Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Summary

Aquí, proporcionamos una, de bajo costo fácil, y eficiente en el tiempo de protocolo para fijar químicamente el tejido cerebral de los primates con fijador acroleína, lo que permite la conservación a largo plazo que es compatible con inmunohistoquímica pre-inclusión para microscopía electrónica de transmisión.

Abstract

A pesar de todos los avances tecnológicos a nivel de microscopía óptica, microscopía electrónica sigue siendo la única herramienta en la neurociencia para examinar y caracterizar los detalles ultraestructurales y morfológicas de las neuronas, como los contactos sinápticos. Buena conservación de tejido cerebral para la microscopía electrónica se puede obtener por métodos crio-fijación rigurosos, pero estas técnicas son más bien costosos y limitar el uso de immunolabeling, que es crucial para entender la conectividad de los sistemas neuronales identificados. métodos de congelación y de sustitución se han desarrollado para permitir la combinación de la crio-fijación con inmunomarcación. Sin embargo, la reproducibilidad de estos enfoques metodológicos por lo general se basa en dispositivos de congelación costosos. Por otra parte, la obtención de resultados fiables con esta técnica es mucho tiempo y habilidad desafiante. Por lo tanto, el tradicional cerebro químicamente fija, particularmente con fijador acroleína, sigue siendo un método eficiente en el tiempo y de bajo costo para combinar de electronesLa microscopía con inmunohistoquímica. Aquí, proporcionamos un protocolo experimental fiable usando fijación acroleína química que conduce a la preservación de tejido cerebral de los primates y es compatible con pre-incrustación de inmunohistoquímica y la transmisión de electrones examen microscópico.

Introduction

Microscopía de luz, incluyendo confocal y microscopía de dos fotones, ha demostrado ser una herramienta eficaz para el estudio de los procesos neuronales in vivo, entre otras cosas ^{1, 2.} Aunque la resolución espacial típica a nivel microscópico de luz (LM) es de aproximadamente 200 nm, los recientes avances tecnológicos utilizando diferentes fuentes de luz, como la luz ultravioleta extrema y microscopía de rayos X blandos, se han incrementado notablemente la presente resolución a una resolución espacial de casi 10 nm ^{3 , 4, 5.} Otros avances tecnológicos en formación de imágenes incluyen combinar imágenes de resonancia magnética con histología y proporcionar un nuevo método para medir el espesor de la vaina de mielina in vivo, un parámetro que fue tradicionalmente mensurable sólo a nivel de microscopía electrónica (EM) ^{6, 7.} although estos avances en el plano LM proporcionan una excelente herramienta para el estudio de los procesos vivos, una vista detallada y caracterización de estructuras, tales como contactos sinápticos, sólo puede lograrse con EM, lo que ofrece una resolución que puede alcanzar 0,5 nm. Sin embargo, la observación en el nivel EM requiere los especímenes estar muerto y alterado de alguna manera, con fijadores químicos y procesos de deshidratación, con el fin de preservar la citoarquitectura. Por lo tanto, el examen de muestras biológicas en alta resolución puede ser un reto debido al daño por radiación de haz de electrones, bajo contraste, las desviaciones estructurales de las membranas, o incluso la presencia de artefactos que pueden ocurrir después de la deshidratación y epoxi incrustación de ^{8, 9, 10.}

La preservación de especímenes en su forma nativa para el análisis estructural se puede lograr mediante el uso de "Cryo EM de las secciones vitrificados" o CEMOVIS, un enfoque de seccionamiento queconsiste en congelar rápidamente y la incrustación de la muestra en hielo vítreo y el examen de las secciones bajo la EM a una temperatura criogénica ^{11, 12.} Este procedimiento permite el examen de muestras, mientras que todavía son sólidos y completamente hidratado, la eliminación de artefactos causados por la deshidratación de este modo procesa ^13. Sin embargo, este método implica dispositivos adicionales para la crio-ultramicrotomía, así como dispositivos adicionales en el estándar de EM, con el fin de permitir que esta observación a muy bajas temperaturas, que generan costes adicionales significativos. Además, el enfoque CEMOVIS impide el uso de técnicas de inmunomarcaje, ya que los anticuerpos por lo general tienen que ser incubaron a RT. Alternativamente, es posible combinar el análisis ultraestructural con procedimientos inmunohistoquímicos utilizando un enfoque de congelación-sustitución, durante el cual las muestras crio-fija se descongelan lentamente mientras sumergido en productos químicos crio-protector y son then incrustado en resinas especializadas, tales como Lowicryls. Post-incrustación immunolabeling entonces se puede realizar en tal material ^12. Sin embargo, las técnicas de congelación-sustitución y crio-fijación son mucho tiempo. Requieren la instalación de equipo adicional y todavía requieren muestras de estar expuestos a disolvente orgánico y fijador químico que puede alterar la citoarquitectura, a pesar del uso de una temperatura baja ^{14, 15.} Por lo tanto, a pesar de todos los avances tecnológicos tanto en el LM y el nivel EM, la fijación química del tejido cerebral, en particular con acroleína, sigue siendo un método de bajo costo y eficiente en el tiempo para combinar inmunohistoquímica con EM ^16.

En las últimas décadas, se hicieron muchos intentos para encontrar una mezcla de aldehídos que proporcionan la mejor conservación del tejido. Antes de la década de 1960, el único fijador químico que dio resultados aceptables para EM era tetróxido de osmio. Sin embargo, tetróxido de osmio es muy tóxico y caro, lo que impide su uso a través del sistema vascular para fijar órganos tales como el cerebro. La acroleína se introdujo a finales de la década de 1950 como un método fiable para la conservación del tejido animal adecuado para EM observación de las estructuras celulares ^17. Se penetra en el tejido más profundamente y reacciona más rápidamente que otros aldehídos cuando se utilizan para la fijación por inmersión y permite una buena conservación de los componentes citoplasmáticos, con contracción mínima del tejido ^17. Tal característica proporciona la fijación acroleína una clara ventaja sobre otros aldehídos cuando se usa en tejido fresco, por lo que permite una localización más precisa de vivir compuestos moleculares, tales como enzimas y otras proteínas ^18. De hecho, se ha validado a través de los años como un método fácil, eficiente y de bajo costo de fijación para la visualización a nivel de EM en muchas especies, incluyendo anfibios y roedores, ya que de manera eficiente StAbILIzes péptidos y proteínas, conserva la antigenicidad y proporciona ultraestructura relativamente intacto cuando se utiliza en combinación con otro aldehído fijador ^{16, 18, 19, 20, 21.} Los protocolos para la fijación de la acroleína en roedores Desde entonces se han normalizado y utilizado ampliamente, en particular por el grupo Pickel, para poner en práctica la doble inmunomarcación para EM ^{16, 22.} Unos pocos grupos han utilizado la fijación acroleína en el tejido cerebral de primates no humanos ^23. Sin embargo, para nuestro conocimiento, no es sólo un protocolo publicado que describe de manera eficiente fijación química con acroleína en primates no humanos que es compatible con EM immunolabeling ^24.

En este artículo, proporcionamos un método sencillo y fiable para solucionar de manera eficiente químicamente no-humun cerebro de primates con acroleína, lo que permite una conservación potencialmente a largo plazo junto con pre-incrustación immunolabeling y EM transmisión examen.

Protocol

Ética Declaración: Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité de Protección des Animaux de l'Université Laval y se hicieron de acuerdo con el Consejo Canadiense de la Guía del Cuidado de Animales para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (2 ed.). El protocolo descrito aquí se optimizó para los animales adultos de aproximadamente 800 g. Los volúmenes de fijador se deben ajustar de acuerdo con el tamaño del animal. 1. Preparación de soluciones para per…

Representative Results

En esta sección, se presentan los resultados representativos que se obtuvieron después de la observación, en el nivel EM transmisión, del tejido cerebral de primates a inmunotinción fija químicamente con una mezcla de 3% de acroleína y 4% PFA. Hemos logrado una buena conservación de la ultraestructura, como se indica por la vaina de mielina relativamente intacto y la visualización ordenada de membranas dobles (Figura 2A). Contactos sinápticos, además de elemen…

Discussion

En este artículo, se presenta un protocolo fiable para la perfusión transcardiaca de primates no humanos y la inmunohistoquímica pre-incrustación adecuado para el examen de la muestra EM. Aunque típica crio-EM, tales como CEMOVIS, proporciona una buena preservación de la ultraestructura del cerebro, sino que también limita el uso de inmunohistoquímica ^12. Otras técnicas, incluyendo la crio-sustitución y técnica Tokuyaso, permiten post-incrustación de inmunohistoquímica, pero estas t?…

Materials

Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O)	EM Science	SX0710-1
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table	Mopec	CE400
Electronic perfusion pump	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades	Feather           lance	201011           J9913	No.22 for surgery and    No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% dilution
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4)	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% dilution
Cold-fish gelatin	Aurion	900.033	0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 dilution
Primary antibody, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
Primary antibody, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8.8 µL/mL of A and B each
3'3 diaminobenzidine (DAB)	Sigma	D5637	0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron microscopic science	2% 19152           4% 19150	Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin	sigma	A: M epoxy resin (44611)                B: hardener 964 (44612)                C: accelerator 960 (DY 060)  (44613)               D: plasticizer (44614)	Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups	Electron microscopic science	70048-01
Ethanol	commercial alcohols	1019C	Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide	Electron microscopic science	20401	Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides	brain research laboratories	3875-FR	Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film)	Electron microscopic science	50425-25	Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome	Leica UC7	EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim)	Diatome	UT 1081	Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife	Diatome	MC13437	equipped with a boat
Xylenes	Fisher scientific	X5SK-4
150-mesh copper grids	Electron microscopic science	G150-cu
grid-box	Electron microscopic science	71138	Can store up to 100 grids
Sodium citrate	Anachemia	81983
Lead nitrate	sigma	L-6258	Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe	terumo	SS-05L	5 mL
Syringe filter	corning	431222	0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper)	Electron microscopic science	70086-1
Parafilm	Laboratory film	PM-999
Mineral oil	Sigma	M5904