Création d'un tissu cardiaque exposant l'intégration mécanique des sphéroïdes à l'aide de la bioprinterie 3D
Summary
Ce protocole décrit la bioprinture 3D du tissu cardiaque sans l'utilisation de biomatériaux. Les plaques cardiovasculaires bioprinées 3D présentent une intégration mécanique des sphéroïdes constitutifs et sont très prometteuses dans la régénération des tissus cardiaques et comme modèles 3D de maladies cardiaques.
Abstract
Ce protocole décrit la bioprinture 3D du tissu cardiaque sans l'utilisation de biomatériaux, en utilisant uniquement des cellules. Les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes sont d'abord isolés, comptés et mélangés aux rapports cellulaires désirés. Ils sont co-cultivés dans des puits individuels dans des plaques à 96 puits ultra-bas. Dans les 3 jours, les sphéroïdes battent. Ces sphéroïdes sont ensuite ramassés par une buse à l'aspiration sous vide et assemblés sur une matrice d'aiguille à l'aide d'une bioprintrice en 3D. Les sphéroïdes sont alors autorisés à fusionner sur le réseau d'aiguilles. Trois jours après la bioprammation en 3D, les sphéroïdes sont enlevés comme un patch intact, qui bat déjà spontanément. Les plaques cardiovasculaires bioprinées 3D présentent une intégration mécanique des sphéroïdes constitutifs et sont très prometteuses dans la régénération des tissus cardiaques et comme modèles 3D de maladies cardiaques.
Introduction
Il existe de nombreuses méthodes différentes de bioprinture 3D 1 , 2 , 3 . La bioprinture 3D est fréquemment classée par la technologie d'impression 1 , avec des exemples tels que la bioprin à jet d'encre, la bioprin de microextrusion, la biopramétrie assistée par laser, une combinaison de méthodes ou des approches plus récentes. La bioprinture en 3D peut également être classée dans des méthodes sans échafaudage ou dépendantes de l'échafaudage 4 . La plupart des méthodes de biopramétrie en 3D dépendent de l'échafaudage, où il existe un besoin de biomatériaux, p.ex. bioinks 5 ou échafaudages 6 . Cependant, la bioprin 3D dépendant de l'échafaudage fait face à de nombreux problèmes et limitations 4 , 7 , tels que l'immunogénicité du matériel d'échafaudage, le coût des bioinks exclusifs, la vitesse lente et la toxicité des produits de dégradation.
ScafL'ingénierie des tissus cardiaques sans plis utilisant des sphéroïdes a été tentée 8 , avec le potentiel de surmonter ces inconvénients de l'ingénierie tissulaire dépendante des échafaudages. Cependant, comme l'ont reconnu les auteurs dans ce document, il était difficile de manipuler et de positionner de manière robuste les sphéroïdes dans des endroits fixes, dans le cadre de la biofabrication. L'utilisation concomitante de l'ingénierie des tissus à base de biochimie 3D et de sphéroïde permet de surmonter ces difficultés. Dans ce protocole, nous décrivons la bioprinture 3D du tissu cardiaque sans autres biomatériaux, en utilisant uniquement des cellules sous forme de sphéroïdes.
Les bioprimes en 3D à base de sphéroïdes sans échafaudage 9 ont la possibilité de ramasser des sphéroïdes individuels à l'aide d'une aspiration sous vide et de les placer sur un réseau d'aiguille. Le concept de positionnement des sphéroïdes sur une trousse à aiguille en 3D bioprinting, s'inspire de l'utilisation de tableaux d'aiguilles (connu sous le nom de " kenzan ") dans l'ancien JapaNese art of flower arrangement, ikebana. Ce système permet aux sphéroïdes d'être positionnés avec précision dans n'importe quelle configuration et entraîne la fusion des sphéroïdes individuels sur une courte période pour créer un tissu 3D bioprinté. Cette méthode permet de manipuler facilement les sphéroïdes avec des implications potentielles pour l'avenir de la biofabrication d'organes sans échafaudages.
Protocol
Representative Results
Discussion
It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.
One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent les sources de financement suivantes: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research and the Maryland Stem Cell Research Fund (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
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