estabelece a localização do sinal de fluorescência em relação às células e o filtro. A sobreposição da mancha DAPI com a p63 se a coloração demonstra claramente algumas células ainda em estado proliferativa. A localização de AR se a coloração no núcleo é indicativo de reactivação funcional de AR nas células da próstata.
Uma comparação entre o IF de nosso sistema de inserção de um filtro e o tecido da próstata é mostrado em corte (Figuras 6A, 6B) para demonstrar a similaridade do desenvolvimento da nossa camada de CRC inserção para que o epitélio da próstata. A conduta de próstata mostra a expressão de p63, de acordo com as células basais da próstata. coloração p63 também é visto nas CRCs sobre a inserção. Uma percentagem mais elevada de p63 expressando células foi observada no nosso inserção em comparação com a secção de tecido intacto. Além disso, tanto nuclear e citoplasmática AR são vistos no tis próstata processar e secção enquanto as CRCs sobre o elemento filtrante mostram a expressão global menos AR, tanto a expressão de AR nuclear e coloração citoplasmática é vista, semelhante à da próstata intacta.
Figura 1: Imagens representativas da placa de cultura de 6 poços e Insert que compõem o Sistema de Cultura de 3D. (A) inserções invertido para a aplicação do revestimento de gelatina para o lado de baixo do filtro (seta). Uma imagem maior da inserção e do filtro é show (no detalhe). (B) inserções devidamente colocado. As câmaras interiores e exteriores do sistema estão apresentados (setas). A linha de caixas em B mostra como amostras de múltiplos são obtidos para uma determinada condição experimental. Na conclusão do período de crescimento duas semanas essas inserções podem ser combinadas para produzir material suficiente para análise."Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: uma imagem representativa de uma camada de saudável CRCs semeadas sobre uma membrana de filtro é mostrada transparente. Ambas as câmaras internas e externas contidas meios condicionados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: uma imagem representativa de um filtro Halved em duas seções e colocado em uma cassete de parafina para a incorporação. (A) Filtro de inserção com revestimento HEA depois de marcar e antes da remoção. (B) O elemento filtrante libertado do tambor de policarbonato. (
Figura 4: A Seção manchado Cruz Representante H & E do elemento filtrante e células (20X). Tanto a membrana (fundo) e a camada de células (de cima) são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Uma Série de Representante Campo brilhante (BF) e de imunofluorescência (IF) Imagens deCélulas seccionada do filtro (40X). seções transversais do filtro e as células são mostrados. Uma imagem BF não coradas das células na superfície do filtro (5A) é acompanhada por imagens para o núcleo corado DAPI (5B) e coloração de imunofluorescência para duas proteínas diferentes, p63 (5C) e o receptor de androgénio (AR, 5D). Um composto de sobreposição das secções de células (5E, F) define a localização dos sinais IF no contexto de células e o filtro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Um representante de imunofluorescência (IF) de imagens de células seccionados sobre o filtro contra uma secção da próstata Epitélio a partir de tecido (20X).Uma imagem em corte transversal do nosso dispositivo de filtração é mostrado (Figura 6A), em comparação com as camadas epiteliais do ducto de uma próstata intacta (Figura 6B). A coloração de p63, o AR e o núcleo foi realizada como na Figura 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
linhas de células primárias são uma plataforma importante e em rápido desenvolvimento para a investigação do cancro. O sistema de cultura 3D baseado em inserção de cultura apoia a diferenciação da CRCs próstata primários dentro de um prazo de duas semanas. O método do filtro CRC representa, um método de transferência novo meio para a investigação de próstata. Modelos existentes rato PDX são demorados e extremamente caro, e muitas das amostras PDX não podem ser cultivadas em cultura, o que limita a experimentação iniciado pelo investigador e a sua utilidade. Além disso, enquanto que as taxas de sucesso de estabelecimento de PDX 13 variam muito, o método CRC tem uma elevada taxa de sucesso no estabelecimento de linhas de células 3. Consideramos nosso sistema para ser complementar à abordagem organ�de próstata baseado no R-espondina; no entanto, a falta de sucesso com relação ao estabelecimento de Organóides por câncer de próstata primário tem sido relatada 14. Além disso, os meios de comunicação, métodos de estabelecimento,e manutenção dos CRCs são significativamente mais simples do que a próstata abordagem organ�de R-base-espondina. Como um benefício adicional, as CRCs pode ser estabelecida e utilizada para testar culturas normais e tumorais correspondentes para comparações directas moleculares.
Algumas questões técnicas ainda precisam ser abordadas ao estabelecer este sistema. Em primeiro lugar, o revestimento de gelatina aplicada na parte inferior do filtro inserto ajuda, mas não elimina, a difusão dos meios de comunicação através da membrana. Mudanças frequentes do suporte são utilizados para manter o respectivo gradiente de diferenciação (célula camada superior ou apical) vs crescimento (camada inferior ou de células basais) as condições no interior da câmara. Em segundo lugar, as culturas de sucesso de CRC 3D necessária uma relativamente elevada densidade de sementeira de células. Menores densidades de sementeira produziu resultados pobres no que diz respeito à integridade da camada de células que se desenvolve na superfície do filtro. Esta é uma consideração comum quando a cultura de CRCs, à medida que crescem mais vigorosamente quando mantido umalta densidade de células T. Finalmente, a remoção adequada e subsequente inclusão em parafina da camada de células intactas foi crítico para a definição do grau de diferenciação celular. A adição de hidroxietilo de agarose (HEA) diminuiu tanto a perda de células e melhorou a morfologia geral das células em comparação com os filtros não embutido (não mostrado). Uma vez devidamente encaixado, os filtros foram cortados e processados de um modo indistinguível de amostras de células e tecidos normais.
Estamos apenas começando a imitar a arquitetura do epitélio da próstata utilizando este método de filtro. modificações adicionais para as condições de cultura, para a mídia e para o substrato são garantidos, o que pode ser facilmente tratada. Por exemplo, mídias de diferenciação reformulados que podem promover uma melhor luminal vs diferenciação basal pode ser testado rapidamente. Como a infecção lentiviral de CRCs foi executado tão facilmente quanto com células cancerosas comerciais 7 e o CRCs 2D têm alassim sido transfectadas com vectores de genes CAS9 / CRISPR tecnologia de edição para modificar permanentemente no genoma da célula (dados não mostrados), o efeito de genes mutados, deletadas ou reparados podem ser testados. Da mesma forma, o acompanhamento de linhagem pode ser tornada possível através da introdução de genes repórter específicos de linhagem.
Além de alterar os meios de comunicação ou as células, as modificações à superfície do filtro pode também ser testada. substratos de membrana de filtro diferentes estão disponíveis comercialmente. Além disso, verificou-se que a matriz extracelular comercial proporciona um ambiente de crescimento adequado, quando aplicado no interior do filtro. Como um dos objectivos do sistema de inserção é a melhor modelar o microambiente da próstata, talvez, as modificações mais interessantes pode ser a introdução de células estromais normais ou derivadas de tumores, quer em co-cultura com as CRCs dentro dos limites da inserção ou na câmara inferior para condicionar o meio de crescimento. Modificando a inserção bem com secções Otecido da próstata descelularizado F também é possível. Nesta abordagem, estromais / interacções epiteliais podia permitir que as células primárias para usar o tecido descelularizado como um andaime para o crescimento.
A capacidade de estabelecer células primárias e fornecer posteriormente as condições para a sua diferenciação é um formato ideal para pesquisas mais biologicamente relevante no desenvolvimento glandular normal e para a investigação do cancro. O sistema aqui descrito proporciona uma plataforma através da qual um número ilimitado de tipos de células e modificações podem ser combinadas para adaptar o sistema a necessidades experimentais individuais e para recolher de forma fiável as amostras para análise.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por T32 (CA 9686-18) e TL1 (TL1TR001431) concessão de verbas de formação de pós-doutorado (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), bem como U01 PAR-12-095 (Kumar) e CA051008-21 P30 (Weiner). a fixação da amostra, corte e coloração foi realizada no Lombardi Comprehensive Cancer Center Histologia e Tecidos de recursos partilhada. Agradecemos Richard Schlegel para discussões úteis. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Câncer ou o National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
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