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Immunology and Infection

के जवाब में मानव प्राथमिक न्यूट्रोफिल और Monocytes द्वारा रोधी गतिविधि का लाइव इमेजिंग Published: April 19, 2017 doi: 10.3791/55444
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1
1Aberdeen Fungal Group, MRC Centre for Medical Mycology, Institute of Medical Sciences, University of Aberdeen, 2Department of Medicine, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, US

Summary

यहाँ, हम लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में फ्लोरोसेंट एस्परजिलस संवाददाता conidia का उपयोग कर वास्तविक समय में प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऐंटिफंगल गतिविधि का आकलन और प्रवाह cytometry के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। उत्पन्न डेटा ऐसे कवकनाशी गतिविधि, phagocytosis, सेल प्रवास और कवक विकास के निषेध के रूप में मेजबान सेल एस्परजिलस बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

Abstract

Aspergillus fumigatus एक अवसरवादी कवक एक उच्च केस-मृत्यु दर के साथ प्रतिरक्षा में अक्षम मेजबान में आक्रामक संक्रमण के कारण रोगज़नक़ है। ए fumigatus के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की जांच रिसर्च इन विट्रो में विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऐंटिफंगल गतिविधि को मापने के लिए सुसंगत और विश्वसनीय परीक्षणों की कमी के द्वारा सीमित किया गया है। एक नई विधि प्राथमिक monocytes और फ्लोरोसेंट एस्परजिलस रिपोर्टर (चमक) conidia का उपयोग कर ए fumigatus के खिलाफ मानव दाताओं से न्यूट्रोफिल की ऐंटिफंगल गतिविधि का आकलन करने के वर्णन किया गया है। ये conidia एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग dsRed संवाददाता, जो constitutively लाइव चमक conidia द्वारा व्यक्त किया जाता है, और बाह्य एलेक्सा Fluor 633 है, जो phagolysosome भीतर गिरावट के लिए प्रतिरोधी है, इस प्रकार लाइव और मृत ए fumigatus conidia के बीच एक अंतर की इजाजत दी का लेबल लगा होता है। वीडियो माइक्रोस्कोपी और फ्लो बाद में सहभागिता कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता हैconidia और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच आयन, जबकि भी भक्षककोशिकीय प्रवास, phagocytosis और कवक विकास के निषेध पर जानकारी का खजाना उपलब्ध कराने कवकनाशी गतिविधि का आकलन। इस उपन्यास तकनीक पहले से ही ए fumigatus के खिलाफ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में रोमांचक नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है। यह प्रयोगशाला इस परख करते हैं, आवश्यक माइक्रोस्कोपी सहित और सुविधाओं प्रवाह cytometry के लिए आवश्यक सेटअप, और क्षमता मानव दाता रक्त और आनुवंशिक रूप से चालाकी से कवक के साथ काम करने के लिए नोट करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस परख डेटा की बड़ी मात्रा पैदा करने में सक्षम है और ऐंटिफंगल प्रतिक्रिया में विस्तृत जानकारी प्रकट कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक ए fumigatus के खिलाफ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

यह प्रयोगशाला आवश्यक माइक्रोस्कोपी सहित इस परख करने के लिए आवश्यक सेटअप, ध्यान दें और च प्रवाह cytometry के लिए महत्वपूर्ण हैacilities, और क्षमता मानव दाता रक्त और आनुवंशिक रूप से चालाकी से कवक के साथ काम करने के लिए। हालांकि, इस परख डेटा की बड़ी मात्रा पैदा करने में सक्षम है और ऐंटिफंगल प्रतिक्रिया में विस्तृत जानकारी प्रकट कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक ए fumigatus के खिलाफ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

Introduction

Aspergillus fumigatus एक अवसरवादी कवक रोगज़नक़ और प्रतिरक्षा में अक्षम मेजबान 1, 2 में आक्रामक फेफड़ों में संक्रमण का सबसे आम कवक कारण है। समझना कैसे मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पहचानने और एस्परजिलस को समाप्त फंगल अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है, तथापि, वर्तमान में उपलब्ध कवकनाशी assays महत्वपूर्ण सीमाओं की है। कवकनाशी गतिविधि को मापने का आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों वर्णमिति assays और कॉलोनी के गठन इकाइयों 3, 4 के निर्धारण में शामिल हैं। हालांकि, इस तरह के तरीकों से एक ही बार बिंदु पर नहीं बल्कि मेजबान और रोगज़नक़ के बीच गतिशील बातचीत को देखने की तुलना में फंगल व्यवहार्यता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। तदनुसार, इन तरीकों है कि क्या एक कवक मार दिया गया है या बस (अस्थायी) विकास या चयापचय गतिविधि में प्रतिबंधित खाते में नहीं ले सकते। हम एक विधि को देख fungici करने में सक्षम विकसित किया हैसीधे दाल गतिविधि, जबकि एक साथ phagocytosis, भक्षककोशिकीय प्रवास और कवक विकास के निषेध से संबंधित विस्तृत जानकारी पर कब्जा।

इससे पहले, एक प्रोटोकॉल एक माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन 5 से कैंडिडा एल्बीकैंस के phagocytosis को मापने के लिए एक साधन के रूप में वास्तविक समय इमेजिंग का उपयोग प्रकाशित हुआ था। इस अवधारणा को अब फ्लोरोसेंट एस्परजिलस रिपोर्टर (चमक) conidia 6, 7, 8 का उपयोग करके प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ एस्परजिलस बातचीत की हमारी समझ में ज्ञान अंतर को पाटने का आगे विकसित किया गया। ये conidia एक लाल फ्लोरोफोरे (dsRed) व्यक्त करने और एक दूसरे फ्लोरोफोरे (एलेक्सा Fluor 633) के साथ लेबल रहे हैं। एक बार एक चमक conidium मार दिया जाता है, यह dsRed उत्पादन बंद हो जाता है और शेष dsRed fades, जबकि AF633 फ्लोरोसेंट और conidia के लिए बाध्य बनी हुई है। इस लाइव और मृत फू के बीच स्पष्ट अंतर पैदा करता हैलाइव सेल इमेजिंग के दौरान ngal कोशिकाओं और प्रवाह cytometry, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत निम्न अलग-अलग conidia के भाग्य की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है।

वर्णित assays मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एस्परजिलस के बीच बातचीत के चित्रण के एक प्रभावी तरीका प्रदान करते हैं और सेलुलर संकेत दे रास्ते में सहज प्रतिरक्षक कोशिकाओं में ऐंटिफंगल प्रेरक तंत्र के लिए जिम्मेदार नहीं पायें में काफी मूल्य का होगा। अन्य अनुप्रयोगों visualizing कैसे इस तरह के सूजन conidia के लिए, या सूजन conidia से हाईफे के लिए आराम कर रहा से स्विच के रूप में एस्परजिलस विकास में परिवर्तन,, भक्षककोशिकीय मान्यता और समारोह को प्रभावित शामिल हैं।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल विस्तार मानव monocytes और neutrophils प्राप्त करने के लिए कैसे में वर्णन करता है; कैसे चमक conidia तैयार करने के लिए; और कैसे वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ अपनी प्रतिक्रिया पर कब्जा और प्रवाह cytometry के लिए। हालांकि मानव प्रतिरक्षा दाता रक्त से अलग कोशिकाओं के उपयोग यहाँ, इस वर्णन किया गया हैतकनीक murine सेल आबादी की एक किस्म का उपयोग समान रूप से प्रभावी साबित कर दी है।

Protocol

न्यूट्रोफिल और परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित तरीकों 9 पर आधारित है। स्वस्थ स्वयंसेवकों से रक्त के नमूनों के उपयोग एबरडीन विश्वविद्यालय के मानव अनुसंधान आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। इससे पहले शुरू करने के लिए सुनिश्चित करें सभी नैतिक अनुमोदन वर्णित प्रयोग के प्रयोजन के लिए स्वस्थ स्वयंसेवकों और / या रोगियों से रक्त ड्राइंग के लिए स्थान पर हैं। बर्फ जहां संभव हो अपने अस्तित्व को बढ़ाने के लिए पर कोशिकाओं रखें।

1. ए fumigatus संस्कृति और शर्तें

  1. के रूप में 10 वर्णित ग्लूकोज कम से कम अगर मध्यम तैयार करें।
    1. 20 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 6.5 1 एम NaOH का उपयोग कर और आटोक्लेव के लिए मीडिया को समायोजित करें।
    2. 65 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
    3. एक बाँझ प्रवाह हुड में काम करते हुए, एक T75 फ्लास्क में ठंडा मीडिया के 30 एमएल डालना और ग करने के लिए एक 25 एमएल पिपेट पर कुप्पी आराम की गर्दन के साथ ठंडा होने देंएक अगर ढलान reate।
  2. बाहर अगर पर dsRed Af293- ए fumigatus तनाव स्ट्रीक और 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 में 7 दिनों के लिए सेते हैं। दो बोतल 5 एमएल फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) पूर्व biotinylation में लगभग 10 9 conidia निकलेगा।

2. ए fumigatus लेबलिंग और तैयारी

ध्यान दें: जब पहली बार इस परख प्रदर्शन, माता पिता Af293- ए fumigatus तनाव तैयार करते हैं। microcentrifuge ट्यूबों में दोनों उपभेदों के नमूने ले लो और जैसा कि नीचे वर्णित केवल एक तनाव में से एक लेबल। इस सेटअप और उपकरणों का परीक्षण करने के लिए, एक कोई रंग और एक ही रंग के साथ conidia साथ नियंत्रण conidia है करने की अनुमति देगा या तो dsRed या AF633,।

  1. 30 एमएल पीबीएस 0.05% बीच -80 के साथ संस्कृति विसर्जित करके हार्वेस्ट ए fumigatus conidia। एक 50 एमएल ट्यूब में एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से जिसके परिणामस्वरूप निलंबन फ़िल्टर hyphal टुकड़े हटाने के लिए।
  2. सी10 मिनट के लिए 805 XG पर entrifuge, सतह पर तैरनेवाला हटाने और बाँझ पीबीएस के 20 एमएल में एक बार धोएं। धोने चरण के दौरान ही तनाव के दो प्लेटों से पूल conidia।
  3. कदम धोने के बाद, पीबीएस के 5 एमएल में गोली और हस्तांतरण microcentrifuge ट्यूबों में conidial निलंबन के 1 एमएल aliquots resuspend। प्रत्येक तनाव के निलंबन के 1 एमएल आमतौर पर लाइव सेल इमेजिंग के लिए पर्याप्त है। पन्नी और दुकान में शेष aliquots लपेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 9,300 XG पर और ध्यान से conidial निलंबन की अपकेंद्रित्र aliquots सतह पर तैरनेवाला हटाने। में 1 एमएल 0.05 एम 3 NaHCO पीएच 8.3 conidial गोली Resuspend।
  5. 500 μL DMSO में 25 मिलीग्राम बायोटिन पुनर्गठन से 10 मिलीग्राम बायोटिन / 200 μL dimethylsulfoxide (DMSO) स्टॉक समाधान तैयार करें। 10 μL बायोटिन / microcentrifuge ट्यूब DMSO के शेयर समाधान, कवर एल्यूमीनियम पन्नी में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    1. बायोटिन / DMSO के शेयर solutio के शेष विभाज्यn और बाद के प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर।
  6. 9,300 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने। 1 घंटे के लिए पीएच 8.0 100 मिमी Tris-एचसीएल के 1 एमएल में conidial गोली Resuspend मुक्त रूप से प्रवाहित बायोटिन निष्क्रिय करने के लिए।
  7. 9,300 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने। गोली बाँझ पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार धोएं और पीबीएस के 1 एमएल में गोली resuspend।
  8. एक 2 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाने के लिए पीबीएस के 0.5 एमएल में streptavidin-AF633 के 1 मिलीग्राम भंग। 2 मिलीग्राम / एमएल streptavidin-AF633 के 10 μL conidial निलंबन के 1 एमएल प्रति जोड़ें और एक रॉकर एल्यूमीनियम पन्नी में कवर पर कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए सेते हैं। शेष streptavidin-AF633 बाद के प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए aliquots में जमे हुए किया जा सकता है।
  9. 9,300 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने। पीबीएस के 1 एमएल में conidial गोली Resuspend और एक 1 पर conidia एक hemocytometer का उपयोग गिनती: 1,000 कमजोर पड़ने (1: 100 और उसके बाद 1:10)। Conidial एकाग्रता 3.6 x 10 6 / एमएल के लिए सीओ के साथ, 2 स्वतंत्र मीडिया समायोजित 4 डिग्री सेल्सियस पर पन्नी और दुकान में लपेट दें।
    नोट: conidia अब AF633 के साथ लेबल रहे हैं और चमक conidia के रूप में भेजा दिया जाएगा।
  10. वैकल्पिक: सूजन conidia साथ उत्तेजना की आवश्यकता है, conidia (कदम 2.9) की गिनती के बाद, conidia 7.2 x 10 6 / एमएल के लिए खमीर नाइट्रोजन बेस में (YNB) मध्यम पतला और एक autoclaved 50 में 4.5 एमएल YNB माध्यम से 500 μL conidial निलंबन जोड़ने मल एर्लेनमेयर फ्लास्क। कवर और 6 घंटे के लिए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम) में कुप्पी जगह।
    1. एक 15 एमएल ट्यूब के माध्यम स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 805 XG पर अपकेंद्रित्र और पीबीएस में एक बार धोएं। 1 एमएल कं में फिर से अपकेंद्रित्र और resuspend गोली 2 स्वतंत्र माध्यम है, 3.6 x 10 6 conidia / एमएल दे रही है।
      नोट: के बाद वे सही मुश्किल गिनती बनाने सूजन बन Conidia अक्सर पेड़ों का झुरमुट, यह ग के साथ गणना करने के लिए सलाह दी जाती हैइस्तेमाल किया conidia आराम की ounted संख्या।

3. मानव न्यूट्रोफिल और Monocytes के अलगाव

  1. दो 10 एमएल रक्त ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त ट्यूबों में स्वस्थ स्वयंसेवकों से शिरापरक रक्त के 20 एमएल ड्रा। प्रत्येक दाता के लिए, डालना एक 50 एमएल ट्यूब में 20 एमएल रक्त और 15 एमएल पीबीएस के साथ पतला।
  2. एक लिम्फोसाइट अलगाव समाधान (घनत्व 1.077 ग्राम / एमएल) एक सिरिंज और लोहे सुई के साथ की 15 एमएल के साथ खून बुनियाद। ट्यूब के नीचे सुई रखें और धीरे से लिम्फोसाइट अलगाव समाधान के लिए मजबूर। कोई ब्रेक और कम त्वरण के साथ 20 मिनट के लिए 630 XG पर अपकेंद्रित्र।
  3. पीबीएस, बर्फ पर ठंडा तैयार करें।
    नोट: 3.4 कदम और 3.5 monocytes (3.4) और neutrophils (3.5) उत्पन्न करने के लिए एक साथ पालन किया जाना चाहिए।
  4. एक pastette का प्रयोग, फसल PBMC परत। यह पीले सीरम (ऊपरी) और पारदर्शी लिम्फोसाइट अलगाव समाधान (कम) परत के बीच केंद्र में परत है, औरएक ताजा 50 एमएल ट्यूब में हस्तांतरण।
    1. 10 मिनट के लिए 582 XG पर अप ठंड पीबीएस के साथ 50 एमएल और अपकेंद्रित्र को PBMC साथ ट्यूब भरें। तैरनेवाला निकालें और शुरू में इस्तेमाल किया दाता रक्त की 20 एमएल प्रति पीबीएस के 1 एमएल में ठंड पीबीएस और resuspend के साथ दो बार धोएं।
    2. पीबीएस के 160 μL और trypan नीले रंग के 20 μL करने के लिए सेल निलंबन के 20 μL जोड़कर गिनती के लिए 1:10 dilutions बनाओ। एक hemocytometer साथ कोशिकाओं की गणना करें।
    3. गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) और HBSS के 500 एमएल 0.5 एम EDTA के 2.1 एमएल के 26 एमएल जोड़कर एक बफर समाधान तैयार करें। 1 x 10 7 कोशिकाओं प्रति बफर समाधान के 40 μL में 515 XG पर 10 मिनट और resuspend के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
    4. एक 15 एमएल ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण और 1 x 10 7 कोशिकाओं प्रति CD14 microbeads के 10 μL जोड़ने के लिए, मिश्रण अच्छी तरह से और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं, ट्यूब मिश्रण के लिए हर 5 मिनट का ध्यान रखें।
    5. 1 x 10 7 कोशिकाओं और केंद्रों प्रति बफर समाधान के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धो लें10 मिनट के लिए 515 XG पर trifuge।
    6. सतह पर तैरनेवाला Aspirate पूरी तरह से और बफर समाधान के 500 μL में 10 8 अप करने के लिए 1 x कोशिकाओं resuspend।
    7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक चुंबकीय विभाजक पर नमूना प्रति 1 स्तंभ रखें। सबसे पहले बफर समाधान के 500 μL के साथ एक बार स्तंभ धोने।
    8. स्तंभ के माध्यम से सेल निलंबन के 500 μL पिपेट, स्तंभ सुखाने के लिए के लिए प्रतीक्षा करें और फिर बफर समाधान के साथ इस तीन बार दोहराते हुए धोएं।
    9. एक नया 15 एमएल ट्यूब कॉलम के नीचे रखें और चुंबकीय विभाजक बंद स्तंभ ले। फिर बफर समाधान के 1 एमएल के साथ ट्यूब में स्तंभ से बाहर कोशिकाओं फ्लश।
    10. बफर समाधान और अपकेंद्रित्र के 4 एमएल 10 मिनट के लिए 515 XG पर जोड़ें, और उसके बाद रोजवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) माध्यम के 1 एमएल में resuspend।
    11. पीबीएस के 160 μL और trypan नीले रंग के 20 μL करने के लिए सेल निलंबन के 20 μL जोड़कर गिनती के लिए 1:10 dilutions बनाओ। एक साथ कोशिकाओं गणनाhemocytometer।
    12. 6 x 10 5 / RPMI के साथ एमएल के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें और एक 35 मिमी कांच आधारित इमेजिंग पकवान पर 200 μL बीज। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    13. अगले दिन, इमेजिंग से पहले, RPMI हटाने और सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम के 200 μL जोड़ें।
      नोट: ये monocytes भी इमेजिंग से पहले विभिन्न बृहतभक्षककोशिका सबसेट में विभेदित किया जा सकता है। यह एक तकनीक का पता लगाया जा रहा है, एक उत्कृष्ट शुरुआती बिंदु Ohradanova-Repic एट अल द्वारा हाल ही में कागज है। 1 1।
  5. PBMC परत कटाई के बाद, सीरम के सभी हटाने और लिम्फोसाइट अलगाव समाधान के सबसे, लेकिन सावधान नहीं लाल गोली इस न्यूट्रोफिल के सबसे शामिल होंगे के रूप में की चोटी पर छोटे सफेद बैंड को दूर करने के लिए किया।
    1. एनएच 4 क्लोरीन की 83 ग्राम और बाँझ पानी का 1 एल में KHCO 3 की 10 ग्राम जोड़कर एक 10x hypotonic lysis बफर स्टॉक तैयार करें। 4 डिग्री पर स्टोरसी।
    2. बाँझ पानी के साथ इस शेयर 10x पतला और ट्यूब में जोड़ें। फिर, ध्यान से 3 बार उलटने और 15 मिनट के लिए बर्फ में सेते हैं।
    3. बर्फ में 10 मिनट के लिए 10 मिनट और hypotonic lysis बफर में resuspend के लिए 394 XG पर अपकेंद्रित्र।
    4. 394 XG पर अपकेंद्रित्र और ठंड पीबीएस के साथ दो बार धोएं। दाता प्रति सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम के 1 एमएल में Resuspend।
    5. पीबीएस के 160 μL और trypan नीले रंग के 20 μL करने के लिए सेल निलंबन के 20 μL जोड़कर गिनती के लिए 1:10 dilutions बनाओ। एक hemocytometer साथ कोशिकाओं की गणना करें।
    6. फ्लो के लिए, 6 x 10 5 / एमएल के लिए एकाग्रता को समायोजित और एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 400 μL सेल निलंबन जोड़ें। माइक्रोस्कोपी के लिए, एक 35 मिमी कांच आधारित इमेजिंग पकवान को एक ही सेल निलंबन के 200 μL जोड़ें।
      नोट: न्युट्रोफिल इमेजिंग या उनके प्रवृत्ति की वजह से प्रवाह cytometry तुरंत शुरू किया जाना चाहिए apoptosis गुजरना करने के लिए करता है, तो unstimulated छोड़ दिया है। यदि यह नहीं है संभव न्यूट्रोफिल पर रखा जाना चाहिएबर्फ और (एक ही दिन के अंदर) जल्द से जल्द किया करते थे।

4. फ्लो

  1. 1.2 x 10 6 / एमएल चमक conidia के 200 μL 24-अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को जोड़ें, और फिर 20 माइक्रोग्राम / एमएल voriconazole के 100 μL जोड़ें। RPMI के 300 μL जोड़ें और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए सेते हैं।
    नोट: voriconazole conidial अंकुरण को रोकने के लिए जोड़ा गया है।
  2. 25 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक 1 मिमी Calcofluor सफेद स्टॉक समाधान के 25 μL जोड़ें और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. 10 मिनट के लिए 582 XG पर अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  4. पक्षपाती कोशिकाओं (monocytes) फसल के लिए, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 3 मिमी EDTA के साथ पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। धीरे एक ट्यूब में pipetting द्वारा प्लेटों में कोशिकाओं धोने और कोशिकाओं को इकट्ठा।
  5. (2% भ्रूण बछड़ा पंजाब के सीरम FACS बफर में एक बार धोएंएस), और फिर FACS विश्लेषण के लिए FACS बफर में resuspend।
    1. FACS विश्लेषण के लिए, पहली प्रवाह की मुआवजा मापदंडों कोशिकामापी समायोजित करने और कोई रंग के साथ conidia सहित एकल रंग का मुआवजा ट्यूबों का प्रयोग सकारात्मक द्वार, सेट करें: dsRed + conidia, AF633 + conidia, और Calcofluor व्हाइट + conidia (4.2 में के रूप में उत्पन्न किया था)।
    2. सेट मुक्त conidia गेट आगे के आधार पर और पक्ष बिखराव कोई रंग के साथ conidia का उपयोग कर। मुक्त conidia गेट को बाहर निकालकर आगे और पक्ष बिखराव पर सेल गेट सेट करें।
    3. 10,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करके नमूना ट्यूब का विश्लेषण करें।
      नोट: लाइव conidia के साथ जुड़े कोशिकाओं DsRed + और AF633 + कर दिया जाएगा। मृत conidia के साथ जुड़े कोशिकाओं AF633 + केवल हो जाएगा। दर्शक कोशिकाओं है कि conidia लगे हुए नहीं किया है dsRed- और AF633- हो जाएगा। conidia-लगे हुए सेल आबादी आगे प्रशांत ब्लू चैनल पर Calcofluor सफेद धुंधला के लिए विश्लेषण किया जाता है। Conidia कि कोशिकाओं के बाहर रहने के लिए किया जाएगा Calcofluor व्हाइट +, और conidia कि भली भाँति किया गया है हो जाएगाCalcofluor सफेद।

5. लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी

नोट: माइक्रोस्कोप की पसंद क्या उपलब्ध है स्थानीय स्तर पर पर निर्भर करेगा, लेकिन माइक्रोस्कोप सेटअप उलटे मंच, एक पर्यावरण कक्ष dsRed (532/561 एनएम) और AF633 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और उचित उत्तेजना / उत्सर्जन फिल्टर के लिए गर्म में शामिल करने की आवश्यकता होगी (633 एनएम)। चमक conidia dsRed के लिए 532/561 एनएम लेजर के एवज में 488 एनएम लेजर के साथ काम नहीं करते। जब यह पहली बार इस प्रयोग का प्रदर्शन, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए परीक्षण और खून के माध्यम से dsRed और AF633 चैनलों के बीच करने के लिए कोई रंग और ही रंग के साथ नियंत्रण conidia का उपयोग करें।

  1. माइक्रोस्कोप हीटर प्रयोग करने से पहले चालू करें और पर्यावरण नियंत्रण कक्ष 37 डिग्री सेल्सियस को गर्म करने के लिए के लिए पर्याप्त समय की अनुमति है। समय स्थिर करने के लिए कक्ष के तापमान के लिए ले जाया अलग खुर्दबीन सेटअप के लिए अलग अलग होंगे।
  2. माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर, और लो चालू करेंविज्ञापन इमेजिंग सॉफ्टवेयर। खुर्दबीन मंच पर इमेजिंग पकवान माउंट और मानव न्यूट्रोफिल या monocytes खोजने के लिए ध्यान केंद्रित करने को समायोजित करें।
  3. dsRed और AF633 के लिए, अधिग्रहण सेटिंग्स में 1 एस के लिए 10% और जोखिम समय के लिए लेजर शक्ति निर्धारित किया है।
  4. इमेजिंग स्लाइड निकालें और के 100 μL जोड़ने 3 x 10 6 / एमएल चमक उचित कुओं conidial निलंबन (कुल मात्रा 300 μL / अच्छी तरह से)। समय है कि भड़क conidia पकवान के लिए जोड़ रहे रिकार्ड।
  5. चरण के लिए स्लाइड लौटें और dsRed और AF633 के लिए कैमरा संवेदनशीलता को समायोजित स्पष्ट रूप से देखने के लिए conidia लेकिन छवि overexpose नहीं। एक मंच अंक सूची सेट अप करता है, तो बहु-बिंदु अधिग्रहण की आवश्यकता है।
  6. जब सभी बिंदुओं को ध्यान में कर रहे हैं, चैनलों अनुकूलित कर रहे हैं और समय चक्र और अवधि निर्धारित है इमेजिंग शुरू। समय चक्र और इमेजिंग की अवधि प्रयोगात्मक प्रश्न पर निर्भर हैं। लक्ष्य 1 मिनट upt का गहराई से विश्लेषण में के लिए अनुमति के साथ (≤2 मिनट) के रूप में कम संभव समय चक्र रखना हैशॉट लें गतिशीलता।

Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम वर्णित प्रोटोकॉल निम्नलिखित दिखाए जाते हैं। चित्रा 1 मानव न्यूट्रोफिल और चमक conidia साथ एक प्रतिनिधि 6 घंटे लाइव सेल वीडियो दिखाता है। dsRed (लाल) conidia खुद को द्वारा व्यक्त की, जबकि वे AF633 (मैजेंटा) के साथ लेबल किया गया है है।

चित्र 2 के रूप में चित्रा 1 में दिखाया गया है, लाइव और मृत चमक conidia के बीच अंतर को दर्शाता हुआ एक समान फिल्म से एक ही समय बिंदु से एक छवि है। मृत conidia उनके dsRed (लाल) संकेत खोने जबकि एक उज्ज्वल AF633 (मैजंटा) प्रतिदीप्ति बनाए रखने के द्वारा लाइव conidia से प्रतिष्ठित किया जाता है। ए fumigatus conidia अक्सर 6 घंटे के लिए फ़ैगोसाइट भीतर जीवित रहते हैं। इसलिए, प्रभावी ढंग से मौत हो गई अंदाजा लगाना, प्रवाह cytometry भूखंडों 3 चित्र में एक 16 घंटे ऊष्मायन अवधि के लिए दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा एक वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका ce साथ प्राप्त हुई थीलेकिन एक उदाहरण के रूप ll लाइन किसी भी प्रकार की कोशिका के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है। चित्रा 4 में प्रवास मानव न्यूट्रोफिल के लिए उत्तेजना के साथ ही उनके वेग और दिशात्मक आंदोलन के पहले घंटे में दिखाया गया है। चित्रा 5 न्यूट्रोफिल और monocytes कि 1, 2, 3 या उससे अधिक conidia किया जाता है चित्रा 6 कि हाईफे में उगना conidia की संख्या प्रदर्शित करता है, जबकि का प्रतिशत दिखाता है।

आकृति 1
चित्रा 1: लाइव सेल मानव न्यूट्रोफिल और चमक conidia की वीडियो माइक्रोस्कोपी फिल्म। न्यूट्रोफिल मानव रक्त से अलग और 1 के अनुपात में सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम में चमक conidia साथ एक साथ वरीयता प्राप्त गया: क्रमश: 3,। इमेजिंग एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सीधे शुरू किया गया था। छवियाँ 6 घंटे की अवधि में 1 मिनट और 55 रों अंतराल पर कब्जा कर लिया गया। स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी =।वीडियो में ज़ूम इन किया एक चैनल ऊपर बाईं ओर स्थित डीआईसी के साथ चमक conidia की भूमिका स्पष्ट करने के लिए अलग से दिखाया गया है, ऊपरी दाएँ भाग में dsRed (लाल), AF633 तल में (हरा) को छोड़ दिया और नीचे दाईं ओर मर्ज किए गए वीडियो । इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: एकल समय बिंदु छवि को लाइव और मृत चमक conidia के बीच अंतर का प्रदर्शन है। मानव न्यूट्रोफिल चमक conidia साथ प्रेरित और एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ imaged किया गया। एक छवि उत्पन्न फिल्मों से लिया गया था। संकेत करते हुए उनके AF633 प्रतिदीप्ति (: निचले-बाएं हरा) को बनाए रखने: मरे conidia उनके dsRed (ऊपरी दाएं लाल) खो रही द्वारा हाईफे से प्रतिष्ठित किया जाता है। कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने।

चित्र तीन
चित्र 3: मात्रा और phagocytosis और ए fumigatus conidia की हत्या के सत्यापन। voriconazole की उपस्थिति में 16 घंटे के लिए 1 अनुपात: माउस वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं (MH-एस) एक 1 पर चमक conidia साथ इनक्यूबेट रहे थे। MH-एस को लाइव conidia के साथ जुड़े कोशिकाओं लाल फाटक (dsRed + AF633 +) में दिखाया जाता है। MH-एस मृत conidia के साथ जुड़े कोशिकाओं नीले गेट (dsRed-AF633 +) में दिखाया जाता है। दर्शक MH-एस कोशिकाओं सोने गेट में दिखाया जाता है। Calcofluor सफेद, एक सेल अभेद्य फ्लोरोसेंट डाई कि कवक सेल दीवार को बांधता है, बाह्य conidia intracellular conidia से (Calcofluor व्हाइट +) (Calcofluor सफेद) भेद करने के लिए प्रयोग किया जाता है। विधि के लिए एक अतिरिक्त सत्यापन रूप में, यह 2 माइक्रोन cytochalasin डी के साथ कि इलाज MH-एस कोशिकाओं द्वारा conidial तेज रोकता दिखाया गया है।e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: मानव न्यूट्रोफिल और ए fumigatus conidia के खिलाफ monocytes के प्रवासन। न्यूट्रोफिल मानव रक्त से अलग और 1 के अनुपात में सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम में चमक conidia साथ एक साथ वरीयता प्राप्त गया: क्रमश: 3,। इमेजिंग एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सीधे शुरू किया गया था। छवियाँ 6 घंटे की अवधि में 1 मिनट और 55 रों अंतराल पर कब्जा कर लिया गया। क्षेत्र के अनुसार सभी व्यक्तिगत मानव न्यूट्रोफिल के प्रवासन मैन्युअल 1 घंटे के लिए (ए) और सूजन (बी) conidia आराम के खिलाफ ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करके ट्रैक किया गया था। डाटा एक ही दाता से प्रत्येक हालत के लिए कोशिकाओं की 1 फ्रेम प्रतिनिधित्व करता है। घुमावदार कारक (सी), directio का एक उपायएनएएल आंदोलन, और वेग (डी) तो थे ही सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित। ± SEM मतलब 3 दाताओं के लिए 2 स्वतंत्र प्रयोगों से अधिक दाता प्रति 30 कोशिकाओं के साथ दिखाए जाते हैं। *: P <0.05 (वेल्श की सुधारा टी परीक्षण)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: मानव न्यूट्रोफिल और monocytes द्वारा ए fumigatus conidia के phagocytosis। , 3 क्रमश: न्यूट्रोफिल और monocytes मानव रक्त से अलग और सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम में चमक conidia साथ एक साथ वरीयता प्राप्त 1 के अनुपात में किया गया। इमेजिंग एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सीधे शुरू किया गया था। छवियाँ 6 घंटे की अवधि में 1 मिनट और 55 रों अंतराल पर कब्जा कर लिया गया। Phagocytosis कोशिकाओं होते हैं की राशि के रूप में मापा गया थाउत्तेजना के 4 घंटे के बाद चमक conidia ing। डाटा 3 दाताओं और 2 स्वतंत्र प्रयोगों से अधिक दाता प्रति 3 फ्रेम से SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 6: न्यूट्रोफिल और monocytes द्वारा ए fumigatus conidia के अंकुरण का निषेध। , 3 क्रमश: न्यूट्रोफिल और monocytes मानव रक्त से अलग और सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम में चमक conidia साथ एक साथ वरीयता प्राप्त 1 के अनुपात में किया गया। इमेजिंग एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सीधे शुरू किया गया था। छवियाँ 6 घंटे की अवधि में 1 मिनट और 55 रों अंतराल पर कब्जा कर लिया गया। फंगल अंकुरण के निषेध कि रोगाणु था conidia के प्रतिशत को मापने के द्वारा जांच की गईके बाद सह संस्कृति के 2, 4 और 6 ज inated। डाटा 3 दाताओं और 2 स्वतंत्र प्रयोगों से अधिक दाता प्रति 3 फ्रेम से SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस विधि फ्लोरोसेंट एस्परजिलस रिपोर्टर (चमक) conidia, लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग ए fumigatus के खिलाफ मानव प्राथमिक फ़ैगोसाइट की ऐंटिफंगल गतिविधि का अध्ययन करने और प्रवाह cytometry के लिए इन विट्रो विधि में एक अभिनव वर्णन करता है। पिछले अध्ययनों से दोनों murine प्रयोगात्मक फंगल संक्रमण में विवो में और ऐंटिफंगल प्रतिरक्षा 6, 7 की इन विट्रो मूल्यांकन में चमक conidia का उपयोग करने का भी अतिरिक्त मूल्य का प्रदर्शन किया है। इस अगली पीढ़ी को लाइव सेल इमेजिंग तकनीक के साथ चमक conidia के संयोजन इन विट्रो में गतिशील बातचीत के दौरान अलग-अलग conidia की व्यवहार्यता को मापने के लिए एक सेटअप के लिए अनुमति देता है।

वर्णित विधि संभावित उनके ऐंटिफंगल प्रतिक्रियाओं पर विशिष्ट भूमिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कुछ कोशिकीय प्रक्रियाओं के महत्व की जांच के लिए है। इसके अलावा, से पीड़ित विशिष्ट रोगियों से फ़ैगोसाइट की ऐंटिफंगल प्रतिक्रियाएंउनकी प्रतिरक्षा प्रणाली में परिभाषित एकल घटक दोष अधिक विस्तार में मूल्यांकन किया जा सकता। बहुत जल्दी और प्रारंभिक ऐंटिफंगल प्रतिक्रियाओं निरंतर इमेजिंग के 6 घंटे से अधिक महान विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है। , Internalization दरों, कवकनाशी घटनाओं 12 है, जो पारंपरिक phagocytosis तरीकों का उपयोग कर समाधान के अयोग्य हो जाएगा की गतिशीलता इस तरह के कवक की ओर भक्षककोशिकीय प्रवास के वेग के रूप में, यहां तक कि सूक्ष्म अंतर का पता लगाया जा करने के लिए अनुमति देता है।

किसी भी प्रकार की कोशिका इस विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है; क्योंकि इन फ़ैगोसाइट ए fumigatus 13 के खिलाफ मानव वायुमार्ग में रक्षा की पहली और दूसरी लाइनों का गठन सेल यहां इस्तेमाल किया प्रकार चयन किया गया था। दिलचस्प बात यह है बहुत स्पष्ट मतभेद कैसे monocytes और न्यूट्रोफिल आराम और सूजन conidia और हाईफे के साथ संलग्न के बीच मनाया जा सकता है। Monocytes शायद ही जबकि न्यूट्रोफिल और अधिक प्रवासी गतिविधि प्रदर्शित, conidia के लिए चले जाते हैं। अतिरिक्त फ्लोरोसेंट मार्चइस तरह के प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर लाइव मृत मार्कर के रूप में kers भक्षककोशिकीय अस्तित्व एस्परजिलस के साथ बातचीत निम्नलिखित में अंतर्दृष्टि प्रदान करने परख में शामिल किया जा सकता है। इस तकनीक के लिए दिलचस्प संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों विभिन्न प्रकार मेजबान सेल के सह संस्कृति, ऐंटिफंगल प्रतिक्रिया के लिए परिणाम शामिल हैं (उदाहरण के लिए, एक उपकला monolayer, monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान न्यूट्रोफिल के साथ एक साथ कोशिकाओं पर मैक्रोफेज), और प्रतिक्रियाशील के वास्तविक समय माप ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन या न्युट्रोफिल कोशिकी जाल गठन एस्परजिलस साथ उत्तेजना के बाद।

एक औंधा चरण के साथ एक खुर्दबीन, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पर्यावरण कक्ष स्थिर, और उत्तेजना / dsRed (532/561 एनएम) और AF633 (के लिए उत्सर्जन फिल्टर: कुछ अंक इस प्रोटोकॉल, सबसे महत्वपूर्ण प्रयोगशाला आवश्यक सेटअप का उपयोग करने पर ध्यान दिया जाना करने की जरूरत है 633 एनएम)। माइक्रोस्कोप की क्षमता मीटर के दौरान विशेष रूप से प्रासंगिक ध्यान में कोशिकाओं रखने के लिए और तेल विसर्जन बनाए रखने के लिए (ulti सूत्री अधिग्रहण) इमेजिंग की लंबी अवधि के कारण समय-समय पर निगरानी की जानी चाहिए। कवकनाशी गतिविधि की मात्रा के लिए प्रवाह cytometry सुविधाओं की आवश्यकता है। साथ ही, उचित संस्थागत और नैतिक अनुमोदन जगह स्वस्थ दाता और रोगी व्युत्पन्न रक्त के नमूनों और आनुवंशिक रूप से चालाकी से कवक के साथ काम करने में होने की जरूरत है। यह दृढ़ता से ताजा रक्त के नमूने (एक ही दिन में उपयोग) का उपयोग करने के लिए सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए और कार्यक्षमता संरक्षित करने के लिए सिफारिश की है। आदर्श रूप में, कोशिकाओं के अलगाव रक्त के नमूने ड्राइंग के तुरंत बाद किया जाता है और neutrophils अलगाव के बाद तुरंत imaged कर रहे हैं।

अंत में, एक अगली पीढ़ी को लाइव सेल इमेजिंग तकनीक काफी विस्तार भक्षककोशिकीय ऐंटिफंगल गतिविधि में आकलन करने के लिए के खिलाफ ए fumigatus वर्णन किया गया है। यह तकनीक एस्परजिलस के खिलाफ जल्दी सहज प्रतिरक्षा गढ़ में अलग-अलग सेल कवक बातचीत में एक अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

मेडिकल माइकोलॉजी फफूंद इम्यूनोलॉजी (SFB, जेएमबी, जे, ऐडवर्ड्स) - यह काम एमआरसी और एबरडीन विश्वविद्यालय (मेडिकल माइकोलॉजी के लिए एमआरसी केंद्र) द्वारा और वेलकम ट्रस्ट सामरिक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया है। एक विशेष धन्यवाद क्लो निधि से समर्थन करने के लिए दिया जाता है। टीएमएच स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (एनआईएच, कोड RO1 093,808) और मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर से अनुदान एनआईएच अनुदान P30 CA008748 द्वारा समर्थित है द्वारा समर्थित है। साथ ही, टीएमएच संक्रामक रोग के रोगजनन बरोज़ वेलकम फंड द्वारा समर्थित में एक अन्वेषक है। हम उनकी मदद और समर्थन के लिए एबरडीन माइक्रोस्कोपी और प्रोटोकॉल सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma G6279 http://www.sigmaaldrich.com
T75 flask Greiner Bio-One 658 175 http://www.greinerbioone.com/
PBS Gibco 20012-019 https://www.thermofisher.com/
Tween-80 Fisher Scientific 10592955 https://nl.fishersci.com/
40 µm filter Thermo Fisher Scientific 22363547 https://www.thermofisher.com/
15 mL Falcon tube Greiner Bio-One 188 261 http://www.greinerbioone.com/
50 mL Falcon tube Greiner Bio-One 227 261 http://www.greinerbioone.com/
MilliQ Millipore QGARD00R1 Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/
Biotin Molecular Probes B-6352 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
DMSO Sigma D5879 http://www.sigmaaldrich.com
Streptavidin-AF633 Molecular Probes  S-21375 AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
EDTA blood tubes Greiner Bio-One 455036 Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03 http://www3.gehealthcare.com/
Trypan blue Thermo Fisher Scientific SV3008401 https://www.thermofisher.com/
HBSS Gibco 14170112  https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
CD14 microbeads Myltenyi Biotec 130-050-201 Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/
MS Columns Myltenyi Biotec 130-042-201 See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/
RPMI + Glutamax Gibco 72400-021 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
CO2 independent medium Thermo Fisher Scientific 18045054 Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home
µ-slide 8 well glass bottom Ibidi 80827 This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/
UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System Perkin Elmer L7267000 Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/
Calcofluor white Sigma 18909 http://www.sigmaaldrich.com/
Voriconazole Sigma PZ0005 http://www.sigmaaldrich.com/
BD LSRII BD Biosciences Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 122, लाइव सेल इमेजिंग ऐंटिफंगल गतिविधि और ग्रेनेड मानव ल्यूकोसाइट मेजबान रोगज़नक़ बातचीत।
के जवाब में मानव प्राथमिक न्यूट्रोफिल और Monocytes द्वारा रोधी गतिविधि का लाइव इमेजिंग<em&gt; एक। fumigatus</em
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Brunel, S. F., Bain, J. M., King,… More

Brunel, S. F., Bain, J. M., King, J., Heung, L. J., Kasahara, S., Hohl, T. M., Warris, A. Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus. J. Vis. Exp. (122), e55444, doi:10.3791/55444 (2017).

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