Summary

3D Bioprinting을 이용한 Spheroids의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성

Published: July 02, 2017
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Summary

이 프로토콜은 생체 재료를 사용하지 않고 심장 ​​조직의 3D bioprinting을 설명합니다. 3D bioprinted 심장 패치는 구성 요소 spheroids의 기계적 통합을 나타내며 심장 조직 재생 및 심장병의 3D 모델로서 매우 유망합니다.

Abstract

이 프로토콜은 세포만을 사용하여 생체 재료를 사용하지 않고 심장 ​​조직의 3D 생체 인쇄를 설명합니다. Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아 세포를 먼저 분리하고, 원하는 세포 비율로 세고 혼합합니다. 그들은 초저 부착 96- 웰 플레이트에서 개별 웰에서 공동 배양됩니다. 3 일 이내에, 회전 타원체 형태가됩니다. 이 회전 타원체는 진공 흡인을 사용하여 노즐로 집어 들고 3D 바이오 프린터를 사용하여 니들 어레이에 조립됩니다. 회전 타원체는 바늘 어레이에서 융합됩니다. 3 차원 바이오 프린팅한지 3 일 후, 스페 로이드는 손상되지 않은 채로 제거되어 이미 자발적으로 박동하고 있습니다. 3D bioprinted 심장 패치는 구성 요소 spheroids의 기계적 통합을 나타내며 심장 조직 재생 및 심장병의 3D 모델로서 매우 유망합니다.

Introduction

3D bioprinting 1 , 2 , 3 에는 여러 가지 방법이 있습니다. 3D 바이오 프린팅은 잉크젯 바이오 프린팅, 마이크로 압출 바이오 프린팅, 레이저 보조 바이오 프린팅, 방법 조합 또는 새로운 접근법과 같은 예를 사용하여 인쇄 기술 1로 분류됩니다. 3D bioprinting은 scaffold-free 또는 scaffold-dependent 방법으로 분류 할 수 있습니다 4 . 3D bioprinting의 대부분의 방법은 scaffold에 의존합니다. 여기에는 bioinks 5 또는 scaffolds 6같은 생체 재료가 필요합니다. 그러나 발판 의존적 인 3D 바이오 프린팅은 스캐 폴딩 재료의 면역 원성, 독점적 바이오 인크의 비용, 분해 속도가 느린 독성 및 분해 제품의 독성과 같은 많은 문제점과 한계에 직면합니다.

Scafspheroids를 사용하는 fold-free cardiac tissue engineering이 시도되고 있으며, 스캐 폴드 의존 조직 공학의 단점을 극복 할 수있는 가능성이있다. 그러나이 논문의 저자들에 의해 인정 된 것처럼, 생물 공정의 과정에서 고정 된 위치에서 회전 타원체를 견고하게 다루고 위치시키는 것은 어려웠다. 3D bioprinting과 회전 타원체 기반 조직 공학을 함께 사용하면 이러한 어려움을 극복 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 다른 생체 물질을 사용하지 않고 심장 ​​조직의 3D 생체 프린팅을 설명합니다. 단, 회전 타원체 형태의 세포 만 사용하십시오.

스캐 폴드가 필요없는 회전 타원체 기반의 3D 생체 인식 장치 9 는 진공 흡입을 사용하여 개별 회전 타원체를 집어 들고 바늘 배열에 배치 할 수 있습니다. 3D bioprinting에서 바늘 어레이에 회전 타원체를 배치하는 개념은 고대 Japa에서 바늘 배열 ( " kenzan "으로 알려짐)의 사용에서 영감을 얻었습니다.꽃꽂이 , 꽃꽂이의 예술 . 이 시스템은 회전 타원체를 어떤 구성으로도 정확하게 위치시킬 수 있으며 짧은 시간에 개별 회전 타원체가 융합되어 3D 생체 조직을 생성합니다. 따라서이 방법은 회전 타원체를 쉽게 조작 할 수있게 해주 며, 미래의 발판없는 기관 생물 공학에 잠재적 인 영향을 미친다.

Protocol

1. 심근 세포의 제조 생성 및 인간이 유도 한 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs) 10 설명대로 기저막 매트릭스로 코팅 6 잘 접시에. 이전에 설명한 방법 11 , 12를 사용하여 hiPSCs를 hiPSC 유래 cardiomyocytes (hiPSC – CMs)로 구분하십시오. 분화 후 19 일에, 실온에서 5 분 동안 각 웰에서 0.05 % 트립신 / EDTA 2 mL를 사용하여 심근 세포를 ?…

Representative Results

4.4 단계 (공동 배양)가 끝나면 각 웰의 세포는 초저 부착 96-well U-bottom plate의 바닥에 응집되어 중력에 의해 회전 타원체가 형성됩니다. 이러한 회전 타원체는 hiPSC-CM, HCF 및 HUVEC를 포함하며 광학 현미경으로 육안 검사가 가능하며 2 차원 투영으로 원형으로 나타나야합니다 ( 그림 1 ). 6.3 단계의 끝에서, 3D 생체 보정 심장 패치는 바늘 어레이 ( <strong clas…

Discussion

It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.

One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 심장 혈관 연구에 대한 기금 모금 및 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2016-MSCRFI-2735)과 같은 기금 출처를 인정합니다.

Materials

Geltrex Invitrogen  A1413202
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher 15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125% Thermo Fisher R007100
RPMI Cell Media Invitrogen 11875-093 RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement Thermo Fisher 17504044 RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) Sciencell 6310
Human umbilical vein endothelial cells Lonza CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates  Akita Sumitomo Bakelite Co. MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer Cyfuse Biomedical K.K. N/A www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Troponin T Antibody Thermo Fisher 701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody Chemicon MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher P36935

References

  1. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
  2. Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
  3. Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
  4. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
  5. Cui, X., Boland, T., D’Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
  6. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O’Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
  7. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
  8. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
  9. Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
  10. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
  11. Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
  12. Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
  13. ScienCell Research Laboratories. . Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , (2017).
  14. Lonza Walkersville, Inc. . Endothelial Cell Systems – Technical Information & Instructions.,. , (2015).
  15. Thermo Fisher Scientific, Inc. . Immunofluorescence Method for IHC Detection. , (2017).
  16. Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
  17. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
  18. Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
  19. Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).

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Ong, C. S., Fukunishi, T., Nashed, A., Blazeski, A., Zhang, H., Hardy, S., DiSilvestre, D., Vricella, L., Conte, J., Tung, L., Tomaselli, G., Hibino, N. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (125), e55438, doi:10.3791/55438 (2017).

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