Abstract
תאים לתכנות מחדש מותנה (CRCs) לספק שיטת קיימא עבור תרבית תאים ראשונית ואת היכולת לפתח "biobanks חיים" הנרחב של שורות תאים שמקורם בחולה. עבור סוגים רבים של תאי אפיתל, שונות תלת ממדים (3D) גישות התרבות תואר התומכים מדינת בדיל השתפרה. בעוד CRCs לשמור מחויבות השושלת שלהם לרקמה שממנו הם מבודדים, הם לא מצליחים לבטא רבים של סמנים בידול הקשורים רקמות ממוצא כאשר גדל תחת נורמלי שני התנאים תרבות מימדי (2D). כדי לשפר את היישום של CRCs נגזרות החולות למחקר סרטן הערמונית, פורמט תרבות 3D הוגדר המאפשר בידול תא מהיר (2 שבועות סה"כ) לומינל בשני נורמלי גידולים שמקורם בתאי האפיתל ערמונית. בזאת, פורמט מבוסס כנס מסנן מתואר עבור culturing וההבחנה של שני CRCs ערמונית הנורמלי וממאירים. דהתיאור זנב של ההליכים הנדרשים לצורך איסוף תאים ועיבוד מכתים immunohistochemical ו immunofluorescent מסופקים. קולקטיבי בפורמט תרבות 3D תאר, בשילוב עם קווי CRC העיקריים, מספק בינוני חשוב גבוהה מערכת מודל תפוקה למחקר ערמונית מבוססת biospecimen.
Introduction
זיהוי והשימוש של טיפולים בסרטן שמותאם אנשים הם יעד מרכזי בחקר הסרטן. לאחרונה, גישות חדשות פותחו המאפשרות ביתר קל בהקמה בתרביות תאים ראשוניות, פוטנציאל לספק דרכים של שניהם זיהוי ובדיקת טיפולים אישית. לדוגמא, הערמונית מבוססת R-spondin גישת organoid 1 מאפשרת תלת ממדי (3D) culturing של תאי סרטן הערמונית נורמלים גרורתי בתוך תאי מטריקס מסחריים (למשל, Matrigel), בעוד Reprogramming המותנה של תאים (CRC) שיטה 2 שפותח בג'ורג'טאון, 3 מנצל תנאי תרבות 2D סטנדרטיים יותר. באופן ספציפי, השילוב של מעכבי קינאז Rho (Y-27632) ותאי מזין פיברובלסטים murine J2 מוקרן להוביל culturing בלתי מוגדר של CRCs keratinocyte 2. המתודולוגיה CRC היאמאוד חזק, עם שורות תאים ראשוניות הוקמו בהצלחה ומתוחזק ללא הגבלה זמן מהערמונית ורקמות אפיתל רגילות וממאירים רבים אחרות 3. חשוב לציין, טכנולוגית CRC שלנו מוותר עבור זיהוי המהיר של הבסיס אטיולוגי עבור papillomatosis נשימתיים חוזר אצל חולה אשר נכשל מספר הטיפולים התרופתיים קודמים. בנוסף, באמצעות CRCs נורמלי הנגזרות הגידול, זיהוי מוצלח של ה- FDA אישר תרופה, vorinostat, נעשתה תוך שבועיים מיום ביופסיה רקמות הראשונית. החולה הונח על vorinostat, וכתוצאה מכך הטיפול המוצלח של המחלה שלהם 4.
בלוטת הערמונית הנורמלית מורכבת הלומינל, הבזליים ותאי נוירואנדוקריניים הנדירים 5. תאי לומינל מהווים את שכבת האפיתל העמודים של הבלוטה ולהביע לקולטן האנדרוגן (AR), כמו גם סמנים לומינל אחרים כגון cytokeratins 8 ו -18 ופרוהמדינה אנטיגן ספציפי (PSA) 6. לעומת זאת, תאי הבזליים הם נקודות מתחת לשכבת לומינל ולהביע cytokeratin 5 ו p63, אבל רמות נמוכות של AR 5. אנחנו 7, 8, 9 ואחרים 10 השתמשו בהצלחה CRCs הערמונית בחקירות רגישות לתרופה מכניסטית פרה-קליניים. עם זאת, כאשר גדל בתנאים בתרבית רקמה 2D רגיל, תאים אלה אינם לגמרי לעסוק AR איתות 10. חשוב לציין, כאשר הניח תחת הקפסולה הכליות של עכברי immunodeficient, את CRCs שהעלה אדריכלות בלוטות נורמלית ערמונית ותפקוד מציין CRCs הערמונית לשמור שושלת מחויבותם כאשר הניח סביבת מתירנית. ההתפתחות של מסנן מערכת תרבית תאים להכניס המבוססת המתואר כאן מאפשרת המהירים (2 שבועות) במבחנת בידול של CRCs ערמונית כמו ב שמעידy הביטוי המוגבר של גני מטרת AR ו AR וכן הירידה ברמות של p63.
המחדיר המסנן הנמצא מכיל ממברנות פוליקרבונט (גודל נקבובי, 0.4 מיקרומטר) שיכול לתמוך culturing של בתאי יונקים. המערכת, שפותחה על, עושה שימוש CRCs ערמונית נורמלי וממאירים, 6 מנות תרבות היטב המחדירה המסנן. תרבית תאי תקשורת מותנית תאי J2 11 מושם בתקשורת ההבחנה קאמרית ערמונית התחתונה בתא העליון. הטכניקות המתוארות במסמך זה לתמוך התמיינות תאים luminal הערמונית בתוך פרק זמן 2 בשבוע, עולה בקנה אחד עם המטרות של רפואה אישית. זה היה גם הכרחי כדי לפתח מתודולוגיות המאפשרים פרופיל מולקולרי, גנטי ותאי המקיף של התרבויות. גישות לבידוד DNA, RNA וחלבון מתאי שוחרר מפני השטח המסנן פותחו יעיל לעיבוד מדגם חוזר מדויקת. פינהlly, המתודולוגיה הנדרשת להסרת המסנן כדי לאפשר הטמעה, חתך עבור H & E, immunohistochemical מכתים immunofluorescent, מתואר באופן מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הקמת תא 3D תרבות כנס מערכת
- מניחים 2 מוסיף תרבית תאים פוליקרבונט אוריינטציה הפוכה (צד מסנן למעלה) מטה (איור 1 א) 6 גם צלחת.
- למרוח שכבה דקה של ג'לטין 0.1% במים אל הצד התחתון של הכנס ולאפשר לו להתייבש (10-20 דקות) בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על סטריליות.
- חזור על שלב 1.2 פעמים נוספות עבור סכום כולל של 3 בקשות של ג'לטין 0.1% על ההכנסות.
הערה: ציפוי ג'לטין יעזור דיפוזיה גבול בין התאים. - כדי לאסוף את CRCs העיקרי מתנאים תרבות סטנדרטי, להוסיף 5 מ"ל של PBS לשטוף את הבקבוק תרבות.
- Trypsinize את התאים באמצעות (1 מ"ל עבור T-25 ו -2 מ"ל עבור T-75) 0.25% טריפסין- EDTA במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לטפוח בעדינות את הצד של הבקבוק כדי לסייע פירוק התאים. ואז להמשיך לעצור את תגובת טריפסין ולאסוף את התאים על ידי הוספת 5 מיליליטר של DMEM המלא.
- לאסוף התאים בתוך שפופרת 15 מ"ל. צנטריפוגה הצינור ב 4 ° C ו 188 XG ולספור באמצעות דלפק תא אוטומטי או hemocytometer.
- Re- להשעות 600,000 CRCs ב 250 μL מותנה תקשורת (CM) ולהוסיף את כנס התרבות בכיוון הנכון (מסנן בצד למטה) (איור 1 ב). זה נקרא החדר הפנימי.
הערה: CM הוא F-מדיה מותנית תאי J2 מוקרנים ומכיל 10 מיקרומטר Y-27632 כמתואר 7 בעבר, 8, 9, 11.
- החל 2 מ"ל של CM אל החדר החיצוני של 6 את הצלחת היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (עבור h 18 לפחות).
- מוציאים בזהירות את CM על החדר הפנימי עם 1 מ"ל או 200 μL פיפטה ולאט לאט להוסיף מדיה בידול (DM) אל החדר הפנימי עם טפטפת 1 מ"ל עד מלא. היזהר שלא להפריע את שכבת התאים.
- בדוק את התרבויות בכל יום. תאים בריאים להופיע כפי שמוצג באיור 2.
- שנה את CM בתא החיצוני כל יום או כל יום אחר תלוי בחילוף החומרים של התאים.
- כאשר התקשורת של משנה את צבעה החדר הפנימי (צהוב), להסיר בזהירות את התקשורת על החדר מסנן פנימי עם 1 מ"ל או 200 פיפטה μL.
- לשאוב התקשורת בתא הצלחת היטב החיצוני 6 עם טיפ aspirating.
- בעזרת פיפטה 1 מ"ל, להחיל DM טריים לאט אל החדר הפנימי עד מלא. היזהר שלא לגרד או אחר לסלק את שכבת התאים.
- החלף את המדיה בתא החיצוני עם 2 מ"ל של CM טרי.
- לשמור על התרבויות במשך 2 שבועות, ולאחר מכן להמשיך עיבוד עבור בידוד bimolecular הרצוי.
הערה: כל שורה צלחת 6 היטב, בסך הכל שישה מוסיף (איור 1B), אמורה להתבצע לכל ניסוי לרכוש מספיק תאים עבור DNA, RNA או חלבון לניתוח. - התקשורת לשאוב בתא החיצוני ולשטוף עם 2 בופר פוספט מ"ל (PBS).
- מוציאים בזהירות התקשורת מהאולם הפנימי עם 1 מ"ל או 200 פיפטה μL ולהוסיף 500 μL PBS. הימנע גירוד או אחר מטריד את התאים על הממברנה.
- לשאוב PBS מן החדר החיצוני ובזהירות להסיר PBS מן החדר הפנימי עם 1 מ"ל או 200 פיפטה μL. לאחר PBS הוסר, להמשיך ישירות את היישום המתאים כמפורט להלן. אל תאפשר הממברנה להתייבש. התרבות יכולה להישמר בקצרה PBS עד היישום הוא מוכן להתחיל.
3. עיבוד מסנני גלולת בנקאות
- הוספת 100 μL 0.25% טריפסין-EDTA לכל חדר פנימי דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- בקצרה ובזהירות להתסיס / לגרד את התאים על פני השטח קרום עם טפטפת 200 μL תוך pipetting למעלה ולמטה (להימנע puncטיורינג הממברנה). דגירה של 1 דק 'על 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 250 μL של CM אל החדר הפנימי הראשון ו פיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לשטוף את המסנן.
- העברת resuspended תאים לתא מסנן הסמוך המכיל אותם תנאי התקשורת וחזור pipetting למעלה ולמטה.
- חזור על הליך זה עבור כל אחד מוסיף של מצב יחיד. אסוף ולהעביר התאים לצינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל.
- ולשטוף כל תא פנימי עם תוספת של 100-200 μL של CM לאסוף את כל תאים נותרים. הוסף הצינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל בשלב 3.5.
- ספין התאים ב 423 XG microcentrifuge בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant לשטוף את התא גלולה אחת עם 1000 μL PBS.
- ספין שוב 423 XG microcentrifuge בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לשאוב PBS ולהקפיא ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
4. עיבוד מסנני בידוד RNA או DNA
- כפי המסנן עלול לנתק מן הכנס, לשטוף את הממברנה המסנן משויך ידי pipetting פתרון החילוץ למעלה ולמטה. אסוף כמה שיותר מגיב המיצוי ככל האפשר על ידי הטיית 6 הצלחת היטב aspirating כל נוזל שיורים.
5. עיבוד מסנני בידוד חלבון
- מניח את הכנס המסנן בצלחת 6 היטב על קרח. אל החדר הפנימי, להוסיף 10 μL של חיץ תמוגה חלבון בתוספת 1 פלואוריד נתרן מ"מ (NaF), 1 vanadate נתרן מ"מ (NAV), 100 מ"מ dithiothreitol (DTT) וכן 100 μL של קוקטייל אנטי-פרוטאז.
- להתסיס / לגרד את התאים על פני השטח קרום עם טפטפת 20 μL תוך pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות במאגר תמוגה.
- דגירת צלחת 6 היטב עם מוסיף מסנן על קרח למשך 10 דקות.
- חזור נגררים ולאחר מכן לשטוף את המשטח הממברנה עם למאגר תמוגה.
- אסוף את lysates מן 6 מוסיף ולהעביר צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל על הקרח.
- יש לשטוף את הממברנה הראשון עם 10 μL נוסף של חיץ תמוגה ולהעביר את המסנן הבא.
- חזור על שלב 5.6 עבור כל המוסיף, איסוף כל פתרון חיץ תמוגה שיורית ולהוסיף צינור מיליליטר 1.5 (שלב 5.5).
- דגירה המדגם על הקרח עבור 5 דקות נוספות.
- ספין במהירות המרבית (16,873 XG בצנטריפוגה בראש הטבלה) במשך 15 דקות ב 4 ° C..
- supernatant lysate פיפטה לתוך צינור 1.5 מיליליטר טרי.
- המשך אל הניתוח ריכוזי או STO חלבוןמחדש lysates ב -80 מעלות צלזיוס.
עיבוד 6. עבור H & E ו- מכתים חיסונית
- הוספת 500 μL ו 1 מ"ל של 10% NBF (נייטרלי שנאגרו פורמלין) לתא הפנימיים והחיצוניים ולתת דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשאוב NBF מהאולם החיצוני ולהוסיף 1 agarose hydroxyethyl מ"ל (HEA) ג'ל עיבוד כדי בצנטריפוגה מ"ל 1.5. לאט להמיס את agarose במיקרוגל באמצעות צריכת חשמל נמוכה וחזר s פולסים 10-20 עד agarose הוא נמס.
- שמור את HEA באמבט 37 מעלות צלזיוס חם כדי למנוע התמצקות עד מוכן לשימוש.
- הסר את NBF מן החדר הפנימי וליישם 25 μL של חימום מותך החדר הפנימי ולאפשר agarose כדי לחזק במשך 2-5 דקות.
- 2 קצף היסטולוגיה רפידות רטובות NBF 10% ומקום כרית אחת קלטת הטבעה (ראה האיור 3D).
- השתמש להב סכין מנתחים # 11 (בעל להב חדה מאוד, בסדר-מחודד) להבקיע את המסנן מהצד התחתון של הכנסקאמרי, חלקית משחרר אותו מאולם סוגר הפלסטיק.
- מניחים כמות קטנה (100-200 μL) של NBF בצלחת פטרי לטבול את מסנן וחילצה חלקית (איור 3 א) NBF.
- עם אזמל להב # 10, ללחוץ בעדינות כנגד באמצע המסנן, מבפנים של החדר להוסיף, כדי לסלק את המסנן מלא מהחבית להוסיף (איור 3). אם יש חלק כלשהו של המסנן שעדיין מחוברת חבית, לנתק אותו עם אזמל.
- חותכים את המסנן HEA מצופה לשניים עם להב סכין המנתחים # 10 (איור 3 ג).
- מניחים כל חצי של המסנן על כרית קצף קלטת היסטולוגיה מוכן בשלב 6.4 (איור 3D).
- מוסיף את הספוג השני 10% NBF הספוג לקסטה, רבדה המסננת.
- צמד לאטום את הקלטת, מקום NBF, דגירת הלילה.
- מסנן תהליך לגושים פרפין עבור חתך והכתים כמושתואר לעיל 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
את כנס תרבית תאי המערכת המבוססת היא הליך יחסי פשוט ומהיר להפקת תרבויות 3D של CRCs הערמונית שתומך התמיינות תאי luminal. סכמטי של המערכת מוצג (איור 1 א) המדגיש את היישום של ציפוי ג'לטין על פני השטח התחתונים של להכניס המסנן. המחדיר הפוך רק עבור היישום של ג'לטין. באיור 1B המסננים בכיוון המתאים עבור culturing. באמצעות תותב תא שקוף, תמונה מייצגת של תרבות CRC ערמונית 3D בריאה מוצגת (10X) (איור 2). תוספת השכבה הצפופה של CRCs הבריא הפגינה מתרחשת בדרך כלל אחרי הקמה ניתן מדמיינת באמצעות מיקרוסקופ אור רגילה. במהלך הקמה ראשונית, חשוב לדמיין את שכבת התאים נוצרו על מנת להבטיח כי השיטה היא תואמת קו תא נתון וכי התקשרות המתאימה להyering של תאים שחל.
HEA מוחל על החלק הפנימי של הכנס כפי שתואר לעיל. לאחר יישום HEA, יש להקפיד כאשר הבקיע את המסנן כדי להסיר אותו מן הכנס (איורים 3A, 3B). בכל השלבים (ציורי A3-3D), טיפול חייב גם להיות מופעל כדי למזער תנועה מיותרת של שכבת HEA על המסנן עם תאים. השכבה CRC יכול להיות מופרת בקלות ניזוקו במהלך העברת לקסטה H & E (איור 3D). לאחר הכריתה של המסנן המצופה HEA מחבית הפלסטיק (ציורי A3-C3), המסנן יכול להיות חצויי מעובד עבור חתך והכתים באמצעות קלטות הטבעה סטנדרטיות (איור 3D). פיצול המסנן בחצי חשוב על מנת למקסם את השטח הפנוי עבור חתך צלב על H & E ואם.
מכתים Immunofluorescentכמו גם שדה בהיר (BF) תמונות של התאים בתרבית על שכבת הסינון נאספו באמצעות מיקרוסקופ עם DSU (יחידת סריקת דיסק) יכול confocal דיסק מסתובב. תוצאות עבור נציג היסטולוגיה ו- H & E מכתים מוצגות חתך של כנס המסנן ותאים (20X) (איור 4). עם טיפול נאות, אנו מראים כי שכבת CRC על מחדיר המסנן יכולה להיות מחולקת ומוכתמת, כמקובל עבור היסטולוגיה רקמה. במהלך חתך, זה אפשרי עבור CRCs להיות מנותקת מן לסנן כנדבך שלם של תאים כפי שמודגם (איור 4). תמונת BF מראה שכבות תאים רבות-שכבתיות על גבי הקרום הנקבובי (איור 5 א). תמונות ניאון הפרט עבור גרעינים (DAPI, איור 5), p63 (איור 5 ג) ואת AR (איור 5D) נראים לעין, כמו גם המיזוג של כל שלושת סמני הקרינה (איור 5E). לבסוף, קומפוזיטדואר BF ואם כיסוי מוצג (איור 5F), הקמת לוקליזציה של יחסי אותות הקרינה לתאי ואת מסנן. שכבת-העל של כתם DAPI עם p63 אם מכתים מדגים בבירור כמה תאים עדיין במצב שגשוג. הלוקליזציה של AR אם מכתים בגרעין מעידה על הפעלה מחדש תפקודית של AR בתאי ערמונית.
השוואה בין אם של מערכת הכנס המסנן שלנו רקמת ערמונית מחולקת מוצגת (איורי 6 א, 6 ב) כדי להדגים את הדמיון בפיתוח של השכבה להוסיף CRC שלנו לזה של האפיתל הערמונית. צינור הערמונית מראה ביטוי של p63, עולה בקנה אחד עם תאי הבזליים ערמונית. מכתים p63 נתפס גם CRCs על ההוספה. P63 אחוז גבוה יותר לבטא בתאים נצפה בעלון שלנו לעומת קטע הרקמה ללא פגע. בנוסף, הן גרעיניות AR ציטופלסמית נראה tis הערמונית סעיף לתבוע ובעוד CRCs בתכנית הכנס המסנן פחות הכוללת AR ביטוי, הוא ביטוי AR גרעיני מכתים cytoplasmic נתפס, בדומה הערמונית בשלמותה.
איור 1: נציג תמונות של בצלחת תרבות 6 היטב כנס המרכיבה את מערכת תרבות 3D. (א) מוסיף Inverted להחלת ציפוי ג'לטין לחלק התחתון של המסנן (חץ). תמונה גדולה של הכנס ולסנן הוא להראות (הבלעה). (ב) מוסיף ממוקם כראוי. לתאים הפנימיים וחיצוניים של המערכת מוצגים (חיצים). השורה התאגרפה B מראה כיצד מספר דוגמאות מתקבלות על תנאי ניסוי נתונים. בסיומה של תקופת צמיחה 2 בשבוע מוסיף אלה ניתן ונקווה להניב חומר מספיק לניתוח."Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תמונה מייצגת של שכבה הבריאה CRCs זורע על קרום מסנן שקוף מוצג. שני תאים פנימיים וחיצוניים כלולים תקשורת מותנית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תמונה מייצגת של מסנן חצוי לשני חלקים והניחו לתוך קלטת פרפין עבור הטמעה. מסנן (א) יבוא עם ציפוי HEA לאחר הבקיע לפני ההסרה. (ב) ההוספה המסננת שוחררה מחבית פוליקרבונט. (
איור 4: סעיף א נציג H & E מוכתם הצלב של מסנן הכנס תאים (20X). שניהם הממברנה (למטה) ו שכבת התאים (למעלה) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: סדרת נציג מוארת שדה (BF) ו Immunofluorescence (IF) תמונות שלתאים מחולקים על המסנן (40X). חתכי רוחב של המסנן ותאים מוצגים. תמונת BF בלא כתם של התאים על פני השטח המסננים (5A) מלווה תמונות עבור הגרעין מוכתם DAPI (5B) ו מכתים immunofluorescent עבור שני חלבונים שונים, p63 (5C) ואת קולטן האנדרוגן (AR, 5D). שכבה על מרוכבים מדורי התא (5E, F) מגדירה לוקליזציה של אותות IF בהקשר של התאים ולסנן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: נציג Immunofluorescence (IF) תמונה של תאים מחולקים על המסנן לעומת סעיף של ערמונית האפיתל מרקמה (20X).תמונת חתך של הכנס המסנן שלנו מוצגת (איור 6 א) לעומת שכבות אפיתל ductal של ערמונית ללא פגע (איור 6). המכתים של p63, הקל AR ואת הגרעין בוצע כפי באיור 5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שורות תאים ראשיות הן פלטפורמה חשובה המתפתחת במהירות לחקר הסרטן. מערכת תרבות 3D תרבות מבוססת כנס תומכת הבידול של CRCs ערמונית העיקרי בתוך פרק זמן של שבועות. השיטה המסננת CRC מייצגת שיטת תפוקה חדשה, בינונית למחקר ערמונית. מודלי העכבר PDX קיימים הם זמן רב ויקר מאוד, ורבי דגימות PDX לא ניתן לגדל בתרבית, הגבלת ניסויים ביוזמת חוקר והתועלת שלהם. בנוסף, בעוד ששיעורי ההצלחה של הקמת PDX להשתנות 13 מאוד, השיטה CRC יש שיעור גבוה של הצלחה בהקמת שורות תאים 3. אנו רואים במערכת שלנו להיות משלימה את גישת organoid R-spondin מבוסס ערמונית; עם זאת, חוסר ההצלחה לגבי הקמת organoids מסרטן הערמונית העיקרית דווח 14. בנוסף, התקשורת, שיטות של הממסד,תחזוקה של CRCs והם פשוט באופן משמעותי מאשר גישת organoid ערמונית R מבוסס-spondin. כיתרון נוסף, את CRCs ניתן להקים משמש לבדיקת תרבויות נורמליות גידול מתאימים להשוואות מולקולריות ישירות.
כמה בעיות טכניות להישאר להתייחס בעת הקמת מערכת זו. ראשית, ציפוי ג'לטין להחיל את התחתון של המסנן הכנס עוזר, אך אינו מונע, דיפוזיה של במדיות דרך הממברנה. שינויי תקשורת תכופים משמשים כדי לשמור על שיפוע בהתאמה של בידול (שכבת תא עליונה או פסגה) לעומת צמיחה (שכבה תחתונה או בסיס של תאים) תנאים בתוך התא. שנית, תרבויות 3D CRC מוצלחות נדרשות צפיפות זריעת תא גבוהה יחסית. צפיפויות זריעה תחתונות ניב תוצאות עלובות ביחס לשלמות שכבת התאים שמתפתחת על פני השטח המסננים. זהו שיקול נפוץ כאשר culturing CRCs, ככל שהם גדלים בעירנות רבה כאשר שמרו עלצפיפות תא t גבוהה. לבסוף, ההסרה הראויה והטבעת פרפין הבאה של שכבת התאים בעינה הייתה קריטית להגדרת מידת התמיינות תאים. התוספת של agarose hydroxyethyl (HEA) הן פחות איבוד התא ושיפרה את המורפולוגיה הכוללת של תאים לעומת מסננים שאינם משובצים (לא מוצג). לאחר מוטבע כראוי, המסננים היו מחולקים ומעובד באופן נבדל דגימות תאים ורקמות טיפוסיות.
אנחנו רק מתחילים לחקות את הארכיטקטורה של האפיתל הערמונית בשיטה מסנן זה. שינויים נוספים על תנאי התרבות, למדיה למצע הם ערובה, אשר ניתן לטפל בקלות. לדוגמה, במדיות בידול מחדש שעשויים טוב יותר לקדם לומינל vs בידול הבזליים ניתן לבדוק במהירות. מאז זיהום lentiviral של CRCs שבוצע באותה קלות כמו עם תאים מסחריים סרטן 7 ואת CRCs 2D יש אלכך כבר טרנספקציה עם וקטורי עריכת טכנולוגית גני CAS9 / CRISPR לשנות את הגנום תא לצמיתות (מידע לא מוצג), ההשפעה של גנים שעברו מוטציה, למחוק או לתקן יכול להיבדק. באופן דומה, מעקב שושלת ניתן התאפשר על ידי החדרת גני כתב ספציפי שושלת.
בנוסף לסירוס ועיקור התקשורת או התאים, שינויים על פני השטח המסננים ניתן לבדוק גם. מצעי קרום מסנן שונים זמינים מסחרי. בנוסף, מצאנו כי תאי מטריקס המסחריים מספק סביבת צמיחה מתאימה כאשר מוחלים על החלק הפנימי של המסנן. בתור אחד היעדים של מערכת הכנס עדיף מודל המיקרו-סביבת הערמונית, אולי שינויים המעניינים ביותר יכולים להיות המבוא של תאי סטרומה נורמלים או נגזרות גידול, בין אם שיתוף תרבות עם CRCs בגבולות של הכנס או בתא התחתון להתנות את תקשורת הצמיחה. שינוי הכנס היטב עם חלקים oרקמת ערמונית ו decellularized היא גם אפשרית. לפי גישה זו, סטרומה / אינטראקציות אפיתל עלולות לאפשר התאים הראשוניים להשתמש רקמות decellularized כמו פיגום לצמיחה.
היכולת להקים תאים ראשוניים ובהמשך לספק את התנאים לבידול שלהם היא פורמט אידיאלי עבור יותר ביולוגית מחקר רלוונטי לתוך פיתוח בלוטות נורמלי לחקר הסרטן. המערכת המתוארת במסמך זה מספק פלטפורמה שבאמצעותה מספר בלתי מוגבל של סוגי תאים ושינויים ניתן לשלב כדי להתאים את המערכת לצרכים ניסיוני הפרט כדי לאסוף את הדגימות באופן מהימן עבור ניתוחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי T32 (CA 9686-18) ו TL1 (TL1TR001431) פרסים מענק עבודת הפוסט דוקטורט (שעון מקומי), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) וכן U01 PAR-12-095 (קומאר) ו P30 CA051008-21 (ויינר). קיבעון לדוגמא, חתך מכתים בוצע היסטולוגיה במרכז לחקר הסרטן לומברדי מקיף ואת המשאב המשותף רקמות. אנו מודים ריצ'רד שלגל לדיונים מועילים. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. Prostate cancer stem cells. J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
