Cardiac biowire platform er en in vitro metode, der anvendes til modne humane embryonale og inducerede pluripotente stamcelleafledte cardiomyocytter (hPSC-CM) ved at kombinere dyrkning tredimensionale celle med elektrisk stimulering. Dette håndskrift præsenterer den detaljerede opsætning af hjerte- biowire platformen.
Humane pluripotente stamcelleafledte cardiomyocytter (hPSC-CMS) har været en lovende cellekilde og har således tilskyndet undersøgelse af deres potentielle anvendelser i hjerte- forskning, herunder lægemiddelforskning, sygdom modellering, tissue engineering, og regenerativ medicin. Celler fremstillet ved eksisterende protokoller vise en række umodenhed sammenlignet med native voksne ventrikulære cardiomyocytter. Der er gjort mange forsøg på at modne hPSC-CMS med kun moderat modning nået hidtil. Derfor en manipuleret system, kaldet biowire, er blevet udtænkt ved at tilvejebringe både fysiske og elektriske signaler til at lede hPSC-CMS til en mere moden tilstand in vitro. Systemet anvender en mikrofremstillet platform til frø hPSC-CMS i collagen type I gel langs en stiv skabelon sutur til at samle sig på linie hjertevæv (biowire), som underkastes elektrisk felt-stimulering med en gradvis voksende frekvens. Sammenlignet med ikke-stimulerede kontroller,stimulerede biowired cardiomyocytter udviser en forøget grad af strukturel og elektrofysiologisk modning. Sådanne ændringer er afhængige af stimulation sats. Dette manuskript beskriver detaljeret design og skabelse af biowires.
Celle-baseret behandling er en af de mest lovende og undersøgte strategier for at opnå hjerteopheling / regeneration. Det er blevet hjulpet af hjertevæv teknik og samtidig tilførsel af biomaterialer 1, 2. De fleste tilgængelige celle kilder er blevet undersøgt i dyremodeller for deres potentielt gavnlige virkninger på beskadigede, syge eller ældre hjerter 3. Især har gjort en betydelig indsats for at anvende human pluripotente stamcelle (hPSC) afledt cardiomyocytter (hPSC-CM), et potentielt ubegrænset autolog celle kilde til hjertevæv engineering. hPSC-CM kan fremstilles under anvendelse af adskillige etablerede protokoller 4, 5, 6. Men de opnåede celler udviser føtale-lignende fænotyper, med en række af umodne egenskaber sammenlignet med voksne ventrikulære cardiomyocytter 7, </sup> 8 . Dette kan være en hindring for anvendelsen af hPSC-CM'er som modeller af voksen hjertevæv i forskning i narkotikaforskning og i udviklingen af voksne hjertesygdomsmodeller 9 .
For at overvinde denne begrænsning af fænotypisk umodenhed er nye tilgange blevet undersøgt aktivt for at fremme kardiomyocyt modning. Tidlige studier afslørede effektive formognningsegenskaber i neonatale rottekardiomyocytter via cyklisk mekanisk 10 eller elektrisk stimulering 11 . Gelkomprimering og cyklisk mekanisk stimulering viste sig også at forbedre nogle aspekter af hPSC-CM modning 12 , 13 med minimal forbedring af de elektrofysiologiske og calciumbehandlingsegenskaber. Derfor blev et platformsystem kaldet "biologisk ledning" (biowire) udformet ved at tilvejebringe både strukturelle signaler og elektrisk feltstimuleringn at øge modningen af hPSC-CM'erne 14. Dette system anvender en mikrofremstillet platform til at skabe linie hjertevæv, der er modtagelig for elektrisk felt-stimulering. Dette kan bruges til at forbedre den strukturelle og elektrofysiologiske løbetid på hPSC-CMS. Her beskriver vi detaljerne i at foretage sådanne biowires.
Dette håndskrift beskriver opsætning og implementering af manipuleret platform, biowire, for at forbedre modning af hPSC-CMS. Indretningen kan fremstilles i standard microfabrication faciliteter, og biowires kan fremstilles med almindelige celledyrkningsteknikker og en elektrisk stimulator.
Så vidt vi ved, er der ingen rapporterede metode, der ligner biowires. Denne strategi afslører, at forbedrede modningsprodukter egenskaber var afhængige af den elektriske stimulation regime, som det …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en bevilling-i-støtte fra Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14 til 0.006.265), driftstilskud fra de canadiske Institutes of Health Research (137.352 og 143.066), og en JP Bickell fundament tilskud (1.013.821 ) til SSN.
L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
Electrical stimulator | Grass | s88x | |
Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |