Summary

Получение нечеловеческих приматов ткани головного мозга для предварительного внедрения иммуногистохимии и электронной микроскопии

Published: April 03, 2017
doi:

Summary

Здесь мы предлагаем простой, недорогой и эффективный по времени протокола к химически исправить примата ткани мозга с акролеина фиксатором, что позволяет для длительного хранения, который совместим с предварительно встраивание иммуногистохимии для просвечивающей электронной микроскопии.

Abstract

Несмотря на все технические достижения на световом уровне микроскопии, электронная микроскопия остается единственным инструментом в нейробиологии, чтобы изучить и охарактеризовать ультраструктурные и морфологические детали нейронов, такие как синаптические контакты. Хорошее сохранение мозговой ткани для электронной микроскопии может быть получено строгими методами крио-фиксация, но эти методы являются весьма дорогостоящими и ограничить использование иммунноокрашивания, что имеет решающее значение для понимания связности определенных нейронных систем. Методы замораживания-замещения, были разработаны, чтобы обеспечить сочетание крио-фиксации с иммунноокрашивания. Однако воспроизводимость этих методологических подходов, как правило, опирается на дорогостоящих устройствах замораживания. Кроме того, достижение надежных результатов с этой техникой очень отнимающее много времени и навыки вызова. Следовательно, традиционный химически фиксированный мозг, в частности, с акролеином фиксатором, остается методом времени эффективного и недорогим, чтобы объединить электронмикроскопии с применением иммуногистохимии. Здесь мы предоставляем надежный экспериментальный протокол, используя химическую фиксацию акролеин, что приводит к сохранению примата ткани головного мозга и является совместимым с предварительно встраивание иммуногистохимии и просвечивающей электронной микроскопическое исследование.

Introduction

Световая микроскопия, в том числе конфокальной и двухфотонной микроскопии, оказалась эффективным инструментом для изучения в естественных нейронных процессов, среди прочего , 1, 2. Несмотря на то, типичное пространственное разрешение на (LM) уровне световой микроскопии составляет около 200 нм, последние технологические достижения с использованием различных источников света, таких как крайней ультрафиолетовой и мягкой рентгеновской микроскопии, значительно увеличились это разрешение на почти 10 нм пространственным разрешением 3 , 4, 5. Другие технологические достижения в области обработки изображений включают в сочетании магнитно – резонансной томографии с гистологии и обеспечить новый способ для измерения толщины миелиновой оболочки в естественных условиях, параметр , который традиционно измерима только на электронно – микроскопических (ЭМ) уровне 6, 7. AlthouGH эти достижения на уровне LM обеспечивают отличный инструмент для изучения живых процессов, детального вида и характеристики структур, таких как синаптические контакты, может быть достигнуто только с ЭМ, который предлагает решение, которое может достигать 0,5 нма. Однако наблюдение на уровне EM требует образцы, чтобы быть мертвым и изменены в некоторой степени, с химическими фиксаторов и дегидратации процессов, с тем чтобы сохранить цитоархитектуру. Таким образом, рассматривая биологические образцы с высоким разрешением может быть сложной задачей из – за радиационного повреждения от электронного пучка, низкий контраст, структурных отклонений мембран, или даже наличие артефактов , которые могут возникнуть после обезвоживания и эпоксидной смолы вложение 8, 9, 10.

Сохранение образцов в их нативной форме для структурного анализа может быть достигнуто с помощью «Cryo EM стекловидных разделов» или CEMOVIS, секционирования подхода, которыйвключает быстрое замораживание и внедрение образца в стекловидном льде и изучении секций под EM при криогенной температуре 11, 12. Эта процедура позволяет для исследования образцов , пока они еще твердые и полностью гидратированный, тем самым устраняя артефакты , вызванные обезвоживанием процессов 13. Тем не менее, этот метод включает в себя дополнительные устройства для крио-ultramicrotomy, а также дополнительные устройства на стандарте EM, с тем чтобы этим наблюдением при очень низких температурах, которые генерируют значительные дополнительные затраты. Кроме того, подход CEMOVIS исключает использование иммунноокрашивания методов, так как антитела, как правило, должны быть инкубировали при комнатной температуре. В качестве альтернативы, можно сочетать ультраструктурный анализ с иммуногистохимическими процедурами с использованием сублимационного замещения подхода, в течение которых образцы крио-фиксированные медленно размороженный в то время погружены в крио-защитный химических веществах и йан внедренный в специализированных смол, таких как Lowicryls. После встраивания иммунноокрашивания затем могут быть выполнены на таком материале 12. Тем не менее, сублимационное замещение и крио-фиксирующая метода отнимает много времени. Они требуют установок дополнительного оборудования и все еще требуют образцов, которые подвергаются воздействию органического растворителя и химическому фиксатору , которые могут изменить цитоархитектуру, несмотря на использовании низкой температуры 14, 15. Таким образом, несмотря на все технические достижения как на LM и уровня EM, химической фиксации ткани головного мозга, в частности , с акролеином, остается недорогой и эффективный по времени метод , чтобы объединить иммуногистохимии с EM 16.

В последние десятилетия было сделано много попыток найти смесь альдегидов, которые обеспечивают наилучшую сохранность тканей. До 1960-х годов, единственный химический закрепляющий, что дало приемлемые результаты для EM был четырехокись осмия, Тем не менее, четырехокись осмия является высокотоксичным и дорогим, исключающее его применение через сосудистую систему, чтобы исправить органы, такие как мозг. Акролеина был введен в конце 1950 – х годов в качестве надежного способа для сохранения тканей животного , пригодного для ЭМ наблюдения клеточных структур 17. Он проникает в ткани более глубоко и реагирует быстрее , чем другие альдегиды , когда используются для фиксации путем погружения и обеспечивает хорошую сохранность компонентов цитоплазмы, с минимальной усадкой ткани 17. Такая особенность дает акролеин фиксации явное преимущество по сравнению с другими альдегидами при использовании в свежей ткани, позволяя более точную локализацию живого молекулярных соединений, такие как ферменты и другие белки 18. Действительно, это было подтверждено на протяжении многих лет, как легкий, эффективный и недорогого метод фиксации для визуализации на уровне ЕСТ у многих видов, в том числе амфибий и грызунов, как эффективно StabiliZes пептиды и белки, сохраняют антигенность и обеспечивают относительно нетронутых ультраструктур при использовании в сочетании с другим альдегидом фиксативом 16, 18, 19, 20, 21. Протоколы для фиксации в акролеине грызунов с тех пор были стандартизированы и широко используются, в частности , группа ПИКЕЛА, чтобы осуществить двойное иммунноокрашивание для EM 16, 22. Несколько групп использовали акролеин фиксации в тканях мозга приматов , не человек 23. Однако, насколько нам известно, есть только один протокол опубликован эффективно описывающий химическую фиксацию с акролеином в отличных от человека приматов , который совместим с ЭМ иммунноокрашивания 24.

В этой статье мы предлагаем простой и надежный способ эффективно химически исправить не-шумН. приматы мозг с акролеином, что позволяет для потенциально длительного хранения вместе с предварительно встраиванием иммунноокрашивания и EM передачи экспертизы.

Protocol

Заявление по этике: Все протоколы с участием животных были утверждены Comité де защита дез Animaux де l'Université Laval и были сделаны в соответствии с Канадским советом по уходу за животными Руководства к уходу и использованию экспериментальных животных (Ed 2.). Протокол, описанный здесь, был оптим…

Representative Results

В этом разделе представлены репрезентативные результаты, которые были получены после наблюдения, на уровне ЭМ передачи, из иммуноокрашивания примата ткани мозга химически фиксированной со смесью 3% акролеина и 4% PFA. Мы достигли хорошей сохранности ультраструктуры, ка…

Discussion

В этой статье мы представляем надежный протокол для транскардиальной перфузии приматов, отличных от человека и предварительно вложения иммуногистохимии, пригодной для EM образца экспертизы. Несмотря на то, типично крио-ЭМ, такие как CEMOVIS, обеспечивает хорошее сохранение ультраструкту?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (NSERC, 401848-2011 к МП). MP получил награду карьеры от Fonds де Recherche дю Квебек-Santé (FRQ-S). LE был получателем докторской стипендии от Frq-S (FRQ-S 14D 29441). Мы благодарим Мари-Жозе Уоллман за техническую помощь.

Materials

Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) Fisher scientific S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) EM Science SX0710-1
Sodium chloride (NaCl) Fisher scientific S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) Fisher scientific T370-500
HCl  EMD HX0603-3 1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.
NaOH EMD SX0590-1 5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde Sigma P6148 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%) sigma 110221 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table Mopec CE400
Electronic perfusion pump cole parmer masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion) terumo  NN-1838R 18G 1 1/2
Needle terumo  NN-2713R 21G 1/2
Ketamine 20 mg/kg
Xylazine 4 mg/kg
Acepromazine 0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades Feather           lance 201011           J9913 No.22 for surgery and    No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome Leica VT 1200S Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade Gillette GIN 642107
Glycerol Fisher scientific G33-4 30% dilution
Ethylene glycol Fisher scientific E178-4 30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4) sigma S-9125
Normal horse serum Jackson immunoResearch Laboratories 008-000-121 2% dilution
Cold-fish gelatin Aurion 900.033 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT Santa Cruz biotechnology SC-1458 1/500 dilution
Primary antibody, ChAT Chemicon (Millipore) AB144P 1/25 dilution
Primary antibody, TH ImmunoStar 22941 1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat Vector laboratories BA-9500 1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse Vector laboratories BA-2000 1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit Vector laboratories PK6100 8.8 µL/mL of A and B each
3'3 diaminobenzidine (DAB) Sigma D5637 0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30% Fisher scientific H-323 0,005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4) Electron microscopic science 2% 19152           4% 19150              Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin sigma A: M epoxy resin (44611)                B: hardener 964 (44612)                C: accelerator 960 (DY 060)  (44613)               D: plasticizer (44614)  Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups Electron microscopic science 70048-01
Ethanol commercial alcohols 1019C Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide Electron microscopic science 20401 Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides brain research laboratories 3875-FR Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film) Electron microscopic science 50425-25 Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome Leica UC7 EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim) Diatome  UT 1081 Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife Diatome  MC13437 equipped with a boat
Xylenes Fisher scientific X5SK-4
150-mesh copper grids Electron microscopic science G150-cu
grid-box Electron microscopic science 71138 Can store up to 100 grids
Sodium citrate Anachemia 81983
Lead nitrate sigma L-6258 Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe terumo  SS-05L 5 mL
Syringe filter corning 431222 0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper) Electron microscopic science 70086-1
Parafilm Laboratory film PM-999
Mineral oil Sigma M5904

References

  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Play Video

Cite This Article
Eid, L., Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (122), e55397, doi:10.3791/55397 (2017).

View Video