Skapande av hjärtvävnad som visar mekanisk integration av sfäroider med 3D bioprinting
Summary
Detta protokoll beskriver 3D bioprinting av hjärtvävnad utan användning av biomaterial. 3D bioprintade hjärtfläckar uppvisar mekanisk integration av komponent sfäroider och är mycket lovande vid hjärtvävnadsregenerering och som 3D-modeller av hjärtsjukdom.
Abstract
Detta protokoll beskriver 3D bioprinting av hjärtvävnad utan användning av biomaterial, med användning av endast celler. Kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster isoleras först, räknas och blandas vid önskade cellförhållanden. De odlas i enskilda brunnar i 96-brunnsplattor med ultra låga egenskaper. Inom 3 dagar, formar sfäroider form. Dessa sfäroider plockas sedan upp av ett munstycke med vakuumsugning och monteras på en nålmatris med en 3D bioprinter. Sfäroiderna får sedan smälta på nålstället. Tre dagar efter 3D bioprinting avlägsnas sfäroiderna som en intakt lapp, som redan spontant slår. 3D bioprintade hjärtfläckar uppvisar mekanisk integration av komponent sfäroider och är mycket lovande vid hjärtvävnadsregenerering och som 3D-modeller av hjärtsjukdom.
Introduction
Det finns många olika metoder för 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting klassificeras ofta av tryckteknik 1 , med exempel som bläckstråle bioprinting, biobränsle för mikroekstrudering, laserassisterad bioprinting, en kombination av metoder eller nyare metoder. 3D bioprinting kan också klassificeras i byggnadsfria eller byggnadsberoende metoder 4 . De flesta metoderna för 3D bioprinting är byggnadsberoende, där det finns behov av biomaterial, t ex bioinks 5 eller byggnadsställningar 6 . Stillbildsberoende 3D bioprinting står inför många problem och begränsningar 4 , 7 , såsom immunogenicitet av byggnadsmaterial, kostnaden för proprietära bioinks, långsam hastighet och toxicitet för nedbrytningsprodukter.
SCAFVeckfri hjärtvävnadsteknik med användning av sfäroider har försökt 8 , med potential att övervinna dessa nackdelar med byggnadsberoende vävnadsteknik. Men som bekräftat av författarna i det här papperet hade det varit svårt att hantera och positionera sfäroider på fasta platser, i processen med biofabricering. Den samtidiga användningen av 3D bioprinting och sfäroidbaserad vävnadsteknik har potential att övervinna dessa svårigheter. I detta protokoll beskriver vi 3D bioprinting av hjärtvävnad utan andra biomaterial, med endast celler i form av sfäroider.
Byggnadsfria sfäroidbaserade 3D bioprinter 9 har förmågan att plocka upp enskilda sfäroider med vakuumsugning och placera dem på en nålställning. Begreppet positionering sfäroider på en nålställning i 3D bioprinting, är inspirerad av användningen av nålarrayer (känd som " kenzan ") i den gamla JapaNese konst av blomsterarrangemang, ikebana. Detta system gör att sfäroiderna kan placeras exakt i någon konfiguration och resulterar i att de individuella sfäroiderna smälter samman under en kort period för att skapa en 3D bioprintad vävnad. Denna metod möjliggör sålunda sfäroider att manipuleras med lätthet, med potentiella konsekvenser för framtiden för byggnadsfri organ biofabricering.
Protocol
Representative Results
Discussion
It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.
One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna bekräftar följande finansieringskällor: Magic That Matters Fund för kardiovaskulär forskning och Maryland Stamcellsforskningsfond (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D’Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O’Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. . Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. . Endothelial Cell Systems – Technical Information & Instructions.,. , (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. . Immunofluorescence Method for IHC Detection. , (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
