Opprettelse av hjertevæv som viser mekanisk integrasjon av sfæroider ved hjelp av 3D bioprinting
Summary
Denne protokollen beskriver 3D bioprinting av hjertevev uten bruk av biomaterialer. 3D bioprinted cardiac patches utviser mekanisk integrasjon av komponent sferoider og er svært lovende i hjertevevs regenerering og som 3D-modeller av hjertesykdom.
Abstract
Denne protokollen beskriver 3D bioprinting av hjertevev uten bruk av biomaterialer, ved bruk av bare celler. Kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster isoleres først, telles og blandes ved ønskede celleforhold. De samkultiveres i individuelle brønner i 96-brønnplater med ekstremt lav vedlegg. Innen 3 dager formes spheroider. Disse sfærene blir så plukket opp av en dyse med vakuumsuging og montert på en nålegruppe ved hjelp av en 3D bioprinter. Sfæronene får så smelte på nålen. Tre dager etter 3D bioprinting fjernes sfærene som en intakt patch, som allerede spontant slår. 3D bioprinted cardiac patches utviser mekanisk integrasjon av komponent sferoider og er svært lovende i hjertevevs regenerering og som 3D-modeller av hjertesykdom.
Introduction
Det finnes mange forskjellige metoder for 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting klassifiseres ofte av trykkteknologi 1 , med eksempler som inkjet bioprinting, microextrusion bioprinting, laserassistert bioprinting, en kombinasjon av metoder eller nyere tilnærminger. 3D bioprinting kan også klassifiseres i stillasfrie eller stillasavhengige metoder 4 . De fleste metoder for 3D bioprinting er stillasavhengig, der det er behov for biomaterialer, for eksempel bioinks 5 eller stillas 6 . Imidlertid står stillasavhengig 3D bioprinting overfor mange problemer og begrensninger 4 , 7 , som for eksempel immunogenitet av stillasemateriale, kostnaden for proprietære bioinks, lav hastighet og toksisitet for nedbrytningsprodukter.
SCAFFoldfri hjertevevsteknikk ved bruk av sfæroider har blitt forsøkt 8 , med potensial til å overvinne disse ulempene med stillasavhengig vevsteknikk. Imidlertid, som anerkjent av forfatterne i det papiret, hadde det vært vanskelig å håndtere og plassere sfæroider på faste steder, i ferd med biofabricering. Samtidig bruk av 3D bioprinting og sfæroidbasert vevsteknikk har potensial til å overvinne disse vanskelighetene. I denne protokollen beskriver vi 3D bioprinting av hjertevev uten andre biomaterialer, ved bruk av bare celler i form av sfæroider.
Stillasfrie sfæroidbaserte 3D-bioprintere 9 har muligheten til å plukke opp individuelle sfæroider ved hjelp av vakuumsuging og plassere dem på en nålestruktur. Konseptet med posisjonering sfæroider på en nålestrek i 3D bioprinting, er inspirert av bruk av nålarrayer (kjent som " kenzan ") i den gamle JapaNese kunst av blomsterarrangement, ikebana. Dette systemet tillater sfærer å plasseres nøyaktig i en hvilken som helst konfigurasjon og resulterer i at de enkelte sfæroider smelter sammen over en kort periode for å lage et 3D bioprinted vev. Denne metoden tillater dermed at sfæroider skal manipuleres med letthet, med potensielle implikasjoner for fremtiden for stillasfri organbiobakterisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.
One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner følgende finansieringskilder: Magic That Matters Fund for kardiovaskulær forskning og Maryland Stamcelle Research Fund (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D’Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O’Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. . Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. . Endothelial Cell Systems – Technical Information & Instructions.,. , (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. . Immunofluorescence Method for IHC Detection. , (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
