Summary
Dit protocol beschrijft 3D bioprinting van hartweefsel zonder het gebruik van biomaterialen. 3D bioprinted cardiac patches vertonen mechanische integratie van component sferoïden en zijn zeer veelbelovend in hartweefselregeneratie en als 3D-modellen van hart-en vaatziekten.
Abstract
Dit protocol beschrijft 3D bioprinting van hartweefsel zonder gebruik van biomaterialen, waarbij alleen cellen worden gebruikt. Cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten worden eerst geïsoleerd, geteld en gemengd bij gewenste celverhoudingen. Ze worden gecultiveerd in individuele putten in ultra-low attachment 96-wells platen. Binnen 3 dagen slaat er spheroidsvorm. Deze sferoïden worden dan opgevangen door een mondstuk met vacuümzuigkracht en gemonteerd op een naald array met behulp van een 3D bioprinter. De sferoïden mogen dan op de naald array zitten. Drie dagen na 3D bioprinting worden de sferoïden verwijderd als een intacte patch, die al spontaan slaat. 3D bioprinted cardiac patches vertonen mechanische integratie van component sferoïden en zijn zeer veelbelovend in hartweefselregeneratie en als 3D-modellen van hart-en vaatziekten.
Introduction
Er zijn veel verschillende methoden van 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting wordt vaak geclassificeerd door printtechnologie 1 , met voorbeelden zoals inkjet bioprinting, microextrusion bioprinting, laser assisted bioprinting, een combinatie van methoden of nieuwere benaderingen. 3D bioprinting kan ook worden ingedeeld in steigervrije of steigerafhankelijke methoden 4 . De meeste methoden van 3D bioprinting zijn steigerafhankelijk, waar biomaterialen nodig zijn, bijv. Bioinks 5 of steigers 6 . Echter, steigerafhankelijke 3D bioprinting ondervindt veel problemen en beperkingen 4 , 7 , zoals immunogeniciteit van steigermateriaal, kosten van eigen bio-verbindingen, trage snelheid en toxiciteit van afbraakproducten.
SCAFVouwvrije hartweefseltechniek met behulp van sferoïden is geprobeerd 8 , met het potentieel om deze nadelen van steigerafhankelijke weefseltechniek te overwinnen. Zoals echter door de auteurs in dat papier werd erkend, was het moeilijk om robuuste handgreep en positionering van spheroïden op vaste locaties, in het proces van biofabricatie. Het gelijktijdige gebruik van 3D bioprinting en spiraal gebaseerde weefseltechniek heeft de mogelijkheid om deze moeilijkheden te overwinnen. In dit protocol beschrijven we 3D bioprinting van hartweefsels zonder andere biomaterialen, waarbij alleen cellen in de vorm van sferoïden worden gebruikt.
Steigervrije spheroïde-gebaseerde 3D bioprinters 9 hebben de mogelijkheid om individuele spheroïden op te halen met behulp van vacuümzuigen en positioneren op een naald array. Het concept van positionering sferoïden op een naald array in 3D bioprinting, is geïnspireerd op het gebruik van naald arrays (bekend als " kenzan ") in de oude JapaNese kunst van bloemstuk, ikebana. Met dit systeem kunnen spheroïden precies in elke configuratie gepositioneerd worden, waardoor de individuele spheroïden over een korte periode samenvoegen om een 3D bioprintend weefsel te creëren. Met deze methode kunnen spheroïden gemakkelijk worden gemanipuleerd, met mogelijke implicaties voor de toekomst van de stellingvrije organische biofabricatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van cardiomyocyten
- Genereer en kweek menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) op 6-putjes platen die zijn bekleed met basismembraanmatrix zoals beschreven 10 .
- Differentieer hiPSCs in hiPSC afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) met behulp van eerder beschreven methoden 11 , 12 .
- Op dag 19 na differentiatie isoleren de cardiomyocyten met behulp van 2 ml trypsine / EDTA 0,05% in elke put gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Monitor de cardiomyocyten onder een optische microscoop om te kijken naar celledissociatie.
- Neutraliseer trypsine met 2 ml trypsine-inhibitor 0,0125%.
- Pool de geïsoleerde cardiomyocyten en verplaats ze in een 50 ml conische buis met behulp van een gemotoriseerde pipet vulmiddel.
- Centrifugeer de cel suspensie gedurende 5 minuten bij 250 xg bij kamertemperatuur om een pellet te verkrijgen.
- Resulteer de pellet in 5 ml Roswell ParkMemorial Institute (RPMI) celmedia aangevuld met B-27 (RPMI / B-27 celmedia).
- Pipette 20 μl cellen in celmedia en vlek met een gelijke hoeveelheid 0,4% Trypan Blue oplossing.
- Gebruik een geautomatiseerde celteller of een handmatige hemocytometer om de concentratie en cellevendabiliteit van de celsuspensie te tellen en te verkrijgen.
2. Bereiding van fibroblasten
- Initiatie van de cellijn 13 van het humane hartfibroblast (HCF) (volwassen ventriculaire type).
- Passage en isoleren volgens HCF culturing protocols 13 .
- Pipetteer 20 μl cellen in celmedia en vlek met een gelijke hoeveelheid Trypan Blue-oplossing 0,4%.
- Gebruik een geautomatiseerde celteller of een handmatige hemocytometer om de concentratie en cellevendabiliteit van de nieuwe celsuspensie te berekenen en te verkrijgen.
3. Bereiding van endotheelcellen
- Start het menselijke umbIlische ader endotheliale cel (HUVEC) lijn zoals beschreven 14 . Passage en isoleer ze volgens HUVEC-cultuurprotocollen zoals beschreven in 14 .
- Pipette 20 μl cellen in celmedia en vlek met een gelijke hoeveelheid 0,4% Trypan Blue oplossing.
- Gebruik een geautomatiseerde celteller of een handmatige hemocytometer om de concentratie en cellevendabiliteit van de celsuspensie te tellen en te verkrijgen.
4. Co-cultuur:
- Meng de drie celtypes (hiPSC-CM, HCFs en HUVECs) in RPMI / B-27 celmedia om een voorraad van gemengde celoplossing in een 50 ml conische buis te genereren bij een hiPSC-CM: HCF: HUVEC cel verhouding van 70:15:15 en concentratie van 165.000 cellen per ml.
- Verdeel de gemengde celoplossing in ultra-lage bevestiging 96-putjes U-bodemplaten bij 200 μL per putje, of 33.000 cellen per putje, met behulp van een multi-kanaalspipet.
- Incubeer de 96-putjesplaten gedurende 3 dagen (37 ° C, 5% kooldioxideIde, 95% vochtigheid).
- Inspecteer voor de aanwezigheid van gemengde cel multicellulaire sferoïden in het midden en de bodem van individuele putten, onder lichtmicroscopie.
OPMERKING: In een tweedimensionale microscopische projectie zullen deze spheroïden cirkelvormig zijn ( figuur 1 ). Spheroïden zouden binnen 24 uur moeten vormen, na het zaaien van cellen in ultra-low attachment 96-wells platen. Spheroïden moeten binnen 48 uur beginnen te klagen, na het zaaien van cellen in 96-putjes platen. Spheroïden die niet kloppen, mogen niet worden gebruikt voor 3D bioprinting om ervoor te zorgen dat de definitieve 3D bioprinted cardiac patch functioneel is. Immunofluorescentie van sferoïden voor connexin 43 (Cx43) en troponine kan worden gebruikt om sferoïde cellulaire samenstelling en kwaliteit 15 te beoordelen .
5. 3D bioprinting van steigervrije hartvaten
- Laad de platen die de sferoïden bevatten in de tijdschriften van de scaffoldvrije sferoïde-gebaseerde 3D bioprinter.
- Zet de 3D bioprinter aan en voer de 3D bioprinting software uit.
- Klik op "Extra", "Werkvoorbereiding", "Inspecteer modus" en vervolgens "Home Return".
- Klik op het groene pictogram onder "Start" om sferoïde inspectie te starten.
- Controleer of de bolvormige diameters verschijnen onder de kolom "(2) Dia (μm)" op het scherm.
- Om de gemiddelde bolvormige diameter naar de dichtstbijzijnde 100 μm te schatten, klikt u op "Initiële instellingen" en voert u de gemiddelde bolvormige diameter in in Stack Z-toonhoogte (μm).
- Klik op "Totaal", het nummer onder "Lagen" moet automatisch worden aangepast. Klik op "Apply" om de instellingen te bevestigen.
- Klik op 'Naald Array Map', ga naar 'Layer No.', selecteer de gewenste laag voor 3D bioprinting en teken het gewenste 3D bioprinting ontwerp op de kaart aan de linkerkant van het scherm door individuele bolvormige posities te selecteren. clicK "Apply" om het 3D bioprinting ontwerp te bevestigen.
- Klik op "Naald Array Check" om te beginnen met naald array inspectie. Als de naald array uit focus ligt, voer de waarden in op "OffsetZ (μm)", variërend van 0 tot 500 μm om de focus van de camera aan te passen, beginnend met 500 μm en afnemen met 100 μm tot 0 μm.
- Klik op "Inspectieparameters", "Type 1" en stel "Diameter (μm)" in op het gewenste diameterbereik. Stel 'Roundness (%)' en 'Gladheid (%)' in op gewenste percentages. Klik op "Apply" om de instellingen te bevestigen.
OPMERKING: hier werden de bolvormige diameters ingesteld van 450 μm tot 550 μm. "Rondheid (%)" en "Gladheid (%)" zijn computerberekende beoordeling van elke individuele sferoïde. Hier zijn de instellingen voor "Roundness (%)" 60% en "Gladheid (%)" is 70%. - Klik op "Aanwezigheid" en update de "Diameter (μm)" naar dezelfde instellingS in de vorige stap. Klik op "Apply" om de instellingen te bevestigen.
- Klik op 'Stapelmodus' en vervolgens op het groene pictogram onder 'Start' om de sferoïde op te halen met behulp van de mondstuk van de 3D bioprinter door vacuümzuigen en plaatsing van sferoïden op specifieke locaties in een naald array.
OPMERKING: voor een cardiale patch bestaande uit 81 spheroïden (9 spheroïden x 9 spheroïden), moet 3D bioprinting ongeveer 20 tot 30 minuten duren. - Na bioprinting, haal de naaldgroep op met behulp van steriele pincet, die de 3D bioprintte patch bevat en overbrengen in een 250 ml steriele beker die 150 ml RPMI / B-27 celmedia bevat.
- Incubeer de 3D bioprinted patch met de naald array gedurende 3 dagen (37 ° C, 5% kooldioxide, 95% vochtigheid).
6. Verwijderen van 3D Bioprinted Patch van de Naald Array en Patch Maturation
- Na 3 dagen incubatie, met één hand aan de basis van de naald array en de andere op de plastic deksel onder tHij pleistert, schuif het plastic omhulsel voorzichtig omhoog om de 3D bioprinted patch van de naald array te verwijderen.
OPMERKING: Smering met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) kan, net als voor deze stap, zo nodig worden aangebracht op de naalden voor een gladdere en makkelijker verwijdering. - Met behulp van een paar steriele pincet, haal het plastic deksel op met de 3D-bioprinted patch op de bovenkant en plaats de patch en de plastic kap in een 35 mm schotel met RPMI / B-27 celmedia.
- Schud het plastic deksel met de patch in het RPMI / B-27 celmedium zorgvuldig met de tang nog steeds vast aan de plastic kap om de patch in de media te laten vallen.
- Controleer de 3D bioprinted patch onder lichtmicroscopie om te visualiseren of het slaat om ervoor te zorgen dat de 3D bioprinted patch functioneel is.
- Incubeer de 3D bioprinted patch in de 35 mm schotel gedurende 3 dagen of langer (37 ° C, 5% kooldioxide, 95% vochtigheid).
OPMERKING: Na 3 dagen versmelt de sferoïden elkaar en de gaten inDe pleister waar de naalden waren, zou niet meer zichtbaar zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aan het einde van stap 4.4 (co-cultuur) moeten de cellen in elke put bij de onderkant van de ultra-lage bevestiging 96-putjes U-bodemplaten samenvoegen om de spheroïden door zwaartekracht te vormen. Deze sferoïden bevatten hiPSC-CM, HCF's en HUVECs, en kunnen visueel geïnspecteerd worden onder lichtmicroscopie, waar ze circulair door tweedimensionale projectie moeten worden weergegeven ( Figuur 1 ). Aan het einde van stap 6.3, moet de 3D bioprinted cardiac patch weefselruimten bevatten, door naaldgaten die door de naaldgroep zijn gecreëerd ( Figuur 2 , links). Op dit punt zouden de grenzen tussen de sferoïden onduidelijk moeten zijn en de pleister zou spontaan moeten verslaan, waarbij de mechanische integratie van sferoïden wordt vertoond. Aan het einde van stap 6.5 moeten de weefselruimtes worden ingevuld door omringend weefsel ( figuur 2 , rechts), terwijl de 3D bioprinted cardiac patch moet blijvenT spontaan.
Figuur 1 : Aanmaak van gemengde cel multicellulaire sferoïden. HiPSC-CM, HCF's en HUVEC's werden gemengd bij een hiPSC-CM: HCF: HUVEC-celverhouding van 70:15:15 en het celmengsel werd verdeeld in ultra-lage gehechtheid 96-putjes U-bodemplaten. Binnen 24 uur vormden multicellulaire spheroïden van gemengde cellen (links, rechts), één in elke put. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Creëren van hartweefsel dat mechanische integratie van sferoïden vertoont . Een 3D bioGedrukte cardiac patch onmiddellijk na verwijdering vanaf de naald array met zichtbare naaldgaten (links). Op dit moment waren de grenzen tussen de sferoïden al onduidelijk geworden en de pleister was al spontaan geslagen, waardoor de sferoïden mechanisch geïntegreerd waren. Drie dagen na verwijdering uit de naaldreeks werden de weefselholtes veroorzaakt door de naaldracing ingevuld door omringend weefsel (rechts) en de patch bleef spontaan verslaan. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen: Magic That Matters Fund voor Cardiovascular Research en het Maryland Stamcellen Research Fund (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. , http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. , https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
