Здесь мы предлагаем простой, недорогой и эффективный по времени протокола к химически исправить примата ткани мозга с акролеина фиксатором, что позволяет для длительного хранения, который совместим с предварительно встраивание иммуногистохимии для просвечивающей электронной микроскопии.
Несмотря на все технические достижения на световом уровне микроскопии, электронная микроскопия остается единственным инструментом в нейробиологии, чтобы изучить и охарактеризовать ультраструктурные и морфологические детали нейронов, такие как синаптические контакты. Хорошее сохранение мозговой ткани для электронной микроскопии может быть получено строгими методами крио-фиксация, но эти методы являются весьма дорогостоящими и ограничить использование иммунноокрашивания, что имеет решающее значение для понимания связности определенных нейронных систем. Методы замораживания-замещения, были разработаны, чтобы обеспечить сочетание крио-фиксации с иммунноокрашивания. Однако воспроизводимость этих методологических подходов, как правило, опирается на дорогостоящих устройствах замораживания. Кроме того, достижение надежных результатов с этой техникой очень отнимающее много времени и навыки вызова. Следовательно, традиционный химически фиксированный мозг, в частности, с акролеином фиксатором, остается методом времени эффективного и недорогим, чтобы объединить электронмикроскопии с применением иммуногистохимии. Здесь мы предоставляем надежный экспериментальный протокол, используя химическую фиксацию акролеин, что приводит к сохранению примата ткани головного мозга и является совместимым с предварительно встраивание иммуногистохимии и просвечивающей электронной микроскопическое исследование.
Световая микроскопия, в том числе конфокальной и двухфотонной микроскопии, оказалась эффективным инструментом для изучения в естественных нейронных процессов, среди прочего , 1, 2. Несмотря на то, типичное пространственное разрешение на (LM) уровне световой микроскопии составляет около 200 нм, последние технологические достижения с использованием различных источников света, таких как крайней ультрафиолетовой и мягкой рентгеновской микроскопии, значительно увеличились это разрешение на почти 10 нм пространственным разрешением 3 , 4, 5. Другие технологические достижения в области обработки изображений включают в сочетании магнитно – резонансной томографии с гистологии и обеспечить новый способ для измерения толщины миелиновой оболочки в естественных условиях, параметр , который традиционно измерима только на электронно – микроскопических (ЭМ) уровне 6, 7. AlthouGH эти достижения на уровне LM обеспечивают отличный инструмент для изучения живых процессов, детального вида и характеристики структур, таких как синаптические контакты, может быть достигнуто только с ЭМ, который предлагает решение, которое может достигать 0,5 нма. Однако наблюдение на уровне EM требует образцы, чтобы быть мертвым и изменены в некоторой степени, с химическими фиксаторов и дегидратации процессов, с тем чтобы сохранить цитоархитектуру. Таким образом, рассматривая биологические образцы с высоким разрешением может быть сложной задачей из – за радиационного повреждения от электронного пучка, низкий контраст, структурных отклонений мембран, или даже наличие артефактов , которые могут возникнуть после обезвоживания и эпоксидной смолы вложение 8, 9, 10.
Сохранение образцов в их нативной форме для структурного анализа может быть достигнуто с помощью «Cryo EM стекловидных разделов» или CEMOVIS, секционирования подхода, которыйвключает быстрое замораживание и внедрение образца в стекловидном льде и изучении секций под EM при криогенной температуре 11, 12. Эта процедура позволяет для исследования образцов , пока они еще твердые и полностью гидратированный, тем самым устраняя артефакты , вызванные обезвоживанием процессов 13. Тем не менее, этот метод включает в себя дополнительные устройства для крио-ultramicrotomy, а также дополнительные устройства на стандарте EM, с тем чтобы этим наблюдением при очень низких температурах, которые генерируют значительные дополнительные затраты. Кроме того, подход CEMOVIS исключает использование иммунноокрашивания методов, так как антитела, как правило, должны быть инкубировали при комнатной температуре. В качестве альтернативы, можно сочетать ультраструктурный анализ с иммуногистохимическими процедурами с использованием сублимационного замещения подхода, в течение которых образцы крио-фиксированные медленно размороженный в то время погружены в крио-защитный химических веществах и йан внедренный в специализированных смол, таких как Lowicryls. После встраивания иммунноокрашивания затем могут быть выполнены на таком материале 12. Тем не менее, сублимационное замещение и крио-фиксирующая метода отнимает много времени. Они требуют установок дополнительного оборудования и все еще требуют образцов, которые подвергаются воздействию органического растворителя и химическому фиксатору , которые могут изменить цитоархитектуру, несмотря на использовании низкой температуры 14, 15. Таким образом, несмотря на все технические достижения как на LM и уровня EM, химической фиксации ткани головного мозга, в частности , с акролеином, остается недорогой и эффективный по времени метод , чтобы объединить иммуногистохимии с EM 16.
В последние десятилетия было сделано много попыток найти смесь альдегидов, которые обеспечивают наилучшую сохранность тканей. До 1960-х годов, единственный химический закрепляющий, что дало приемлемые результаты для EM был четырехокись осмия, Тем не менее, четырехокись осмия является высокотоксичным и дорогим, исключающее его применение через сосудистую систему, чтобы исправить органы, такие как мозг. Акролеина был введен в конце 1950 – х годов в качестве надежного способа для сохранения тканей животного , пригодного для ЭМ наблюдения клеточных структур 17. Он проникает в ткани более глубоко и реагирует быстрее , чем другие альдегиды , когда используются для фиксации путем погружения и обеспечивает хорошую сохранность компонентов цитоплазмы, с минимальной усадкой ткани 17. Такая особенность дает акролеин фиксации явное преимущество по сравнению с другими альдегидами при использовании в свежей ткани, позволяя более точную локализацию живого молекулярных соединений, такие как ферменты и другие белки 18. Действительно, это было подтверждено на протяжении многих лет, как легкий, эффективный и недорогого метод фиксации для визуализации на уровне ЕСТ у многих видов, в том числе амфибий и грызунов, как эффективно StabiliZes пептиды и белки, сохраняют антигенность и обеспечивают относительно нетронутых ультраструктур при использовании в сочетании с другим альдегидом фиксативом 16, 18, 19, 20, 21. Протоколы для фиксации в акролеине грызунов с тех пор были стандартизированы и широко используются, в частности , группа ПИКЕЛА, чтобы осуществить двойное иммунноокрашивание для EM 16, 22. Несколько групп использовали акролеин фиксации в тканях мозга приматов , не человек 23. Однако, насколько нам известно, есть только один протокол опубликован эффективно описывающий химическую фиксацию с акролеином в отличных от человека приматов , который совместим с ЭМ иммунноокрашивания 24.
В этой статье мы предлагаем простой и надежный способ эффективно химически исправить не-шумН. приматы мозг с акролеином, что позволяет для потенциально длительного хранения вместе с предварительно встраиванием иммунноокрашивания и EM передачи экспертизы.
В этой статье мы представляем надежный протокол для транскардиальной перфузии приматов, отличных от человека и предварительно вложения иммуногистохимии, пригодной для EM образца экспертизы. Несмотря на то, типично крио-ЭМ, такие как CEMOVIS, обеспечивает хорошее сохранение ультраструкту?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (NSERC, 401848-2011 к МП). MP получил награду карьеры от Fonds де Recherche дю Квебек-Santé (FRQ-S). LE был получателем докторской стипендии от Frq-S (FRQ-S 14D 29441). Мы благодарим Мари-Жозе Уоллман за техническую помощь.
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) | Fisher scientific | S374-500 | |
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) | EM Science | SX0710-1 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher scientific | S271-3 | |
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) | Fisher scientific | T370-500 | |
HCl | EMD | HX0603-3 | 1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection. |
NaOH | EMD | SX0590-1 | 5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection. |
Acrolein (90%) | sigma | 110221 | 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection. |
Autopsy venting table | Mopec | CE400 | |
Electronic perfusion pump | cole parmer | masterflex L/S 7523-90 | |
Needle (perfusion) | terumo | NN-1838R | 18G 1 1/2 |
Needle | terumo | NN-2713R | 21G 1/2 |
Ketamine | 20 mg/kg | ||
Xylazine | 4 mg/kg | ||
Acepromazine | 0.5 mg/kg | ||
Scalpel | |||
Scalpel blades | Feather lance | 201011 J9913 | No.22 for surgery and No. 11 for EM |
Surgical scissors | |||
Rongeurs | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | Calibrate blade before each use, when the device allows it |
Vibratome razor blade | Gillette | GIN 642107 | |
Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | 30% dilution |
Ethylene glycol | Fisher scientific | E178-4 | 30% dilution |
Sodium borohydride (NaBH4) | sigma | S-9125 | |
Normal horse serum | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% dilution |
Cold-fish gelatin | Aurion | 900.033 | 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40% |
Primary antibody, SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 dilution |
Primary antibody, ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 dilution |
Primary antibody, TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1000 dilution |
Biotinylated secondary antibody, goat | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1000 dilution |
Biotinylated secondary antibody, mouse | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1000 dilution |
Vectastain elite ABC kit | Vector laboratories | PK6100 | 8.8 µL/mL of A and B each |
3'3 diaminobenzidine (DAB) | Sigma | D5637 | 0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink. |
Peroxide (H2O2) 30% | Fisher scientific | H-323 | 0,005% dilution |
Osmium tetroxide (OsO4) | Electron microscopic science | 2% 19152 4% 19150 | Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection. |
Durcupan water-repellent epoxy resin | sigma | A: M epoxy resin (44611) B: hardener 964 (44612) C: accelerator 960 (DY 060) (44613) D: plasticizer (44614) | Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste. |
Alumium cups | Electron microscopic science | 70048-01 | |
Ethanol | commercial alcohols | 1019C | Dilute in distilled water with appropriate concentration |
Propylene oxide | Electron microscopic science | 20401 | Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood. |
Non-coated medium glass slides | brain research laboratories | 3875-FR | Grease surface with mineral oil |
Plastic film (Aclar embedding film) | Electron microscopic science | 50425-25 | Grease surface with mineral oil |
Ultramicrotome | Leica UC7 | EM UC7 | |
Diamond trimming tool (ultratrim) | Diatome | UT 1081 | Can use glass knife alternatively |
Ultra 45° Diatome Diamond knife | Diatome | MC13437 | equipped with a boat |
Xylenes | Fisher scientific | X5SK-4 | |
150-mesh copper grids | Electron microscopic science | G150-cu | |
grid-box | Electron microscopic science | 71138 | Can store up to 100 grids |
Sodium citrate | Anachemia | 81983 | |
Lead nitrate | sigma | L-6258 | Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light. |
Syringe | terumo | SS-05L | 5 mL |
Syringe filter | corning | 431222 | 0.2 µm |
Absorbing paper (bibulous paper) | Electron microscopic science | 70086-1 | |
Parafilm | Laboratory film | PM-999 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 |