Summary
抗体複合体 (ACs) と結合したウイルス由来ペプチドは、細胞に蓄積される高められた腫瘍の分子のペイロードを提供する可能性があるのための勢いを増しているアプローチです。このプロトコル ペプチド共役、AC とペイロードの細胞内蓄積、および腫瘍ターゲットを評価する一般的な方法を利用して、キーの初期開発段階で研究者に役立ちます。
Abstract
ウイルス由来ペプチド抗体抱合 (ACs) は、癌治療に用いられるし、現在 ACs 上高められた細胞の蓄積によるイメージング分子のペイロードの腫瘍細胞配信エージェントの可能性のある強力なクラスです。体外初期 AC 中に開発、蛍光技術、測定で細胞内局在性、蓄積の効率、およびターゲット細胞の特異性を決定するために十分です。現在、AC の細胞内蓄積および局在性を評価するためにセルを準備するための標準化された方法についてのコンセンサスはありません。ACs ウイルス由来ペプチドの最初のテストは、いくつかの候補が構築されている場合に特に重要です。蛍光法による細胞内蓄積を決定する細胞表面で ACs からバック グラウンド信号を受けます、蓄積の解釈を複雑にします。測定、通常扱われた細胞を分別し、別の細胞コンパートメントの放射能を測定します。ただし、セル換散の異なる細胞から細胞へ、しばしば核と細胞質のコンパートメントは十分に絶縁されていません。これは、ペイロード配信のプロパティ上の誤解を招くのデータを生成できます。標識の放射性核種イメージングに続いてマウス腫瘍のウイルス由来ペプチド修飾・ ACs の静脈注射はの体内の段階で腫瘍とペイロードのターゲット配信のプロパティを決定するための強力な方法開発。しかし、これは比較的最近の進歩、いくつかのグループは、この方法でウイルス由来ペプチド修飾 ACs を評価しました。共焦点の顕微鏡検査および測定を使用するときウイルス由来ペプチド修飾 AC の蓄積をより正確に評価する扱われた細胞の処理について述べる.具体的には、トリプシン細胞細胞表面を削除するためのメソッドでは、ACs がバインドされています。我々 はも細胞分別を改善するためのメソッドを提供します。最後に、このプロトコルは、担癌マウスのプロパティをターゲットと初期の腫瘍を評価するためポジトロン断層法 (PET) を用いた生体内のメソッドを提供します。我々 は放射性同位元素64Cu を使用して (t1/2 = 12.7 h) この議定書の例ペイロードとして。
Introduction
抗体複合体 (ACs) は、癌治療を改善するため、腫瘍を検出するための効果的な薬の変革クラスに成熟しているバイオ医薬品です。放射性、小分子生物毒素など分子のペイロードに共役モノクローナル抗体 (mAb) から成る、ACs が絶妙なターゲット抗原親和性と特異性を持つがん細胞にこれらのペイロードを提供することができます。こうして ACs 大幅に非特異的な毒性を軽減し、腫瘍部位でペイロード活動を増やす可能性があります。ACs 細胞傷害性小分子 (抗体薬物複合体としてとも呼ばれる) を輸送を従来の治療1,を失敗した乳癌、ホジキン リンパ腫患者の治療に承認されている治療、2。 加えて、ACs 輸送放射性同位元素 (通称: radioimmunoconjugates) が開発。イメージング放射性同位元素を運搬 AC 3前立腺がん転移を識別する承認されています。多くのより治療 ACs 申請承認4、楽観主義ががんケア5を改善するために ACs の未来のため高い。
それにもかかわらず、化学療法または放射性同位元素等を配送するときに、効果的に標的細胞内これらのペイロードを蓄積困難である ACs。この側面は、長期無病生存率やコントラストの高い腫瘍6,7をイメージングを提供する ACs の無力で多くの場合大きく貢献しています。一般に、ACs バインドのターゲット抗原一度彼らは受容体を介したエンドサイトーシスと呼ばれるプロセスを通じて内面化します。ACs はエンドソーム内部に陥れた劣化のリソソームに人身売買し、ペイロードを解放8。細胞内の輸送プロセス高ペイロードの特異性とターゲット癌細胞に対する有効性を達成するために ACs の課題があります。たとえば、多く抗原 Her2 など (ターゲット治療 AC トラスツズマブ emtansine) は、最初の 30 分の9に結合した抗体の 85% までをリサイクルできます。さらに、劣化が発生すると、リリースされた化学療法および放射性同位元素等積極的にエクスポートできます発現の増加および/または関連付けられる膜輸送タンパク質10,11の活動。ライソゾームの分解も阻害治療酵素など新規生物学的ペイロードの配信と非アクティブにすることができますオリゴヌクレオチド12,13。本質的に、がん細胞は、ACs によって提供されるペイロードの必要な細胞内蓄積を abrogating に効果的です。
このプロトコルでは、エンドソームわなに掛ける事を脱出し、細胞核へのローカライズ用のウイルス由来ペプチドに ACs 結合の概念を実装する方法について説明します。セルのホスト システムを操作するような洗練された、じゃないから潜在的なバイオ医薬品としてウイルス由来のタンパク質・ ペプチドの開発長い治療研究14に染み付いています。数百万年のウイルスは宿主細胞を効率的に入力するために正常な生理学的な哺乳類細胞システムを悪用することができる蛋白質の優れたコレクションを取得する進化しています。受容体を介したエンドサイトーシスを介して内在化されているウイルス、彼らはエスケープがリソソームに人身売買のプロテアーゼのローカライズされた濃度の猛攻撃が生存のため問題が発生することができますも挑戦しました。エンドソームわなに掛ける事を脱出するためのドラッグデリバリーにおける活用も特徴とウイルス由来ペプチドは、転写 (Tat) 蛋白質15のひと免疫不全ウイルス トランスです。Tat は、低 pH その時点で蛋白質のコンフォメーション変化発生にそれ自身を挿入し、エンドソーム膜16を混乱させる有効にする Tat の感知によるエンドソームわなに掛ける事をエスケープすることです。これは、結果、Tat ペイロード抱合体細胞質にアクセスすることができます。このプロトコルに関連する 2 番目のウイルスの処理要素は、核17を治療用遺伝子や薬を提供するために使用するアプローチです。ウイルスは、正常に過去の核膜核膜孔複合体 (NPC) を通過して進んでいるためホスト細胞の機械を操作するために進化してきました。細胞高分子含まれている (または含まれているタンパク質に結合) 核のバインドに必要な核局在化信号 (NLSs) 輸送蛋白質 (例えばkaryopherins α、β) NPC を通じて必要な動きを提供します。ウイルスは、ホスト細胞輸送タンパク質核18に往復を利用する能力を提供する NLS シーケンスを含むタンパク質を開発しています。
多数の ACs が以前 Tat と NLS 由来ペプチド修飾し、癌細胞内に蓄積する能力を対象化、腫瘍19,20,21,22 テスト、23,24,25,26,27,28,29,30 (表 1)。細胞傷害性ペイロードを提供する調査は ACs ウイルス由来ペプチドが未変更 ACs 22,26を殺す腫瘍、細胞毒性、細胞蓄積を大幅に増加させることができることを示した。AC のこの新しいクラスの共通の特徴は、その建設です。通常、ペプチッドには無料スルフヒ グループを提供するターミナル システインが含まれています。Mab は、まずNヒドロキシスクシンイミド (NHS) と両端のマレイミド グループを含む noncleavable 二官能性架橋剤と反応しました。NHS のエステルは、アミド結合を形成する mAb の第一級アミンと反応します。無料マレイミド グループと反応の mAb はチオエステル結合、ペプチドと mAb をこのようにリンクを形成するペプチド スルフヒ グループと、反応しました。Heterobifunctional 架橋剤がウイルス由来ペプチド ACs 22,23,26の構造で使用されるより一般的 homobifunctional 塗料の硬化剤は、使用される28をされていますが、 31,32。このプロトコル具体的に使用する架橋剤 sulfosuccinimidyl 4-(N maleimidomethyl) シクロヘキサン-1-カルボン酸 (スルホ SMCC) その使いやすさのためとの多くの承認された抗体医薬の共役のトラスツズマブ emtansine で使用されるので、ウイルス由来ペプチド ACs 8,22,23,26,31,32。ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 最初の活用効率を決定するための主な方法は、半定量化 mAb あたりペプチド数。蛍光標識二次抗体 mAb に固有を用いた共焦点顕微鏡は、当初ウイルス由来ペプチド修飾 ACs の細胞内の分布特性の評価方法です。これまでは、放射性同位元素、ウイルス由来ペプチド修飾 ACs によって提供される主なペイロードです。放射性同位元素は、細胞における放射能はガンマを数えることで簡単に算出できるので有利であります。さらに、ヒトのガンのマウス ・ モデルに変換される ACs は腫瘍ターゲット分子のイメージ投射様相を使用する単一光子放出コンピューター断層撮影、ポジトロン断層法 (PET) を評価する能力を持つ研究者を提供します。23,32,33します一般に、建設と検証試験方法の研究者によって主に使用される効果的に入力し提供する開発の初期段階でウイルス由来ペプチド修飾 ACs の非常に良い評価を提供、。ペイロード内標的細胞と腫瘍を標的。
さらに腫瘍の癌細胞中のそしてペイロードの配信を改善するための照明キー分野 Tat と NLS-修飾 ACs があります。NLS 変更 ACs に対して細胞内蓄積効率はささやかな23,31,34をすることができます。非効率的な細胞内蓄積は、エンドソームの継続的なわなに掛ける事が原因です。生体内で腫瘍が対象とすることができますもに減少すると両方 Tat と NLS-修飾 ACs。Tat および NLS のアクティブなシーケンスには、いくつかの正荷電残基が含まれています。モノクローナル抗体に接続されて、全体的なカチオンは大幅に増加した35をすることができます。結果として、Tat-NLS-変更 ACs が健全なティッシュの取り込みを増加、および急速な血のクリアランスを増加しました。
当社グループは、複合化合物を開発した NLS (ChAcNLS; にリンクされている胆汁酸から成る図 1)。ACs の ChAcNLS 変更は、提供された放射性同位元素の細胞内蓄積を増加し、腫瘍標的 NLS 変更と伝統的な ACs 33,34と比較して向上させることができます。胆汁酸の後ろのメカニズムは、セラミドの形成からエンドソーム脱出をトリガーする胆汁酸を利用する膜融合に頼ることはできません選択のノンエンベ ロープ ウイルスの機能に触発されます。たとえば、ブタの腸内ウイルス募集コール酸セラミド36,37,38にスフィンゴミエリンの加水分解を触媒するスフィンゴミエリナーゼをアクティブにしています。これはエンドソームの膜を不安定化、ウイルスのエスケープできます。胆汁酸は、NLS を補完する別のウイルス由来のコンポーネントです。
このフィールド移動する前方および将来ウイルス由来ペプチド、ACs によってペイロード配達で進歩が発生するは、初期の開発中の生化学的, 機能的特性の視覚的なデモを提供するために計ります。ここでは、細胞内蓄積と腫瘍は初期の段階の開発中にターゲットの効率的かつ簡単な定量、ウイルス由来ペプチド修飾 ACs の初期評価のための私達のプロトコルについて述べる。我々 は、例をモデル系として市販 Mab 7 3 と A14 を使用します。手順 1 では、構築された ACs の 'go' 決定するためことができる方法として SDS ページの使用について説明します。手順 2 では、trypsinization AC 細胞内分布と蓄積の改善された可視化を可能にするを使用して、メソッドについて説明します。3 核局在を正確に判断する改良された細胞分別の方法を示します。ペイロード64Cu を駆使し、この手順で (t1/2 = 12.7 h) は細胞排出されやすい、陽電子のエミッター 10 のため。したがって、手順 4 が生体内の腫瘍ペット画像を背景 (すなわち非標的健全なティッシュ) 腫瘍の取り込みを視覚化し、AC の例が具体的かつ効果的にできるかどうかを決定する評価をターゲットについて説明しますターゲット腫瘍。これらのメソッドは、さらに進歩のための候補者を識別するために ACs ウイルス由来ペプチドの開発調査官に対して十分です。
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Protocol
生体内で動物実験では記載は、承認プロトコルによると、動物実験センター病院ユニヴェルシテール ・ デ ・ シャーブ ルックの倫理委員会の倫理的な指針の下で行われました。
1. 抗体ペプチド共役
注: ChAcNLS は、任意の商業ペプチド メーカーや大学附属のペプチド合成サービス プラットフォームで合成できます。ChAcNLS の合成は、参照34で見つけることができます。手順 1 と 2 の IL 3Rα 39白血病抗原のために特定である mAb 7 3 を使用します。
- 1.7 mL 遠心チューブで 10 mg/mL にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.6 7 3 (~ 1 mg 総抗体) ソリューションを準備します。
- ジメチルスルホキシド (DMSO) 5-10 mM の濃度でスルホ SMCC を溶解します。ボルテックス ソリューションは徹底的に完全溶解を実現するために最適です。
- 7 3 を含む管 (モル比のスルホ-SMCC-に-7 3 必要に応じて 5-20 μ L) の間に通常溶存スルホ SMCC ソリューションを追加します。10、25、50-1 のスルホ-SMCC-に-7 3 比率をテストすることをお勧めします。1 時間室温で孵化させなさい。
-
浄化、PBS、pH 7.0 で限外濾過装置とバッファー交換を用いたマレイミド誘導体 7 3 を集中です。再び約 5 分破棄流れおよび PBS、pH 7.0 と遠心分離機で塗りつぶしのための 8,000 の x g で遠心分離機します。
- この 7-8 回を実行完全にバッファーを交換します。きれいな遠心管に逆さまフィルター デバイスを置くことによって回復集中 7 3 タンパク質。1,000 x g. 復元ボリュームで 2 分間遠心分離機は約 0.3 mL をする必要があります。
- マレイミド アクティブ 7 3 管内の前の手順で使用されるスルホ-SMCC-に-7 3 比を基準にして ChAcNLS の 2 倍モル超過分を追加し、4 ° C で一晩インキュベートたとえば、10-1 スルホ-SMCC-に-7 3 比率を使用した場合 20-1 ChAcNLS-に-7 3 の比率を使用しています。総容積を大幅に変更しないでください。
注: ChAcNLS 接合過程における降水量は発生しませんが、これは他のペプチドで発生する可能性がある可能性です。最も可能性の高い原因ペプチドは、疎水性沈殿物の印を反応管を観察します。これらのケースで親水性の向上を提供するために変更を設計するために興味のペプチッドを再訪の価値があります。 - PBS pH 7.4 (手順 1.4 参照) で目的濃度およびバッファー交換する限外濾過装置を使用して 7 G 3-ChAcNLS を集中します。総蛋白の回復量は ≥ をする必要があります元の原料の 75%。
- 12% のポリアクリルアミドゲル (、ChAcNLS を十分に分離重い共役し、光の nonconjugated チェーンからチェーンを提供します) を使用して構築された 7 G 3 ChAcNLS 候補者を評価する SDS ページを実行します。7 G 3-ChAcNLS ページの読み込みのミックス 10 μ g 含む 2 μ L β-メルカプトエタノールをバッファーし、同様に読み込みます。
- 適切な電圧 (120 V 12% ゲルの 1 時間) に設定し、電気泳動を実行します。Coomassie 染料前ゲルの底に達すると電気泳動を停止します。
注: ゲルをオフに実行 Coomassie 色素フロントをてはいけないです。 - ゲルの電気泳動装置を解除、脱染め色液 10 %v/v 氷酢酸と 20 %v/v のメタノールを含むですすいでください。
- ゲルの写真を撮って、定規やメジャーで距離 (cm) 移行基準の 7 3 抱合体。保持因子 (Rf) 値を計算 (蛋白質は Coomassie の移行前に、読み込み場所) からゲルの長さで割った値移行の距離であります。標準各蛋白質からの Rf 値に対してログの分子量 (MW) をプロットして、7 3 のサイズを推定抱合体します。
- 7 3 MW の差で割って抗体あたりペプチド数を共役させ、1768.5 g/mol (ChAcNLS MW) で 7 3 未変更の状態を計算します。
- Coomassie 染色ゲルのデジタル画像を撮影し、デンシトメトリーの分析を実行します。この時点で、鉛の候補者の選択は、重要な骨材種を含まない ChAcNLS 分子の最大数と AC に基づくことが。
2. 共焦点顕微鏡による細胞内蓄積評価
注: 興味のペイロードを持つ製剤を開発する前にペプチド抗体の細胞内蓄積細胞選択性をテストすることが重要です。Tat は、非特異的な細胞浸透のための傾向を持っている示されている、ため高価なペイロードと事業コストのかかる開発手順の前に最初解析細胞内蓄積とセル選択価値があります。このため、手順 1 はモノクローナル抗体アイソタイプ無関係な特定のコントロールを変更する必要も。プロトコルの残りの ACs 抗体あたり 10 ChAcNLS 分子変更でいきます。手順 2 と 3 のための重要なステップを含む回路図は、図 2で説明します。
注意: この手順プロトコルの処理やパラホルムアルデヒドの操作が含まれます。処理するとき製造業者の指示に従ってください。
- 200 nM 7 G 3-ChAcNLS などの変更コントロール モノクローナル抗体を用いた標的 TF 1 a 細胞を扱います。37 ° C で 1 h の抱合体と 5 x 106抗原陽性細胞を孵化させなさい
- 1 h 後清を削除し、氷冷 PBS で 3 x 1 mL で洗います。新鮮なメディアを追加し、37 ° C でさらに 1 時間インキュベート
-
追加の時間後に上清を除去、1 mL の氷冷 PBS で 3 x を洗います。3 最大 37 ° C で 30 分に 0.5 mL の PBS の 0.25% トリプシンとエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含むを追加します。
注: 初期のパイロット テスト中に勧めない AC の細胞内蓄積の違いを決定するために細胞を trypsinize にします。このプロトコルは、トリプシンの使用を促進する、これは別の AC 候補者の細胞内蓄積効率の評価を向上するしくみを紹介します。- 視覚的に切り離されるすべてのセルをチェックするインキュベーションの異なる回をテストします。また、汚損の解決の生存率と細胞因数を孵化し、前述40フローサイトメトリーによる解析を実行します。
- 細胞培養 RPMI 1640 media/10% ウシ胎児血清 1.5 ml のトリプシンを中和します。500 x g で 5 分で細胞を遠心上清を削除し、0.5 mL の氷冷 PBS で 3 x を洗います。
- 1% パラホルムアルデヒドと 30 分洗浄のため氷の上の 1% ショ糖を含む 0.5 mL の PBS で修正細胞細胞 0.5 mL の氷冷 PBS で 3 倍、250 × g で遠心する 5 分 Permeabilize セル 0.5 mL 0.15% を含む PBS で氷の上 5 分のトリトン X-100。氷冷 PBS のセルを洗浄し、遠心分離を繰り返します。
-
2 μ g/mL (または濃度を推奨メーカー) を含む 0.1 mL の PBS のセルを停止抗マウス (アイソタイプ特定) の Fc 二次ポリクローナル抗体標識 AlexaFluor 647 暗闇の中で部屋の温度で 1 時間。
- 0.5 mL の氷冷 PBS で 3 x 5 分と洗浄セル 250 x g で遠心分離機します。0.5 mL の PBS のセルを中断します。
一時停止: セルは、冷蔵庫で保存できます。
注意: それは興味の mAb の正しいアイソタイプを認識する二次抗体を選択する重要です。Propidium ヨウ化 (PI) は、核の染色と干渉しないの遠赤外線放出のため AF647 が選択されます。
- 0.5 mL の氷冷 PBS で 3 x 5 分と洗浄セル 250 x g で遠心分離機します。0.5 mL の PBS のセルを中断します。
- 細胞をコンテナーに 10 μ g/mL の濃度に PI を追加します。次に、メディアをマウントとカバーのガラス基板を用いたスライド ガラスに 1 x 10 の5セルをマウントします。
- 共焦点顕微鏡倒立レーザの Plan Apo 60 X の油浸漬目的ナ 1.42 と細胞を検査します。488 nm アルゴン レーザーと 600-650 nm のスペクトル スキャン プリズムを使用して PI 蛍光を検出します。AF647 蛍光 633 nm ヘリウム ネオン レーザーと 650-700 nm のスペクトル スキャン プリズムを使用します。PI と AF647 から順番に蛍光排出量を収集します。
注: は、評価とセルの比較で同じ設定を使用します。ただし、非トリプシンの細胞と比較してトリプシン セルの設定を調整する必要があります。 - 顕微鏡のソフトウェアを使用して画像を取得します。切片を用いたシリアル水平光 2 X ライン平均と 1,024 x 1,024 ピクセルをセル全体厚み 0.5 μ m 間隔で撮影した画像を収集します。最大蛍光強度で 4 つの連続したスライスから、積み上げ z 予測画像を提示します。
- 顕微鏡のソフトウェアと細胞を分析します。複合体の細胞分布を記録します。具体的には、細胞質の細胞内蛍光がグループ化されているかどうかおよび表面またはびまん性と均一なセルの近くを評価します。セルごとの相対的な蛍光強度を評価します。
3. 標識 AC 建設と64 Cu の効率的細胞内導入効率の評価のための細胞の分別
注意: 手順 3 と 4 を含む処理や放射能の操作。これらの手順を実行する前に安全教育と自分の所属機関の放射線安全機関から承認プロトコル研究者を承認する必要があります。
注: 手順 3 と 4 を用いて mAb A14、IL 5Rα41浸潤性膀胱癌抗原のために特定であります。また、すべての実験は、時間64Cu の半減期が短いために敏感です。一般に、それは過去の生体外で実験を実行する 1 週間待たずに最高と 72 h 以内vivo の研究。
- 1.7 mL チューブに 10 mM の濃度 DMSO の 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic 酸 (NOTA-NHS) を中断します。
- A14 (開始材料 2 mg) で NOTA NHS のモル超過分 50 を 0.1 M 炭酸水素ナトリウム pH 8.6 ボリューム ≤ 0.5 mL (最終 NOTA NHS 巻は総容積の 2 %v/v を超えない) 室温で 1 時間で反応します。
- 浄化とバッファー交換 NOTA-A14 PBS、pH 7.6 (手順 1.4 参照) で限外濾過装置を使用しています。
- その後、ChAcNLS の添付ファイルの 1.2 1.6 の手順に従います。
- 64CuCl2 0.1 M 炭酸水素ナトリウム、pH 5.5 37 ° C ≤ で 1 時間に 100 megabecquerel (MBq) と反応して NOTA-A14-ChAcNLS (250 μ g バッチ) 0.1 mL。64Cu は CIMS 42TR PET サイクロトロンで生成されます。
- 64Cu A14 ChAcNLS PBS ph 7.4 望ましい集中する限外濾過装置を使用しての集中 (手順 1.4 参照)。
-
溶媒として64Cu A14 ChAcNLS インスタントの薄層クロマトグラフィー (ITLC) によるクロマトグラフィーを用いたストリップと 0.1 M クエン酸ナトリウム pH 5.5 (ITLC 溶離液) の radiolabeling の効率を決定します。ITLC ストリップに反応液の 0.5 μ 因数を適用します。ストリップのオートラジオグラフィーを行って、デジタル画像を得る。
- バインドされている割合を取得して無料の64Cu 濃度測定を実行します。無料64cu 含有量は > 5%、前の手順に戻り、新たに浄化を実行します。
- さらに、集計を評価する染色 Coomassie の SDS-PAGE を実行します。SDS-2 ページ目のゲルのオートラジオグラフィー続いて radiolabeled 骨材種を判断するを実行します。
-
クオリティ チェック ポイントを結合親和性: 64Cu A14 抱合体濃度の増加を孵化させなさい (0-100 nM) と 1 mL あたり 1 x 106標的細胞複製に。非特異的結合を見積もるには、ラベルのない A14 の 100 モル過剰の存在下で細胞を64Cu A14 抱合体の重複したサンプルをミックスします。
- 氷上 1 h 後、細胞を洗浄し、合計の連結抗体サンプルとガンマ カウンターの合計の非特異的結合抗体サンプル カウントします。(合計バインドされた抗体の非特異的結合抗体) の特定のバインドをグラフに対する反応性無料64Cu A14 (nM) 試金で使用されます。グラフ作成ソフトウェアを使用して非線形回帰による解離定数 (Kd) を決定します。
- 64Cu 細胞蓄積研究: 100 セルを扱う64Cu 標識 A14 の nM は 1 h、6 h の抱合体、37 ° C で 24 h 前述した33。受容体の内在化をブロックする未修正の A14 ブロック IL 5Rα サイト、4 ° C の存在下での治療などの追加パラメーターが含まれます。
- 定義された時間でポイント、以前に記載されている手順 2.3 - 2.3.2 として PBS 含む 0.25% トリプシンの 0.5 mL を追加、37 ° C で EDTA は続いて中和・洗浄。
- 1% を含む膜換散バッファー内セルを孵化させなさい NP-40、10 mM Tris pH 7.5、10 mM の NaCl 3 mM で 10 分間氷の上 MgCl2バッファー遠心 5 分 90 x g で膜分離細胞。
- 上清を除去し、新鮮なチューブに配置します。これは細胞質画分を表します。核 3 を洗って氷冷 PBS で x 細胞質画分に洗浄を追加。
- 核と細胞質画分を含むバイアル、シールを確認します。64Cu カウンター校正 MBq に未加工のカウント数を変換するためにガンマに配置します。
-
全体に豊富な細胞質蛋白質細胞ライセート、核と細胞質画分、ラミンの A/C、制限された核蛋白質 Rab7 の西部のしみの分析を実行することによって核分離の品質を決定します。
- 治療 5 × 106細胞を免疫検定法 (RIPA) バッファーとの原形質膜の換散バッファーの 500 μ l ステップ 3.12 の含む 1%、2%、4% NP 40。さらに、孤立した核タンパク質を得るために RIPA バッファーの 500 μ L で隔離された核を扱います。
- -20 ° C で 60 分間冷アセトンのサンプル ボリューム x 4 を使用して分離核、細胞質、全体の細胞蛋白質の沈殿物します。10 分 13,000 × g で遠心し、蛋白ペレットが外れないように注意しながら上清をデカントします。タンパク質を溶解する pbs 100 μ L を追加します。
- 10 %sds ページのゲルのウェルに 10 μ g のタンパク質をロードします。1.7 1.9 で説明されているように、電気泳動を実行します。Refeference 43で説明したとおりの西部のしみの転送を実行します。
- はしご 〜 40 kDa の MW に対応する最高のマーカーを識別します。このマーカーで半分に膜をカットします。Lamin A/C 特異抗体の高い MW 蛋白質を含んでいるしみをプローブします。ラブ 7 特異抗体の低い MW 蛋白質膜をプローブします。西部のしみはよく知られている技法であり、このプロトコルに記述されていません。
4. ペット画像腫瘍標的化の評価
注: 異所性異種移植片を生成するマウスの腫瘍細胞を植え付けることの技術は、よく知られている、ほとんどの実験室の腫瘍システムに合わせた社内のプロトコルがあります。したがって、このプロトコルでは説明しません。異種移植モデルを非肥満糖尿病/重度複合免疫不全 (NOD/SCID) マウス IL 5Rα 陽性浸潤性膀胱腫瘍 HT 1376 年および HT B9 を軸受となります。IL 5Rα 陽性浸潤性膀胱腫瘍細胞は、異種の合計セルの > 66% を占めます。対照的に、IL 5Rα 陽性 HT B9 セルの ~ 11% だけが開発した異種41に含まれていた。したがってこのモデルは、AC 予見可能な患者の腫瘍の不均一性を表す 2 つの腫瘍における腫瘍ターゲットを評価するため優秀な例を提供します。
- ≥ を含むグループ 4 (NOD/SCID) マウスは尾静脈に64Cu A14 ChAcNLS、 64Cu A14 NLS、 64Cu A14 の 20-30 μ g (6-9 MBq) を挿入します。
- 同じ日に64グラム組織 (%ID/g) あたりの注射投与量 1 秒あたり放射性カウントに変換する Cu 5 MBq を含む円柱ファントム (24.8 mL) を配置します。
- 48 時間を待ち、2% イソフルランと酸素流量の 1.5 L/min と誘導の商工会議所にそれらを置くことによってマウスを麻酔します。誘導後、PET 装置に配置される前に、眼軟膏の無菌マウスの目に適用されます。
- 急速にマウスをイソフルランのノーズコーンとウェットサーフスクール腹臥位で pet テーブルに転送します。呼吸の位置と直腸プローブと前述の実験中に生理学的な条件を維持するモニター温度と呼吸率は、 44を説明します。
- 通常サンプリング モード設定、および 250-650 keV のエネルギー ウィンドウを使用してペットのデータ集録を開始します。通常、マウスあたり 45 分静的スキャンは復興と高品質 PET 画像の生産のための十分な一致するイベントを提供するのに十分です。
- 64Cu AC スキャン後にスキャナーからマウスを削除してケージに戻ってそれを置きます。マウスの動物実験施設に戻る前に十分に回復すること。
- 三次元の最大尤度の期待値最大化アルゴリズムの 20 回の反復を使用して再構成画像を取得します。
-
腫瘍やアミドのソフトウェアを使用して視覚的に査定できる臓器の利益 (率 ROI) 分析の領域を実行します。
- 3 D フリーハンド ツールの設定を使用して手動で、定量的な %ID/g データを取得する・ ロワを描画し、腫瘍または隣接する太ももの筋肉を丁寧に描きます。ROI 内のピクセルごとの数は、前の手順 4.2 から %ID/g に変換されます。
- 腫瘍のコントラスト、および定量的投資収益率 %id:/g、腫瘍-バック グラウンド比64Cu A14、 64Cu-A14-ChAcNLS、 64Cu A14 NLS 画像を比較します。
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Representative Results
手順 1 7 3 の建設を架橋剤は非常に信頼性の高いスルホ SMCC を使用して ChAcNLS に変更。通常、12% のゲルにロードすると SDS-PAGE を用いて、スルホ-SMCC-に-7 3 比の増加に比例して MW の区別の段階的増加で、この結果 ChAcNLS を個別に評価する重く、軽鎖は、使用し、活用 (図 3)。7 G 3 は、10、20、25、および 50-1 スルホ-SMCC-に-7 3 比 Rf 測定と MW 外挿結果 3、7、10、および 7 3 あたり 20 ChAcNLS 分子に反応しました。デンシトメトリーによる、パーセントのモノマー種は > 90 %7 3 3 10 ChAcNLS に変更です。7 G 3 ChAcNLS20集計の種は 45% です。これは SDS のページはシンプルながら、7 G の 3 ChAcNLS を選択するための効果的な共役発展のためについて説明します。抗体糖鎖により発生する可能性が抗体鎖を持つわずかなスミアがこの集計の種の同定には干渉しません。
手順 2 の代表的なデータは、トリプシン、トリプシンない効率の細胞内蓄積、ウイルス由来ペプチド修飾 ACs を評価するときとの違いを示しています。この例では細胞とトリプシン (図 4) なしでの細胞内蓄積を増加する 7 G 3 ChAcNLS の機能を評価できます。しかし、比較のため AC 効率と選択性を決定するために使用する複合体の蓄積を解釈するとき、trypsinization の重要性は明らかです。Trypsinization は、ベースライン細胞内蛍光レベルそのまま 7 3 で観測と確立することができます。7 3 の小巣の細胞質に限られること 1 つ詳細することができます。一方、トリプシンがないセル、7 G 3 固有蛍光 IL 3Rα が細胞表面に過剰発現による細胞表面に限定されます。これにより、細胞表面に蛍光を支配する、したがってブロックのビジュアル化されるから細胞内蛍光細胞内蓄積と分布を調査することは困難。IgG ChAcNLS と証拠として特異性を評価するとき、重要細胞をトリプシンです。あることは細胞表面からいくつかの非固有の蛍光が細胞がトリプシンない場合ペプチドによる細胞内蓄積のレベルを決定することができないだろうことがわかります。最後に、trypsinization なし 1 つが誤って解釈新開発 AC が標的細胞内組み合わせません。7 G 3 NLS で見られるようにではない細胞トリプシン蛍光の大半は再び細胞表面から。新鮮後、標的細胞内限定とはいえ、7 G 3 NLS は蓄積する可能性を観察できる 1 つ。
手順 3 の代表的なデータは、建設、アフィニティ、および生体外のペイロード配達効率のための品質管理とアイソトープ64A14 ChAcNLS Cu の特異性を示します。デンシトメトリー 12% ポリアクリルアミドゲル含む64Cu A14、 64Cu A14 NLS から撮影したレントゲンの画像上で実行または64Cu A14 ChAcNLS 表示標識の抱合体が (図 5 a) 100% モノマー種であります。64Cu A14 ChAcNLS IL 5Rα ナノモル親和性を示しています。64Cu A14 ChAcNLS 濃度の増加の機能として A14 ChAcNLS HT 1376 で HT B9 セル (図 5 b) 3-5 nM の濃度で特定のバインドに近づいて飽和を明らかにしました。64Cu A14 ChAcNLS HT 1376 年および HT B9 セルに Kd は 6.4 ± 1.7 nM と 3.1 ± 0.8 nM であった。ChAcNLS 共役は、HT 1376 年および HT B9 セルに IL 5Rα の A14 約 2.5-fold の親和性を低減しました。ガンマ放射能、核と細胞質の増加は64Cu A14 ChAcNLS によって提供される明らかにカウントは、増加時間 (図 6)。約を示します通常ガンマ カウント > 64 64Cu A14 ChAcNLS 過剰の存在下での治療と比較して Cu A14 ChAcNLS と扱われる細胞の核および細胞内蓄積の 6 増加そのまま A14 または治療研究を行うときは 4 ° c (図 6 a)。≥ 3 倍原子力の増加もあるし、 64 64Cu A14 とすべての時点で64Cu IgG ChAcNLS 細胞に相対的な Cu の細胞内蓄積テスト (図 6 b)。
セル分別のプロトコルの重要性を図 7に示します。1%、2%、または 4% を含む膜換散バッファーを添加して HT 1376 年および HT B9 セル NP 40。隔離された核だけを含む必要があります Lamin A/C。 それに応じて細胞質画分を Rab7 の排他的なする必要があります。コントロール、RIPA バッファーと分離セルを全体両方の画分におけるラミン A/C の肯定的な必要があります。このプロトコルは、分離の HT-1376 年細胞の核分画を評価するとき Rab7 の存在がないことを示しています。また、ラミン A/C 細胞質画分に存在はありません。しかし、4% によって細胞から細胞質に Rab7 の減らされた量がある NP-40 (図 7 a)。これは最も可能性の高いその 4 %np-40 換散バッファーは原形質膜に加えて核膜を中断することを提案します。これは細胞質蛋白質の核蛋白質の混合の結果、こうしてラブ 7 の濃度を薄め。これはラブ 7 本の減少を説明します。HT B9 セル、HT 1376 細胞よりもさらにもっと敏感です。細胞膜の換散バッファーで処理する 4% を含む NP 40、ラミン A/C に示されている細胞質画分 (図 7 b)。核一部分ラミン A/C 量対応する減少があります。HT B9 セル、Rab7 の細胞質画分の量が 1% を基準にして目に見えて減少で 2 %np-40 換散バッファー機密 NP 40。したがって、興味の特定の細胞と細胞の分別を最適化正確な核と細胞内に蓄積するペイロードの定量的な結果が 1 つにする必要があります。これは、小説の AC の核局在化の効率を評価するために重要です。
手順 4 の64Cu A14、 64Cu A14 NLS 64Cu A14 ChAcNLS 反対の後ろ足で HT 1376 年および HT B9 異所性異種移植片を軸受マウスのいずれかの投与 48 時間後に pet で腫瘍の可視化は、します。ターゲットのプロパティ (図 8)。私たちの例のように PET 画像の目視検査は、HT-1376 年、 64Cu A14 NLS (図 8 a)、 64Cu A14、 64Cu A14 ChAcNLS HT B9 腫瘍ターゲット機能を明らかにします。ただし、目視検査が HT B9 腫瘍として困難な場合、腫瘍に筋肉の比率 (図 8 b) を判断する ROI 分析を使用できます。
図 1: ChAcNLS 変更 Mab 。SV 40 ラージ T 抗原 (KKKRKV) から NLS 残基に挟まれた N 末端のシステインによってキャップされるスペーサー残留。コール酸 (緑色のブラケット) は、上記34としてシステインと結合されます。スルホ SMCC を介して共役用使用はシステインのスルフヒ グループの構築と ChAcNLS の浄化の後 (赤っこ mAb に既に示されている)。注: mAb (150 kDa) と ChAcNLS (1.8 kDa) ノンスケールです。適応し、Paquette から許可を得て転載、IL 5Rαspecific 抗体 M. ら NLS 胆汁酸抱合は細胞の蓄積と膀胱癌モデルにおける生体内で腫瘍ターゲット プロパティを向上します。ナノ診断化学。doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077。(2018 年)。
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図 2: AC 細胞治療法と共焦点顕微鏡による解析と細胞分画質の分析の後の処理の概略図。赤い矢印は、2.2、2.3、3.15、3.15.4 不可欠な手順に対応します。適応と転載許可し Beaudoin、S. ら ChAcNLS、抗体抱合体を許可するターゲット セル固有エンドソームを使用して脱出する小説の変更、ローカライズから核, と強化された総細胞内蓄積。分子薬学。13 (6) 1915-1926 年 doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016)。
図 3: ChAcNLS 変更 Mab の解析。削減 SDS-PAGE 参照として重く、軽鎖 kda と未変更の 7 の 3 に対応する分子量実行中のはしご (L) を表示します。次のレーンは、3、7、10、20 ChAcNLS と変更 7 3 から重く、軽鎖の移行バンドです。
図 4: mAb 細胞内の分布の分析と蓄積します。共焦点顕微鏡画像細胞内 7 3 を示す分布と 7 3 IL 3Rα 陽性白血病細胞における相対的な蛍光蓄積 7 G 3 ChAcNLS、igg 抗体と IgG ChAcNLS。細胞がトリプシンまたはない固定する前にトリプシンします。核が反 murine Fc AF647 色素 (mAb; グリーン) propidium ヨウ化 (PI; 赤)、染色、PI/mAb マージされます。スケールは 50 μ m です。内、トリプシン、トリプシン グループではなく、画像に示されている別の ACs 間同一機器の設定で買収されました。図 4 のトリプシンの部分は、権限を持つ refefence 34から適応されます。Sらの適応、Beaudoin から許可を得て転載ChAcNLS、抗体抱合体を許可する新規な改質細胞特異エンドソーム脱出、核, と強化された総細胞内蓄積にローカリゼーションの対象します。分子薬学。13 (6) 1915-1926 年 doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016)。
図 5:64 Cu A14 ChAcNLS 純度との親和性。(A) 64Cu 標識 A14 A14 NLS の放射化学的純度 A14 ChAcNLS SDS-PAGE によるオートラジオグラフィーの順にチェックされました。(B) 特定の結合曲線64Cu A14 と64Cu A14 ChAcNLS HT 1376 年および HT B9 セルに。誤差範囲は、複製の実験の標準偏差を示します。適応し、Paquette から許可を得て転載 M. et al.IL 5Rα 特異抗体に NLS 胆汁酸抱合は細胞の蓄積と膀胱癌モデルにおける生体内で腫瘍ターゲット プロパティを向上します。ナノ診断化学。doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077。(2018 年)。
図 6:64 Cu 核と細胞内蓄積。細胞治療の代表的な例を 3 通実行 (エラーバーは標準偏差を示す) 64Cu A14 ChAcNLS の蓄積機能を拡張 (B) と (A) 特異性を示す。% の蓄積が核 (左のパネル)、IL 5Rα 陽性浸潤性膀胱がん細胞の治療中に使用される放射能の総量に比べて総細胞内領域 (右側のパネル) で表示されます。誤差範囲は、複製の実験の標準偏差を示します。* p 0.05 を示します。
図 7: セル分別手順の解析。ラミン/C (トップしみ; 赤い矢印)、ラブ 7 (下部しみ; 黒い矢印) HT-1376 年および 1%、2%、または 4 のいずれかを含む膜換散バッファーの HT B9 セルの処置から得られる原子 (A) と (B) 細胞質分画の西部のしみ%NP-40。RIPA バッファーと分離全体の細胞は両方の分数でラミン A/C と Rab7 の肯定的な制御として使用されました。実行中の標準 (L) のみトップしみに描かれています。ラミン A/C の複数のアイソ フォームによる 3 つの矢印が表示されます。Paquette、M.らから適応し、転載許可IL 5Rα 特異抗体に NLS 胆汁酸抱合は細胞の蓄積と膀胱癌モデルにおける生体内で腫瘍ターゲット プロパティを向上します。ナノ診断化学。doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077。(2018 年)。
図 8:体内分析の腫瘍 Pet と ROI 分析ターゲットとは。ベアリング HT-1376 年 (赤矢印)、 64Cu A14、 64Cu A14 NLS 64Cu A14 ChAcNLS と静脈内注入 HT B9 (青い矢印) 腫瘍 NOD/SCID マウスの投与 48 時間後で (A) ペット画像。緑の矢印は肝取り込みです。筋肉 ROI 図面マゼンタの円で表示されます。投与 48 時間後の ACs の (B) 投資収益率 HT-1376 ・ HT B9 腫瘍-筋比。誤差範囲を示す実験標準偏差 n = マウスあたり 10 ・ ロワ (n = 5)。* p 0.05 を示します。
| Tat |
| CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20 |
| CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30 |
| CGISYGRKKRRQRRR 29 |
| GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25 |
| TRQARRNRRRRWRERQRGC 26 |
| NLS |
| CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27 |
| コール酸 CGYGPKKKRKVGG 34 |
表 1: Tat と AC の変更で使用される SV 40 大 T 抗原由来ペプチドのリスト。
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Discussion
抗がん剤の全身配信の主な目標は、腫瘍部位でがん細胞内取り込み蓄積を増加して健全なティッシュの不必要な副作用を減らすです。腫瘍細胞に分子のペイロードの AC ターゲット配信は、治療し、腫瘍を検出する非常に有望なアプローチです。ただし、有効性の欠如は、エンドソームわなに掛ける事によって引き起こされ、ストリーム ライソゾーム劣化を重要な課題のまま。このプロトコルは、ACs の次世代の建設のための例として ChAcNLS ペプチドを利用して、記載されている手順は細胞内配信されるペイロードの量を増やすことを目的に開発されている任意のペプチド修飾 AC に適応がん細胞を対象としました。
このプロトコルの最も重要なステップは、: 1) 識別し、高い MW を制限する集計種;2) 新鮮な細胞の細胞内蓄積を決定する分析の前に3) 細胞分別手順の品質保証の実行・ 4) ペットの腫瘍生体内ターゲットを評価するイメージングを実行します。
ウイルス由来ペプチド抗体の共役モノクローナル抗体の分子内架橋によって引き起こされる可能性が高い高い MW 骨材種発生しませんが重要です。当初の懸念で、さらに進行する前に対処する必要があります。不要な集計を含むペプチドの ACs を進める細胞内や生体内でのペイロード配信プロファイルなどの側面に虚偽の証拠を提供する結果を与えることができます。モノクローナル抗体の反応性マレイミドは最も可能性の高い共有結合集計担当は何です。1 つのソリューションは、スルホ SMCC に mAb の比率を減らすことです。Lys、システインなどのアミノ酸の N-アセチル誘導体を使用する別の方法としては、彼、Ser、マレイミド アクティブ mAb 45ペプチド共役中木。求の側鎖は、SMCC のマレイミド基と反応して内抗体架橋を減少することができます。また、抱合後サイズ排除クロマトグラフィーによる分離は、モノマー種45を分離する使用できます。抗体にペプチドのサイト固有の活用も可能です。たとえば、抗体炭水化物は、ペプチドを結合するモノマー種24を効率的に生産するには表示が変更できます。
12% ポリアクリルアミドゲルで SDS-PAGE は AC 種で大きさ違いの広い視野を得るために安価で効果的な方法です。% ポリアクリルアミドゲルの増加を使用すると、重鎖と分子種の分離は区別することは困難になります。逆に、% 削減ポリアクリルアミドを使用する場合、軽鎖はゲルをオフに実行する可能性があります。4 20% ポリアクリルアミドも含む勾配ゲルは、良好な保持が単一のゲルの重く、軽鎖のシフトを提供します。さまざまな分析技術生体分子分析のため利用可能な中で高速液体クロマトグラフィー及びキャピラリー電気泳動・ SDS が優れている SDS ページの分離と ACs 46のキャラクタリゼーションのためそれにもかかわらず、SDS ページはこれらの新薬の初期構築を分析し、アクションの次のコースを決定し、早期かつ安価な方法です。
細胞表面タンパクおよび連結 ACs の最大の番号を削除しますを 0.25% トリプシン (ステップ 2.3) を含む溶液のセルの培養は重要なのでそれは、改善された可視化と細胞内蓄積の間の相対的な増加抗体を参照します。最大蛍光強度で画像をキャプチャするカメラのパラメーターが設定されます。これは変化のために蓄積される AC 量セルからセルへです。したがってにも評価されるように、少ない AC 累積セルの最大輝度で画像をキャプチャできます。ただし、がん抗原通常高度に発現している腫瘍細胞。セルは、トリプシンによって消化を受けずいた、細胞表面で ACs から発せられる蛍光がイメージを支配するでしょう。さらに、trypsinization なし開発は、微妙ですが、重要な細胞内蓄積性 ACs と限ることができます。
高品質細胞分別を確保64Cu の細胞質と核内の蓄積を正確に評価することが重要です。AC とペイロードの細胞内蓄積を増加する ChAcNLS の能力は核34アクティブなローカリゼーションによるものです。将来ウイルス ペプチドを開発すると、これらのペプチドが細胞内のペイロードの効率性を高めるための機構の一部として核へのローカライズも。したがって、その細胞の分別が正確にこのプロセスの詳細に高品質のこと大切です。このプロトコルは細胞質マーカーの核とも核マーカーの細胞質画分の評価の重要性を強調しています。例えば、胡主席らAC を開発 Tat ペプチド修飾し、アイソトープ ペイロード24の核蓄積を探検します。カルパインは、豊富な細胞質蛋白質の西部のしみの分析核分画に存在していた。これは最も可能性の高い商業核分離キットが使用されました。このプロトコルは、HT 1376 年および HT B9 がそのまま膜濃縮核を分離するために必要な濃度の異なる NP 40 を細胞を示した。HT B9 セルをバッファーに溶解し 4% を含む NP 40、ラミン A/C 頃治療原子膜を破壊し、細胞質に入るにラミン A/C の許可を示す細胞質画分に存在。核と細胞質画分は慎重に、分離しない場合、合計の細胞内蓄積に核局在化の貢献を識別することは困難かもしれない。小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア47,48,49など他の細胞内コンパートメントを標的生物- と人工的に由来ペプチドの報告があります。したがって、細胞内コンパートメントの分離は無関係になっています。
このプロトコルは、 64Cu A14 ChAcNLS HT-1376 年の HT B9 腫瘍ターゲットの説明を終了します。図 8に PET 画像の目視から増加によって明らかです HT 1376 HT B9 腫瘍 (図 8 a の優れたターゲットは周囲の背景64Cu A14 ChAcNLS 隣接する減少を基準信号の腫瘍ペット).ROI 分析は、腫瘍をターゲットを評価する能力も示しています。例では、腫瘍をターゲットを定量化し、優れた AC (図 8 b) 64Cu A14 ChAcNLS を示す ROI 腫瘍に筋肉率を使用します。PET イメージングでは、AC が正常臓器に隔離の評価も可能です。肝臓は代謝抗体原発臓器です。図 8 aは、肝臓での取り込みは64Cu A14 ChAcNLS と64Cu A14 投与マウスに匹敵するを示しています。この初期の開発段階では、このデータは、ChAcNLS は不要な隔離を発生しません示唆しています。64銅の 12.7 時間の半減期で、数日間の半減期を持つ ACs の理想的ではないです。以前説明したよう visual プロトコルで Zeglis とルイスによって、長寿命放射性同位元素ジルコニウム-89 (89Zr) の使用、ペイロードが物理的な半減期はモノクローナル抗体に適しておりペット50のイメージを作成することができます。したがって、数日間かけて腫瘍配信の評価、 89Zr は好ましい選択です。これは、療法が高い腫瘍吸収が良好であるされ、抗体7時間をかけて増加目標の場合特に重要です。体内にもターゲットをさらに探索する個々 の器官の摂取量を決定する実行または ACs を開発のプロパティを新しく隔離。さらに、マウスはターゲットの特異性を評価する腫瘍細胞の受容体部位をブロックする特定の抗体をそのまま predosed することができます。それにもかかわらず、 64Cu pet と ROI 分析機能が十分腫瘍の初期評価このプロトコルで提示した ACs の配信のプロパティ。
これまでのところ、ウイルス由来ペプチド ACs は、放射性同位元素等の配信に制限されています。これは歴史的な理由もあって、また放射性体外および体内テスト、中に簡単に定量化が全身非侵襲的なイメージ投射様相を使用して視覚化することができますので。当然、輸送、化学療法、酵素、オリゴヌクレオチドなどの放射性同位元素以外のペイロードの配信にこのフィールドを展開変更このプロトコルで記述されている技術を開発する必要があります。たとえば、代替のペイロードの細胞内蓄積を評価するための新しい方法は開発される必要があります。さらに、生体内の評価のための変更は、蜂必要これらのペイロードは簡単にイメージを作成することはできません、したがってそれは腫瘍、特異性、体内吸収効率を評価することは困難になります。これらの理由から、代替貨物を今後の開発のための代理のペイロードとして核ペイロードをおきます。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
この作品は、癌研究会 (カナダ) と CIM によって賄われていた。著者は、博士サミア Ait-Mohand、ジャン = フランソワ Beaudoin を支援ありがちましょう。MAb A14 の博士天使ロペス (大学南オーストラリア)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
References
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